辣木为辣木科辣木属多年生落叶乔木，原产于巴基斯坦、印度、孟加拉国和阿富汗等国家，因其对土壤和环境具有广泛的适应性，现分布在热带和亚热带地区[1-3]。在我国云南、海南、贵州、福建、广东等地区均有引种，并建立了辣木栽培基地[4-5]。2012 年国家卫生部将辣木批准为新资源食品，同年国家农业部将辣木叶列入蔬菜目录[6-8]。
辣木叶资源丰富、采集方便、加工简单，不仅含有丰富的维生素和矿物质，而且还富含活性成分，成为近年来研究的热点。多酚是辣木的重要活性成分，能调节人体营养平衡、增强免疫力，特别适合亚健康人群，对高血压、高血糖、高血脂能起到预防作用，具有极高的研究价值和开发前景[9-13]。辣木叶可以作为蔬菜直接食用[14]，但单纯食用辣木叶，起不到很好的预防作用，其活性成分需进一步提纯后，才能被人体吸收利用，从而达到保健的功能[15-18]。
从辣木叶中提取多酚一般可以通过浸提法、加压溶剂提取法、酶提取法、超临界流体萃取法、超声辅助提取法和微波辅助提取法等[19-22]。微波辅助提取法利用样品或溶剂中的极性分子，在高频电磁波的作用下，产生大量热能，加快细胞破裂，从而促进多酚类物质从基质内流出[23-25]。微波辅助提取法有快速高效、加热均匀、节省溶剂、工艺简单、成本低、应用面广等优点，是一种非常适合工业化应用的提取方法。本试验采用响应面法，以微波功率、提取温度、微波时间为自变量，以多酚含量为响应值，研究微波辅助法提取辣木叶多酚的最佳工艺条件，以期为辣木叶多酚的高效提取及进一步开发利用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
辣木叶：产自云南丽江华坪；没食子酸（标准品）：国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇（分析纯）：默克化工技术有限公司；碳酸钠（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；福林酚试剂（分析纯）：上海摩尔生化试验有限公司。
MKX-E1A 微波生物萃取仪：北京麦科威尔科技有限公司；BSA224S 电子分析天平：赛多利斯仪器有限公司；UV-2000 紫外可见分光光度计：上海尤尼柯仪器有限公司；101-3A 电热恒温鼓风干燥箱：上海苏进仪器设备有限公司；DFY-800 高速粉碎机：杭州旭朗机械设备有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 植物样品制备
新鲜的辣木叶经过除杂、清洗、阴凉处晾晒24 h后，置于电热恒温鼓风干燥箱在40 ℃条件下进行干燥，烘干至水分含量6%以下，粉碎机粉碎，过筛（60 目），密封避光保存于-18 ℃冰箱备用。
1.2.2 单因素试验
称取3 g 辣木叶粉，称样前恢复至室温，加入70%乙醇，料液比为1∶10（g/mL），以辣木叶多酚含量为响应值，分别对微波功率（300、400、500、600、700 W）、提取温度（20、30、40、50、60 ℃）、微波时间（20、30、40、50、60 min）进行单因素试验。该单因素未作为试验变量时，按微波功率500 W、提取温度30 ℃、微波时间30 min 进行试验。
1.2.3 响应面试验
在单因素试验结果的基础上，选择微波功率、提取温度、微波时间为因素，以辣木叶多酚含量为响应值，采用响应面法中的Box-Behnken 试验设计优化提取工艺，确定最佳提取方法，因素水平如表1 所示。
表1 响应面因素及水平
Table 1 Factors and levels of response surface
因素水平-1 0 1 A 微波功率/W 500 600 700 B 提取温度/℃30 40 50 C 微波时间/min 20 30 40
1.2.4 提取物中总酚含量的测定
1.2.4.1 标准曲线的绘制
采用福林酚法，以没食子酸作为总酚含量测定的标准品，横坐标为没食子酸浓度，纵坐标为765 nm 处的吸光度，得到标准曲线Y=62.582X-0.005 4，R2=0.999 3。
1.2.4.2 辣木叶多酚含量的测定
浸提液冷却后4 000×g 离心，取1 mL 上清液于10 mL 棕色容量瓶中，测量765 nm 处样品的吸光度，按下式计算多酚含量。
式中：W 为辣木叶多酚含量，mg/g；C 为辣木叶多酚浓度，μg/mL；N 为稀释因子；V 为上清液体积，mL；m为辣木叶粉末质量，g。
1.3 数据处理
