青钱柳（Cyclocarya paliurus）是珍贵的药食两用植物，其含有黄酮、三萜等多种活性成分[1-3]，具有抗氧化[4-5]及调节糖脂代谢[6-8]等功效。青钱柳常被作为茶饮，又因其滋味甘甜，故被称作“甜茶”[9]，有生津止渴、清热解毒、降低血压等作用[10]。
冠突散囊菌（Eurotium cristatum）是茯砖茶里的优势菌种[11]，能够产生多种胞外酶[12]，促使茶叶内含成分发生变化，进而改变其生物活性[13-16]，还能减少茶叶中的苦涩味，改善茶叶品质[17]。杨立娜等[18]发现荔枝草茶经过冠突散囊菌发酵后，茶多酚、氨基酸和可溶性糖含量下降，茶黄素和茶红素含量上升，苦味、涩味明显降低，品质得到了有效改善。有研究用冠突散囊菌发酵刺五加茶，在优化条件下得到的发酵茶感官评分最高，为91.1，生理功效变化明显[19]。
青钱柳成叶茶是把青钱柳老叶直接晒干制成的产品，其加工工艺简单、香气粗老、滋味青涩、经济价值不高。金花的数量是判断茯砖茶品质优劣的重要指标[20]。本研究用冠突散囊菌发酵青钱柳成叶茶，以单位质量茶叶中冠突散囊菌菌落数为指标，对发酵工艺中的固液比、灭菌时间及接种量进行优化，以期改善青钱柳成叶茶品质，为青钱柳资源的开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
冠突散囊菌：湖南省茶叶种植与加工工程技术研究中心提供，分离自湖南益阳茶厂有限公司茯茶，斜面保存于4 ℃冰箱；青钱柳成叶茶：张家界高山怡韵茶业有限公司；孟加拉红琼脂：北京陆桥技术股份有限公司；芦丁标准品：北京索莱宝科技有限公司；齐墩果酸标准品：成都德斯特生物技术有限公司；甲醇、乙醇、冰醋酸、香草醛、三氯化铝（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
恒温恒湿箱（HPX-60BS-III）：上海新苗医疗器械制造有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅（LDZH-100KBS）：上海申安医疗器械厂；多位涡旋振荡器（MV-3000）：广东晋元科技有限公司；高速台式离心机（H1850）：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；水浴恒温振荡器（SHZ-300A）：扬州市培英实验仪器有限公司；紫外可见分光光度计（UV-2450）：日本岛津公司。
1.3 方法
1.3.1 冠突散囊菌发酵剂的制作
参考王家琛等[21]的方法制作冠突散囊菌发酵剂。将茶叶和水按1∶0.5（g/mL）的料液比装入300 mL 三角瓶中，121 ℃灭菌30 min，接入斜面冠突散囊菌，28 ℃培养4 d[22]为冠突散囊菌发酵剂。
1.3.2 青钱柳茶的冠突散囊菌发酵
称取一定量的青钱柳成叶茶于500 mL 三角瓶中，按比例加入蒸馏水，搅拌均匀后静置1 h。用蒸汽灭菌锅121 ℃灭菌后，按比例接入冠突散囊菌发酵剂，置于恒温恒湿箱内28 ℃培养5 d。取出后于70 ℃恒温干燥箱内烘干4 h，无菌密封袋保存。
1.3.3 单因素试验
以茶水固液比[1∶0.2、1∶0.3、1∶0.4、1∶0.5、1∶0.6（g/mL）]、灭菌时间（10、15、20、25、30 min）、接种量（1%、2%、3%、4%、5%）为影响因素，以单位质量茶叶中冠突散囊菌菌落数为评价指标，进行单因素试验。
1.3.4 正交试验
在单因素试验基础上，以冠突散囊菌菌落数为考察指标，选择固液比（A）、灭菌时间（B）、接种量（C）进行三因素三水平正交试验，正交试验因素与水平见表1。
表1 正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments
水平因素C 接种量/%123 A 固液比/（g/mL）1∶0.3 1∶0.4 1∶0.5 B 灭菌时间/min 10 15 20 123
1.3.5 冠突散囊菌菌落数测定
按照GB 4789.15—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母菌计数》中的方法进行。
1.3.6 青钱柳茶成分提取
称取1 g 磨碎样品于50 mL 离心管，加入30 mL 70%乙醇水，2 000 r/min 涡旋1 min，使茶叶充分浸湿。置于80 ℃水浴恒温振荡器中，调节转速150 r/min，提取30 min 后，于5 000 r/min 离心5 min，过滤至50 mL比色管，滤渣加入20 mL 70% 乙醇水重复提取一次。合并滤液，定容至50 mL，以备成分测定。
