真菌毒素是真菌在农作物或其他食物源上产生的有毒次级代谢产物[1]，会污染食物和饲料产品，对人类和动物健康构成重大威胁[2]。玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）是一种非甾体类雌激素型真菌毒素，常见于玉米、小麦、大麦和高粱等作物及其制品中[3]，是不易被烹饪或加工破坏的热稳定化合物，易在谷物、肉类、牛奶和鸡蛋等食品中积累[4]。ZEN 还会在水体和土壤中积累，污染生态环境[5]，引起动物和人类的健康问题[6]。它是食品安全和人类健康的主要关注点，应建立科学有效、方便快捷的检测方法密切监测其在食品和饲料产品中的存在[7-11]。
ZEN 的检测方法主要有液相色谱法[12]、荧光光度法[13]、液相色谱-质谱[14]等传统方法，这些方法存在检测步骤复杂、成本高、无法实现现场检测等缺点[15-17]，因此，有必要开发一种简单、快速、低成本的新技术，以便在食品和粮食生产的不同阶段有效检测ZEN 水平，保障被ZEN 污染的粮食进入人或动物体内之前被识别。
本研究选用分子模拟技术筛选的特异性多肽为识别原件，基于荧光共振能量转移原理与免疫测定技术，设计多肽-荧光探针实现对玉米、大豆和小麦等谷物和食品中ZEN 的快捷、精准检测方法，以期为食品中其他有毒有害物质的检测提供新思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
玉米赤霉烯酮的多肽序列：ESRFDNIVTATKAGVNIGFLPGMHFPYVSHPDC（纯度98%）：上海波泰生物科技有限公司；异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）（纯度90%）：上海麦克林生化科技有限公司；CdSe/ZnS 量子点：苏州星烁纳米科技有限公司；ZEN、赭曲霉毒素A（纯度≥98.00%）、玉米赤霉酮（纯度≥98.00%）、黄曲霉毒素B1（纯度≥98.00%）：美国Sigma 公司；酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒：青岛普瑞邦生物工程有限公司；甲醇、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、乙醇、氯化钠、十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、硼酸、四硼酸钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；玉米、小麦、大豆、黑麦、燕麦：市售。
1.2 仪器与设备
分析天平（MS105DU）：美国METTTLER TOLEDO公司；超声波清洗器（RH-KT/C）：昆山舒美超声仪器有限公司；磁力搅拌器（MTN-2800D）：广州仪科生物技术有限公司；小型数控摇床（HYN-933B）：天津欧诺仪器仪表有限公司；台式高速冷冻离心机（Centrifμge 5810 R）、离心机（Centrifuge 5804R）、微量可调移液器：德国Eppendorf 公司；涡旋混合器（LP Vortex Mixer）、酶标仪（Varioskan LUX）、荧光分光光度计（Lumina）：美国Thermo 公司；超纯水机（Milli-Q）：美国Millipore 公司。
1.3 方法
1.3.1 基于分子对接设计玉米赤霉烯酮多肽
在蛋白质数据库（http：//www.rcsb.org/）中搜索ZEN，得到带有其配体的蛋白（PDB ID：“3WZM”，“6JR9”，“6JQZ”，“5XO8”，“5Z97”，“5KRC”），综合XRAY、R-Value Free 和年份，最终选择“6JR9”进行分子对接。