每组试验重复3 次，结果以平均值±标准差表示。响应面模型建立及试验分析采用Design-Expert 13.0软件处理，显著性差异为95%置信区间（P＜0.05）。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 微波功率对辣木叶多酚含量的影响
微波辅助萃取技术是一种高效的提取手段，在食品化学领域已被广泛应用。随着微波功率的增加，所引起的极性振动也随之增强，更容易击穿植物细胞壁，促进植物内活性成分的溶出[26-27]。微波功率对辣木叶多酚含量的影响如图1 所示。
图1 微波功率对辣木叶多酚含量的影响
Fig.1 Effect of microwave power on the content of polyphenols in Moringa oleifera leaves
由图1 可知，当微波功率为300～600 W 时，随着微波功率的增加，多酚含量逐渐升高，在600 W 时多酚含量达到最高值，之后呈下降趋势。这可能是因为随着微波功率逐渐升高，多酚溶出率不断上升，当微波功率过大时，多酚类物质的分子结构遭到破坏，导致多酚含量下降。因此选择微波功率500、600、700 W 进行响应面优化试验。
2.1.2 提取温度对辣木叶多酚含量的影响
提取温度越高，萃取体系内分子的移动也越快，引起分子间弱氢键的断裂，加快提取物的溶出[27-28]。提取温度对辣木叶多酚含量的影响如图2 所示。
图2 提取温度对辣木叶多酚含量的影响
Fig.2 Effect of extraction temperature on the content of polyphenols in Moringa oleifera leaves
由图2 可知，在提取温度为20～40 ℃时，随着提取温度的不断升高，多酚含量不断上升，在40 ℃时达到最大值，之后呈下降趋势。这是由于提取温度在一定范围内升高时，多酚物质的溶解度会增加，同时分子之间的黏滞度会有所下降，从而使提取体系能容纳更多的酚类物质。但如果提取温度过高，提取液中多酚类物质容易发生分解，同时提取液中的杂质含量也会增加，影响之后的提纯工作。因此选择30、40、50 ℃进行响应面优化试验。
2.1.3 微波时间对辣木叶多酚含量的影响
与传统提取工艺比较，微波辅助提取技术可以明显缩短微波时间。微波时间对辣木叶多酚含量的影响如图3 所示。
图3 微波时间对辣木叶多酚含量的影响
Fig.3 Effect of microwave time on the content of polyphenols in Moringa oleifera leaves
由图3 可知，当微波时间为30 min 时，多酚含量达到最大值，之后随着微波时间的延长，多酚含量逐渐降低，这可能是因为微波时间过长，多酚化合物发生氧化，导致提取量降低[28]。因此选择20、30、40 min 进行响应面优化试验。
2.2 响应面结果分析
2.2.1 响应面试验结果及方差分析
在单因素试验的基础上，分别选取微波功率、提取温度、微波时间为因素，以多酚含量为响应值进行响应面Box-Behnken 优化试验，结果如表2 所示。对辣木叶多酚试验结果进行方差分析，结果如表3 所示。
表2 响应面试验结果
Table 2 Response surface test results
序号1234567891 0 11 12 13 14 15 16 17 A 微波功率/W 500 600 600 600 600 600 600 600 700 500 700 700 700 500 600 600 500 B 提取温度/℃40 40 50 30 40 40 40 50 40 30 30 50 40 40 30 40 50 C 微波时间/min 20 30 40 20 30 30 30 20 20 30 30 30 40 40 40 30 30 Y 多酚含量/（mg/g）25.86 27.04 25.11 25.23 26.95 27.08 26.93 25.71 24.92 24.07 23.89 23.95 24.81 24.63 25.14 26.92 24.59
表3 响应面试验方差分析
Table 3 Analysis of variance in response surface methodology