1.3.7 青钱柳茶总黄酮含量的测定
参考李富民等[23]的方法并略作修改。准确称取0.010 g 芦丁标准品，用无水乙醇溶解并定容至100 mL，得到质量浓度为0.1 mg/mL 芦丁标准溶液，分别取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 于10 mL 容量瓶中，加入1%三氯化铝溶液1 mL，甲醇定容，摇匀静置15 min，于410 nm 处测定吸光度，绘制芦丁标准曲线。量取0.5 mL青钱柳提取液于10 mL 容量瓶中，以上述方法测定吸光度，以芦丁标准曲线计算样品中总黄酮含量。标准曲线方程为y = 40.491x + 0.016，R2 = 0.999。
1.3.8 青钱柳茶总三萜含量的测定
参考NY/T 3676—2020《灵芝中总三萜含量的测定分光光度法》并略作修改。准确称取0.010 g 齐墩果酸标准品，用甲醇溶解并定容至50 mL，得到质量浓度为0.2 mg/mL 齐墩果酸标准溶液，分别取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 于10 mL 试管中，将试管置于沸水浴中挥干溶剂，加入5% 香草醛-冰醋酸溶液0.1 mL，高氯酸0.8 mL，混匀后于60 ℃水浴中保温显色20 min。取出后迅速置于冰水浴中冷却5 min，终止显色反应。再加入5.0 mL 冰醋酸，混匀后室温放置10 min，于550 nm处测定吸光度，绘制齐墩果酸标准曲线。量取0.1 mL青钱柳提取液于10 mL 试管中，以上述方法测定吸光度，以齐墩果酸标准曲线计算样品中总三萜含量。标准曲线方程为y = 11.337x - 0.040，R2 = 0.999。
1.3.9 感官评价
由5 个有经验的评茶员组成感官评定小组，参考T/CSTEA 00038—2021《青钱柳茶》和GB/T 23776—2018《茶叶感官审评方法》，分别对发酵前后青钱柳茶的外观、汤色、香气、滋味进行评分，各指标得分相加即总得分。感官评分标准如表2 所示。
表2 青钱柳茶感官评分标准
Table 2 Sensory scoring criteria for Cyclocarya paliurus tea
项目外观评分系数/%30汤色15香气25滋味品质特征色泽油润，净度好色泽尚匀润，净度较好尚匀净橙黄色，明亮橙黄色，较明亮浅黄，尚亮清高，纯正，无杂气味清香，尚纯正，无杂气味尚纯醇厚，甘甜味苦回甘显较甘甜微苦尚甘甜带辛、微苦分值90～99 80～＜90 70～＜80 90～99 80～＜90 70～＜80 90～99 80～＜90 70～＜80 90～99 80～＜90 70～＜80 30
1.4 数据处理
单因素试验每个处理重复3 次，正交试验每个处理重复2 次；每个样品平行检测3 次，测定结果以平均值±标准差表示。采用SPSS 23 统计软件进行方差分析，Origin 2021 绘图。
2 结果与分析
2.1 固液比对冠突散囊菌菌落数的影响
固液比对冠突散囊菌菌落数的影响见图1。
图1 固液比对冠突散囊菌菌落数的影响
Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the colony count of Eurotium
cristatum
不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
由图1 可知，当固液比从1∶0.2（g/mL）变化到1∶0.3（g/mL）时，冠突散囊菌菌落数显著增加，达到最大值（4.45±0.92）×106 CFU/g。随着溶剂体积的进一步增加，菌落数呈下降趋势；固液比超过1∶0.5（g/mL）后，冠突散囊菌菌落数下降不显著。水分是微生物生长繁殖和进行代谢活动的重要媒介和必要条件[24]，有研究指出水分含量过低或过高都会影响冠突散囊菌的生长和酶的活性[25]。在茯砖茶的加工中，适度的水分（湿度）才有利于冠突散囊菌的生长，达到既“发花”普茂，又无其它杂霉污染的效果[26]。因此选择固液比1∶0.3、1∶0.4、1∶0.5（g/mL）进行正交优化试验。
2.2 灭菌时间对冠突散囊菌菌落数及总黄酮、总三萜含量的影响
高温蒸汽灭菌可以消灭原料里的有害霉菌和细菌，同时可以达到去除粗青气、软化梗叶的纤维素和角质层的目的[27]。灭菌时间对冠突散囊菌菌落数的影响见图2。灭菌时间对总黄酮和总三萜含量的影响见图3。
图2 灭菌时间对冠突散囊菌菌落数的影响
Fig.2 Effect of sterilization time on the colony count of Eurotium cristatum