将蛋白质导入Discovery Studio 软件中，去除多余水分子和配体，设置参数，为该蛋白施加力场，添加结合位点。ZEN 配体从小分子配体库ChemSpider（http：//www.chemspider.com）中下载并导入软件，进行能量最小化、小分子准备、施加力场等操作，选择CDOCKER，设置构象集群半径为0.5，进行分子对接。对接完成后对蛋白质分子添加表面处理，观察ZEN 有活性的空腔结构，结合空间结构和影响受配体相互作用的关键氨基酸设计新的多肽。
1.3.2 虚拟氨基酸突变优化多肽
为增强多肽稳定性和亲和力，通过虚拟氨基酸突变来进一步优化多肽，设计得到的每一条多肽均进行虚拟氨基酸突变。将所选择的蛋白-配体复合物导入，选择范围内氨基酸进行丙氨酸扫描，突变为丙氨酸后亲和力降低的氨基酸为关键氨基酸。将这些氨基酸继续进行饱和突变确定关键氨基酸最佳突变类型。
1.3.3 基于荧光共振能量转移异硫氰酸-特异性多肽检测玉米赤霉烯酮方法建立
1.3.3.1 荧光检测方法
基于荧光共振能量转移的原理设计荧光检测方法，如图1 所示。
图1 荧光检测方法试验原理
Fig.1 Principle of fluorescence detection method
由图1 可知，异硫氰酸荧光素标记的特异性多肽荧光探针作为能量供体，氧化石墨烯（graphene oxide，GO）作为能量受体荧光淬灭剂，构建能量共振转移体系，体系中荧光探针与目标物结合，产生了明显的荧光信号，表明该试验可以定量检测ZEN。
1.3.3.2 异硫氰酸-特异性多肽荧光探针制备
异硫氰酸荧光素标记特异性多肽探针的制备主要依据异硫氰酸的碳酰胺键可以与多肽中的氨基反应形成共价键，产生异硫氰酸-多肽稳定的共价化合物。
1）取1.5 mL 棕色离心管添加10 μL 1 mg/mL 的多肽溶液和900 μL 磷酸缓冲盐（phosphate buffered saline，PBS）溶液。
2）称取3.894 g FITC 固体粉末溶于10 mL DMSO中配制成1 mol/L 的FITC 溶液，用PBS 溶液10 倍稀释至0.1 mol/L，取10 μL 缓慢滴加到多肽溶液中。混合液室温避光振荡孵育24 h。
3）将反应产物转移至1 000 Da 透析袋，在4 ℃避光环境用PBS 缓冲液透析48 h，每8 h 换1 次透析液直至透析液透亮且没有黄绿色荧光。
1.3.3.3 异硫氰酸-特异性多肽荧光探针制备表征
为确认探针是否成功合成，取异硫氰酸荧光素溶液和相同浓度的添加特异性多肽发生偶联反应的荧光探针溶液，使用荧光分光光度计在相同激发波长下测量两个组分的荧光信号值。
1.3.3.4 检测方法条件优化
探针的品质对于方法的建立至关重要，因此针对异硫氰酸标记多肽用量优化考察；GO 浓度是方法建立的主要依据，为体现出试验组和对照组最大的荧光差值使检测方法有更好的灵敏度和检测范围，试验优化了猝灭剂GO 的添加浓度；此外，对GO 淬灭时间和ZEN 孵育时间等条件也进行优化。
1.3.4 基于荧光共振能量转移量子点-特异性多肽检测玉米赤霉烯酮方法建立
1.3.4.1 荧光检测方法
以高量子产率、高抗光漂白的量子点为标记物标记特异性多肽构建荧光探针作为能量供体和识别元件，继续以氧化石墨烯作为能量受体荧光淬灭剂构建荧光共振能量转移配对体系。
1.3.4.2 量子点-特异性多肽荧光探针制备
1）用硼酸盐缓冲液（pH5.0）稀释羧基化量子点，取1.5 mL 离心管加入硼酸盐缓冲液（pH5.0）稀释的羧基化量子点，向量子点溶液中添加硼酸盐缓冲液（pH5.0）溶解的1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐[1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide，EDC]溶液置于涡旋混匀器25 ℃避光反应30 min 活化量子点羧基。
2）向活化过的量子点中添加10 μL 特异性多肽继续25 ℃避光反应24 h，将量子点的羧基与特异性多肽的氨基进行偶联。
3）将反应产物用PBS 缓冲液（pH7.4）用超滤离心管（1 kDa）6 000 r/min 离心15 min 超滤3 次，除去过量多肽，结束后将量子点-特异性多肽重新悬浮于PBS 缓冲液（pH7.4）中置于4 ℃避光保存备用。