来源模型自由度ABCA B显著性*******AC BC平方和20.89 0.312 0.1326 0.515 1 0.052 9 0.313 6 0.065 9111111均方2.32 0.312 0.132 6 0.515 1 0.052 9 0.313 6 0.065 F 值214.13 28.78 12.23 47.51 4.88 28.92 6 P 值＜0.000 1 0.001 0.01 0.000 2 0.062 9 0.001 0.044 2***
续表3 响应面试验方差分析
Continue table 3 Analysis of variance in response surface methodology
注：*表示影响显著，P＜0.05；**表示影响极显著，P＜0.01。
来源A2 B2 C2残差失拟项纯误差总和平方和10.13 7.21 0.602 4 0.075 9 0.055 4 0.020 5 20.97自由度1 1 1 7 3 4 1 6均方10.13 7.21 0.602 4 0.010 8 0.018 5 0.005 1 F 值933.91 664.66 55.56 P 值＜0.000 1＜0.000 1 0.000 1显著性******3.6 0.124
将试验结果进行多元回归拟合，得到辣木叶多酚的回归方程模型：Y=26.98-0.197 5A+0.128 8B-0.253 8C-0.115 0AB+0.280 0AC-0.127 5BC-1.55A2-1.31B2-0.378 2C2。
由表3 可知，模型的P＜0.000 1，表明此模型极显著，且失拟项P=0.124＞0.05，不显著，表明此模型可用于各提取因素进行响应面试验分析。模型的系数R2=0.996 4，校正决定系数R2Adj=0.991 7，预测决定系数R2pred=0.956 2，表明该模型拟合度较好。模型中A、C、AC、A2、B2、C2 的P ＜0.01，表明对多酚含量的影响极显著，B、BC 的P＜0.05，表明对多酚含量的影响显著，AB的P＞0.05，表明对多酚含量的影响不显著。由F 值可知，各提取条件对辣木叶多酚含量的影响程度为微波时间＞微波功率＞提取温度。
2.2.2 响应面交互作用分析
响应面法可以分析响应值与多个试验因素间的回归关系[28]。在响应面图中，曲面的倾斜度能够反映两因素对响应值的影响强弱，坡度越陡表明两者对响应值的影响越显著；等高线能够反映两因素交互作用对响应值的影响强弱，等高线呈椭圆形表明两因素交互作用对响应值影响较大，呈圆形则说明影响较小[29]。各因素交互作用如图4 所示。
图4 交互作用对辣木叶多酚含量的影响
Fig.4 Effect of the interaction on the content of polyphenols in Moringa oleiferc leaves
a.微波功率与提取温度；b.微波功率与微波时间；c.提取温度与微波时间。
由图4b、4c 可以看出，等高线呈椭圆形，表明微波功率与微波时间、提取温度与微波时间的交互作用对辣木叶多酚含量的影响显著，这与方差分析的结果一致。由图4a 可以看出，等高线呈圆形，表明微波功率与提取温度的交互作用对辣木叶多酚含量的影响较弱，这与方差分析的结果一致。
2.2.3 响应面优化及验证试验
通过Design-Expert 13.0 对模型进行优化，得到微波处理的最佳工艺条件：微波功率589.88 W、微波时间26.14 min、提取温度40.73 ℃，由模型得到多酚含量的预测值为27.05 mg/g。考虑到提取条件能够应用于工业化，将提取条件修改为微波功率590 W、微波时间26 min、提取温度41 ℃。采用修改后的提取条件，进行3 组试验进行验证，多酚含量结果为（27.11±0.28）mg/g，与预测值接近，说明该模型拟合良好，工艺合理可行。
3 结论
多酚类物质作为辣木叶中主要的功效性成分具有较高的生物活性功效及开发前景。本研究利用微波辅助提取辣木叶多酚，通过方差分析，得出各提取条件对辣木叶多酚含量的影响程度为微波时间＞微波功率＞提取温度。通过响应面法对提取条件进行优化，并结合工业化应用的可行性，确定最佳提取条件为微波功率590 W、微波时间26 min、提取温度41 ℃。对模型进行响应面法优化，得到辣木叶多酚含量的预测值为27.05 mg/g，验证试验的多酚含量为（27.11±0.28）mg/g。此提取条件和响应面模型可为辣木叶多酚的工业化提取提供参考，为其进一步的开发利用提供依据。
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