不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
图3 灭菌时间对总黄酮和总三萜含量的影响
Fig.3 Effect of sterilization time on the contents of total flavonoid and total triterpenoid
不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
如图2 所示，灭菌时间从10 min 增加到25 min，发酵5 d 的冠突散囊菌菌落数变化不显著；当灭菌时间超过20 min 后，冠突散囊菌菌落数呈下降趋势，这与陈琳琳等[28]的研究结果较为一致。灭菌时间为30 min的菌落数比灭菌时间为10 min 时下降了56%。
由图3 可以看出，随着灭菌时间的延长，两种功能成分的含量显著降低。蒸汽灭菌是一个高温高压的过程，在这个过程中青钱柳茶中的成分会发生分解、聚合等化学反应，导致冠突散囊菌生长繁殖所需要的营养物质减少，这可能是冠突散囊菌数量随着灭菌时间延长而下降的原因之一。因此选择灭菌时间10、15、20 min进行正交优化试验。
2.3 接种量对冠突散囊菌菌落数的影响
接种量对冠突散囊菌菌落数的影响见图4。
图4 接种量对冠突散囊菌菌落数的影响
Fig.4 Effect of inoculation amount on the colony count of Eurotium cristatum
不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
由图4 可知，接种量从1%增加到4%时，菌落数没有显著变化；当接种量超过3%后，菌落数呈下降趋势；接种量5% 时的菌落数是接种量3% 时的43%。张丽华等[24]的研究指出，接种量越多，越易形成优势菌种；但由于底物是有限的，若接种量过大，则会影响微生物的生长繁殖。因此选择接种量1%、2%、3% 进行正交优化试验。
2.4 正交试验结果
正交试验结果见表3。
表3 正交试验结果
Table 3 Results of orthogonal experiments
试验号因素Ⅱ1 2 3 4 A 1 1 1 2 B 1 2 3 1 C 1 2 3 2 D1 2 3 3冠突散囊菌菌落数/（×106 CFU/g）Ⅰ0.61 1.73 5.46 1.68 0.32 3.32 6.73 1.86
续表3 正交试验结果
Continue table 3 Results of orthogonal experiments
注：Ⅰ、Ⅱ分别为同条件下重复发酵两次的冠突散囊菌菌落数结果。
试验号因素Ⅱ5 6 7 8 9 A 2 2 3 3 3 B 2 3 1 2 3 C 3 1 3 1 2 D 1 2 2 3 1冠突散囊菌菌落数/（×106 CFU/g）Ⅰ0.83 1.77 0.66 0.31 0.58 1.06 3.23 0.73 0.54 0.66
利用SPSS 统计软件对试验结果进行方差分析，结果见表4。
表4 方差分析结果
Table 4 Results of variance analysis
注：P＜0.05 表示影响显著。
源自由度修正模型截距A 固液比B 灭菌时间C 接种量D 空列误差总计修正后总计Ⅲ类平方和5 287.893 5 714.874 1 797.956 1 525.380 645.866 1 318.692 324.792 11 327.560 5 612.686 8 1 2 2 2 2 9 1 8均方660.987 5 714.874 898.978 762.690 322.933 659.346 36.088 F 值18.316 158.359 24.911 21.134 8.948 18.270 P 值0.000 0.000 0.000 0.000 0.007 0.001 17
由表4 可知，A、B、C 3 个影响因素的主效应显著（P＜0.05），且主次顺序为固液比＞灭菌时间＞接种量。
多重比较结果见图5。
图5 3 个因素的多重比较
Fig.5 Multiple comparisons of three factors
同一因素不同水平小写字母不同表示差异显著，P＜0.05。
由图5 可以得出，影响冠突散囊菌菌落数的最佳水平组合为A1B3C3，即固液比1∶0.3（g/mL）、灭菌时间20 min、接种量3%，与正交试验结果一致。