1.3.4.3 量子点-特异性多肽荧光探针表征
为了鉴定探针成功合成，使用荧光分光光度计分别测量量子点和量子点-特异性多肽溶液体系在480 nm激发波长下的荧光强度值。
1.3.4.4 检测方法条件优化为保障良好的试验结果，该部分分别对GO 淬灭浓度、淬灭时间、ZEN 孵育时间进行优化。
1.4 数据处理
试验数据采用Origin 2019 软件作图，结果表示为平均值±标准差。
2 结果与分析
2.1 特异性多肽的确定
基于DS 软件的分子对接结果见图2。
图2 多肽与ZEN 的结合图
Fig.2 Binding of peptide to zearalenone
范德华力（van der waals）；常规氢键（conventional hydrogen bond）；碳氢键（carbon hydrogen bond）；给体氢键（pi-donor hydrogen bond）；烷基（alkyl）；含有pi 键的烷基（pi-a1kyl）。A.多肽结合ZEN 的作用位点三维构象；B.多肽和ZEN 作用的主要氨基酸和主要相互作用力。
由图2 可知，对接结果显示与ZEN 结合的氨基酸序列相对集中，主要作用力包含范德华力、传统氢键和碳氢键等相互作用较强和相对稳定的非共价键，这对多肽和ZEN 的稳定结合有着很重要的影响和作用，便于进行后续分子模拟等操作。
最终ZEN 特异性多肽经过分子对接、氨基酸突变和分子动力学模拟等过程逐步筛选优化，得到特异性结合ZEN 的多肽链，序列为ESRFDNIVTATKAGVNIGFLPGMHFPYVSHPDC，与ZEN 相互作用能为-52.94 kcal/mol。
2.2 基于荧光共振能量转移异硫氰酸-特异性多肽检测玉米赤霉烯酮方法建立试验结果
2.2.1 异硫氰酸-特异性多肽荧光探针制备表征结果
相同浓度下FITC 标准溶液和FITC-多肽溶液荧光强度见图3。
图3 相同浓度下FITC 标准溶液和FITC-多肽溶液荧光强度
Fig.3 Fluorescence intensity of FITC standard solution and FITCpeptide solution with the same concentration
由图3 可知，异硫氰酸和特异性多肽发生碳酰胺键和氨基结合反应，异硫氰酸荧光基团结构发生改变，导致相同浓度的异硫氰酸-特异性多肽荧光探针溶液荧光强度低于异硫氰酸纯品溶液的荧光强度。由此判断探针合成成功。
2.2.2 试验方法优化结果
试验条件优化结果见图4。
图4 试验条件优化
Fig.4 Optimization of reaction conditions
a.异硫氰酸标记多肽用量优化结果；b.氧化石墨烯淬灭浓度优化结果；c.氧化石墨烯淬灭时间优化结果；d.ZEN 孵育时间优化结果。
2.2.2.1 异硫氰酸标记多肽用量优化结果
为避免过量游离异硫氰酸对荧光信号产生影响，试验优化了异硫氰酸标记多肽的用量，由图4a 可知，向多肽溶液中缓慢滴加不同浓度的异硫氰酸，避光振荡反应24 h 后用PBS 溶液避光透析48 h 直至透析液无黄绿色荧光。将反应产物稀释相同倍数后用荧光分光光度计测量荧光强度，当多肽和异硫氰酸摩尔比为1∶15 时荧光探针的荧光强度最强，因此，选用多肽和异硫氰酸1∶15 为最佳偶联标记摩尔比。
2.2.2.2 氧化石墨烯淬灭浓度优化结果
GO 对荧光有很强的淬灭能力，试验根据不同浓度GO 淬灭荧光后荧光差值大小来选取最优浓度，由图4b 可知，当浓度为200 μg/mL 时体系荧光差值达到最大，因此，选用200 μg/mL 为GO 的淬灭浓度。
2.2.2.3 氧化石墨烯猝灭时间优化结果
在最佳猝灭浓度下，探究GO 淬灭时间对体系荧光差值的影响，由图4c 可知，当淬灭时间为10 min 时体系荧光差值达到最大，因此，选用10 min 为GO 淬灭时间。
2.2.2.4 玉米赤霉烯酮孵育时间优化结果
ZEN 和异硫氰酸-特异性多肽探针结合时间影响探针识别的灵敏度和准确度，试验探究了不同孵育时间与异硫氰酸-特异性多肽和ZEN 结合对体系荧光信号值的影响，由图4d 可知，当孵育时间到30 min 后体系的荧光强度趋于稳定，因此，选取30 min 为ZEN 和探针最佳孵育时间。
2.2.3 异硫氰酸-特异性多肽检测玉米赤霉烯酮方法标准曲线建立
在最佳试验条件下，用荧光分光光度计测量添加不同浓度ZEN 标准溶液的试验组溶液体系荧光强度，计算与对照组溶液体系的荧光差值，探究ZEN 浓度（C，mg/L）与荧光差值的线性关系，结果如图5 所示。
图5 检测方法标准曲线
Fig.5 Standard curve of the detection method
由图5 可知，随着ZEN 添加浓度的增加体系的荧光差值也逐渐增大，ZEN 添加量的增加使更多的探针与之结合，与对照组对比，氧化石墨烯相应能够淬灭的探针量逐渐减少，荧光强度得到保留，荧光差值逐渐增大。
该检测方法下，ZEN 浓度在0.1～40 μg/L 范围内与体系的荧光差值有着良好的线性关系，其线性拟合方程为y=766.8x +1 426，相关系数R²=0.990 7，将3 倍标准差代入线性方程，计算得到方法检出限（S/N=3）为0.04 μg/L。
2.2.4 异硫氰酸-特异性多肽检测玉米赤霉烯酮方法性能评价
方法性能评价结果见图6。
图6 检测玉米赤霉烯酮方法性能评价
Fig.6 Performance of the established method for detecting zearalenone
a.检测方法特异性评价；b.检测方法稳定性评价。
2.2.4.1 方法特异性评价
为了验证构建的方法对ZEN 检测的特异性，试验选取了3 种真菌毒素对方法进行评估，由图6a 可知，荧光信号差值只在ZEN 存在时有所体现，由此说明该方法对ZEN 有良好的特异性。
2.2.4.2 方法稳定性评价
试验评估该方法的稳定性，将探针避光保存，连续8 d 用分装探针重复试验方法，测量体系荧光差值随时间延长的变化。由图6b 可知，体系荧光差值在1～5 d内基本稳定，因此，该方法稳定时间为5 d。
2.2.4.3 实际样品应用评价
为了评估检测方法在实际样品检测中的应用能力，试验选取了真菌毒素易存在的玉米、大豆等实际样品进行添加回收试验，结果如表1 所示。
表1 本试验方法与商业试剂盒对实际样品中ZEN 的检测结果对比
Table 1 Detection results of zearalenone in actual samples by the established method and commercial reagent kits
注：-表示未检出。
样品名称添加浓度/（μg/kg） 回收率/%-81.9 89.8 84.2-89.2 90.6 95.8-102.4 102.0 102.4-95.2 94.2 86.9-95.3 84.7 95.0玉米0小麦大豆黑麦燕麦0.2 1.0 10.0 0 0.2 1.0 10.0 0 0.2 1.0 10.0 0 0.2 1.0 10.0 0 0.2 1.0 10.0异硫氰酸-特异性多肽荧光检测方法检测浓度/（μg/kg）-0.17±0.01 0.92±0.06 9.32±0.46-0.18±0.02 0.93±0.07 9.63±0.21-0.19±0.01 0.94±0.01 9.80±0.15-0.19±0.01 0.94±0.07 9.45±0.14-0.19±0.01 0.89±0.01 9.67±0.17回收率/%-84.4 91.7 93.2-88.4 92.6 96.3-94.2 94.2 98.0-92.9 93.7 94.5-92.6 89.0 96.7商业ELISA 试剂盒检测方法检测浓度/（μg/kg）-0.16±0.03 0.90±0.07 8.42±1.20-0.18±0.00 0.91±0.17 9.58±0.55-0.20±0.02 1.02±0.01 10.24±1.06-0.19±0.03 0.94±0.07 8.69±0.72-0.19±0.01 0.85±0.11 9.50±1.25