在茯砖茶的制作工艺中，茶砖含水量是否适度与“发花”品质优劣至关重要[26]。本次试验中的最佳固液比为1∶0.3（g/mL），与文献[22，29]结论相似。有研究证实冠突散囊菌适合在干燥的茶叶中生长和繁殖[30]，且过高的含水量可能导致杂菌的滋生[29]。
2.5 验证试验
在最佳组合A1B3C3 条件下进行冠突散囊菌固态发酵青钱柳成叶茶，从发酵2 d 开始每天随机抽取3 瓶样品，检测冠突散囊菌菌落数和主要成分的含量。优化条件下不同发酵时间的冠突散囊菌菌落数变化见图6，活性成分的含量变化见图7。
图6 优化条件下不同发酵时间的冠突散囊菌菌落数变化
Fig.6 The variation of Eurotium cristatum colony count at different fermentation time points under the optimized conditions
不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
图7 优化条件下不同发酵时间活性成分的含量变化
Fig.7 The variation of active component contents in different fermentation time points under the optimized conditions
不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
由图6 可知，发酵2 d 的菌落数达到（0.57±0.05）×106 CFU/g，超过茯砖茶国家标准0.20×106 CFU/g；发酵时间从3 d 延长至7 d，冠突散囊菌菌落数整体呈上升趋势，说明冠突散囊菌的有性繁殖能力降低，生化活动能力下降[24]；4、5 d 冠突散囊菌菌落数下降可能由于微生物固态发酵的重复性较差产生的测量波动。由于冠突散囊菌发酵至5 d 仍有部分白色菌丝体尚未转化成“金花”孢子，而发酵7 d 的金花较为丰富饱满。从茶叶外观因素考虑，发酵7 d 更为合适，此时的冠突散囊菌菌落数为（6.48±0.21）×106 CFU/g。
黄酮和三萜是青钱柳的主要功能成分[4]，从图7 中可以看到，两者的含量在整个发酵过程中呈先上升后下降的趋势。总黄酮在2 d 达到最高值（10.67±0.03）mg/g，相比0 d 升高15%；在7 d 为（8.11±0.06）mg/g。总三萜在发酵3 d 达到最高值（25.04±0.30）mg/g，相比0 d升高9%；发酵7 d 达到（22.45±0.09）mg/g。有研究报道冠突散囊菌在生长中会分泌纤维素酶、木聚糖酶等水解酶，有助于提高细胞通透性[12]；同时耶玉婷等[31]研究也指出冠突散囊菌分泌的胞外酶可加速茶多酚、可溶性糖和氨基酸等物质的生物转化。
2.6 感官评价
发酵前后青钱柳茶的比较见图8。
图8 发酵前后青钱柳茶的比较
Fig.8 The comparison of Cyclocarya paliurus tea before and after fermentation
A.未发酵青钱柳干茶；B.发酵青钱柳干茶；C.未发酵青钱柳茶汤；D.发酵青钱柳茶汤。
由图8 可知，青钱柳茶发酵前后在外观、汤色、香气和滋味方面存在明显差异。未发酵的青钱柳茶干茶色泽灰绿暗沉，汤色橙黄，香气粗老，滋味甘甜带辛、微苦，综合感官评分77.1；发酵7 d 的青钱柳茶干茶棕褐油亮，叶面遍布“金花”，粗老青气下降明显，产生了药香、甜香，汤色浅黄，甜味降低，苦涩味消失，综合感官评分86.2。
黄酮类化合物大多呈黄色，总黄酮含量的下降可能是导致茶汤颜色变浅的原因。达玛烷型三萜皂苷是青钱柳主要的甜味成分[32]，总三萜含量下降将会导致茶汤甜味降低。茶叶中绝大部分挥发性成分在灭菌过程中挥发丢失或减少[33]，但在发酵过程中由于湿热反应和微生物的作用又会产生新的挥发性成分，从而产生独特的“菌香”。
3 讨论与结论
冠突散囊菌是茯砖茶中的优势菌种，可以降低茶叶中苦涩物质，改善茶叶风味。本试验利用冠突散囊菌发酵青钱柳成叶茶，通过单因素及正交试验确定了发酵工艺，最佳工艺条件为固液比1∶0.3（g/mL）、灭菌时间20 min、接种量3%。在最佳条件下28 ℃发酵7 d得到的发酵青钱柳茶，其冠突散囊菌菌落数为（6.48±0.21）×106 CFU/g；总黄酮含量为（8.11±0.06）mg/g，相比0 d 减少了13%；三萜含量变化不显著，为（22.45±0.09）mg/g。对比未发酵青钱柳茶，冠突散囊菌发酵青钱柳茶“金花”饱满，粗老青气和苦涩味下降，产生了药香、甜香，品质改善明显。
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