由表1 可知，样品添加回收率在84.4%～98.0%，证明本试验所建立检测方法具有实际样品检测能力。
2.3 基于荧光共振能量转移量子点-特异性多肽检测玉米赤霉烯酮方法建立结果
2.3.1 量子点-特异性多肽荧光探针表征结果
多肽荧光探针的表征结果见图7。
图7 量子点标准溶液和相同浓度量子点-多肽溶液荧光强度
Fig.7 Fluorescence intensity of quantum dot standard solution and quantum dot-peptide solution at the same concentration
由图7 可知，同等浓度的纯品量子点溶液比同等浓度量子点-特异性多肽探针溶液体系荧光强度值高。羧基化量子点成功偶联标记多肽后表面基团改变影响了荧光强度值，因此，可以表明量子点-特异性多肽荧光探针成功合成。
2.3.2 检测方法条件优化结果
试验条件优化结果见图8。
图8 检测方法条件优化
Fig.8 Optimization of detection conditions
a.不同浓度氧化石墨烯淬灭后体系荧光强度；b.氧化石墨烯淬灭前后体系荧光强度比值变化；c.氧化石墨烯淬灭时间优化结果；d.ZEN孵育时间优化结果。
2.3.2.1 氧化石墨烯淬灭浓度优化结果
试验考察了不同浓度GO 对探针的淬灭能力，由图8a 可知，随着GO 浓度增加体系荧光强度值逐渐降低。由图8b 可知，当浓度超过0.3 mg/mL 时，比值变化减慢，淬灭能力减弱，所以选用0.3 mg/mL 作为体系荧光淬灭最佳GO 浓度。
2.3.2.2 氧化石墨烯淬灭时间优化结果
由图8c 可知，20 min 时体系荧光差值达到最大。因此选用20min 为氧化石墨烯淬灭最佳时间。
2.3.2.3 玉米赤霉烯酮孵育时间优化结果
ZEN 和探针结合时间影响着探针识别的灵敏度和准确度，由图8d 可知，当孵育25 min 后体系的荧光强度值达到最大，因此，选取25 min 为ZEN 和探针最佳孵育时间。
2.3.3 量子点-特异性多肽检测玉米赤霉烯酮方法标准曲线建立
在最佳试验条件下，用荧光分光光度计测量添加不同浓度ZEN 标准溶液的试验组溶液体系荧光强度，计算与对照组溶液体系的荧光差值，探究ZEN 浓度与荧光差值的线性关系，结果见图9a。试验以ZEN 浓度（C，mg/L）对数（lgC）为横坐标，荧光差值为纵坐标绘制检测方法的标准曲线。标准曲线见图9b。
图9 荧光强度和标准曲线
Fig.9 Fluorescence intensity and standard curve
a.不同浓度ZEN 对应的荧光强度；b.检测方法标准曲线图。
由图9a 可知，随着ZEN 添加浓度的增加体系的荧光强度也逐渐增大，ZEN 添加量的增加使更多的探针与之结合，对比对照组氧化石墨烯能够淬灭的探针量逐渐减少，荧光强度得到保留，荧光差值逐渐增大。
由图9b 可知，此检测方法下ZEN 浓度在0.08～65.00 μg/L 范围内与体系的荧光差值有着良好的线性关系，其线性拟合方程为y=1 100x+1 512，相关系数R²=0.992 9，将3 倍标准偏差代入线性方程，计算得到方法检出限（S/N=3）为0.03 μg/L。
2.3.4 量子点-特异性多肽检测玉米赤霉烯酮方法性能评价
量子点-特异性多肽检测玉米赤霉烯酮方法性能评价见图10。
图10 检测方法评价
Fig.10 Evaluation of the established detection method
a.特异性评价；b.检测方法稳定性评价。
2.3.4.1 方法特异性评价
为验证方法特异性，试验选取了3 种真菌毒素进行评估，检测结果如图10a 所示，荧光差值只在ZEN存在的组中体现，说明该方法对ZEN 有良好的特异性。
2.3.4.2 方法稳定性评价
试验评估了方法稳定性，结果如图10b 所示，体系荧光差值在1～3 d 内基本稳定。因此，检测方法的稳定时间为3 d。
2.3.4.3 方法实际样品应用评价
本试验方法与商业试剂盒对实际样品中ZEN 的检测结果见表2。
表2 本试验方法与商业试剂盒对实际样品中ZEN 的检测结果
Table 2 Detection results of zearalenone in actual samples by the established method and commercial reagent kits
注：-表示未检出。
样品名称添加浓度/（μg/kg）玉米小麦大豆黑麦燕麦0.0 0.2 1.0 10.0 0.0 0.2 1.0 10.0 0.0 0.2 1.0 10.0 0.0 0.2 1.0 10.0 0.0 0.2 1.0 10.0量子点-特异性多肽荧光检测方法检测浓度/（μg/kg）-0.17±0.01 0.98±0.01 9.47±0.18-0.18±0.01 0.93±0.01 9.53±0.18-0.17±0.01 0.96±0.01 9.50±0.18-0.20±0.01 0.97±0.07 9.59±0.18-0.18±0.01 0.92±0.01 9.75±0.18回收率/%-89.5 98.7 94.7-91.4 93.9 95.3-89.0 95.1 98.0-105.6 95.9 94.5-92.8 92.1 97.5商业ELISA 试剂盒检测方法检测浓度/（μg/kg）-0.16±0.03 0.90±0.07 8.42±1.20-0.18±0.00 0.91±0.17 9.58±0.55-0.20±0.02 1.02±0.01 10.24±1.06-0.19±0.03 0.94±0.07 8.69±0.72-0.19±0.01 0.85±0.11 9.50±1.25回收率/%-81.9 89.8 84.2-89.2 90.6 95.8-102.4 102.0 102.4-95.2 94.2 86.9-95.3 84.7 95.0
由表2 可知，样品添加回收率在89.0%～105.6%，证明本试验所建立方法具有实际应用能力。
2.4 基于荧光共振能量转移检测玉米赤霉烯酮方法比较
本研究建立方法和文献查阅得到ZEN 检测方法比较，结果见表3。
表3 本研究构建的传感器方法与其他文献的检测方法结果比较
Table 3 Comparison of the results between the sensor-based method established in this study and other detection methods
检测方法ELISA金标试纸条分子印迹纳米粒子分析技术上转换纳米粒子异硫氰酸-特异性多肽量子点-特异性多肽玉米赤霉烯酮检测范围22～508 μg/kg 0.27～10.00 μg/kg 10～300 μg/kg 0.5～100.0 μg/L 0.1～40.0 μg/L 0.08～65.00 μg/L玉米赤霉烯酮检出限8 μg/kg 0.12 μg/kg 2 μg/kg 0.44 μg/L 0.04 μg/L 0.03 μg/L来源[18][19][20][21]本研究本研究
3 结论
本文以谷物中常见的真菌毒素ZEN 为目标物，以分子模拟特异性多肽为识别元件，分别用量子点和异硫氰酸荧光素标记特异性多肽制备ZEN 识别探针，基于荧光共振能量转移原理结合免疫检测技术构建两种快速检测ZEN 的检测方法。
异硫氰酸-特异性多肽玉米赤霉烯酮荧光检测方法：玉米赤霉烯酮浓度对数在0.1～40.0 μg/L 与体系的荧光差值有着良好的线性关系，R²=0.990 7。量子点-特异性多肽玉米赤霉烯酮荧光检测方法：ZEN 浓度对数在0.08～65.00 μg/L 与体系的荧光差值有良好的线性关系，R²=0.992 9。对建立的检测方法进行了实际应用性能评估，两种检测方法的稳定性、特异性较好。为粮食中ZEN 检测提供了一种新的检测技术，可以推广到食品中其他有毒有害物的快速检测中。
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