康乃馨是一年或数年生的丛生草木，为石竹科石竹属植被。康乃馨花茶有美容养颜、缓解身体老化、健胃消食等的功效[1]，并且因为其富含钾、钙、钠、铁等各种营养元素，逐渐成为人们的时尚茶饮。勿忘我为多年生紫草科草本植物，花性干、寒，具有养阴补肾、美白肌肤等功能，也可改善人体皮肤粗糙、大便秘结等症状[2]。同时，勿忘我中还含有黄酮类化合物，使其具有降血压、抑制血栓生成、抗氧化等功效[3]。近年来，随着花茶的兴起，康乃馨和勿忘我逐步受到消费者的关注。两者除了具备欣赏价值，均可入药，还具有清热解毒、降血压、改善皮肤粗糙、延缓衰老、改善大便秘结等功效。两者潜在的食用价值，为复合花茶黄酒的开发提供参考。
黄酒有很好的滋养价值，富含各类容易被机体消化系统吸取的氨基酸、微量元素和维生素等。合理食用黄酒，不但可以提高机体代谢，而且还可以缓解肥胖、滋养心血管系统[4-5]。因此，研制富有养生与健康特点的黄酒不但可以增加黄酒的附加值，增强黄酒产品的竞争力，而且可以适应人们对养生、健康的要求，有较好的市场前景。
本文参考王丽霞等[6]的黄酒发酵技术，并采用单因素与响应面试验对复合花茶黄酒酿造工艺进行研究，确定复合花茶黄酒最佳的酿造工艺条件，以期为工业化生产复合花茶黄酒，提高复合花茶黄酒的品质提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
糯米：市售；安琪酒曲：安琪酵母股份有限公司；康乃馨、勿忘我：产自云南省昆明市；胰蛋白胨（分析纯）：福晨河北科技有限公司；酵母浸膏（分析纯）：北京鸿润宝顺科技有限公司；葡萄糖（食品级）：上海骏潜实业有限公司；琼脂（分析纯）：江苏采薇生物科技有限公司；磷酸二氢钾（分析纯）：郑州百思特食品添加剂有限公司；氯化钠（分析纯）：陕西养元神生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
电子分析天平（LD210-2R）：沈阳龙腾电子有限公司；恒温培养箱（303-1B）：联鲸电子科技（上海）有限公司；超净工作台（AW-CJ-1B）：苏州安泰空气技术公司；高压灭菌锅（YXQ-LS-50SII）：上海博迅实业有限公司医疗设厂；糖度仪（SJN-WZ101）：西化仪（北京）科技有限公司；万用电炉（DL-1）：北京中兴伟业仪器有限公司；酒精计（CJM-2323）：宿迁宇之婷电子商务有限公司；恒温干燥箱（HK-16E）：东莞市勤卓环境测试设备有限公司；超声波发生器（JT-D28-2100-BDK-PMC）：张家港市锦涛超声电气有限公司。
1.3 方法
1.3.1 复合花茶黄酒酿造工艺流程
1.3.2 操作要点
原材料预处理：糯米提前浸泡24 h，浸泡时水需没过糯米2～3 cm，同时在浸泡过程中需搅拌2～3 次，使糯米浸泡均匀；取2 g 勿忘我或康乃馨于90 ℃的200 mL蒸馏水中，浸泡至室温[7]。
蒸煮：煮沸后继续蒸煮15 min，时间不宜过长，避免过度糊化，糯米要求颗粒分明、疏松不糊、内无生心、黏而不烂。
摊饭冷却：将蒸好的糯米摊开在灭菌后的纱布上，使米饭在空气中冷却。
拌曲：称取200 g 的糯米，与适量的酒曲进行充分搅拌，注意卫生，避免后期发酵过程中染菌[8]。
主发酵：控制发酵温度为28～30 ℃，每隔12 h 进行一次充分搅拌。
后发酵：用无菌纱布对发酵液进行粗滤，后将滤液置于15～20 ℃下进行后发酵。在黄酒的后发酵过程中采用超声波促进其后熟过程，经过超声波处理后可以有效地增加酒体中的分子间碰撞，有利于酒体中各成分之间发生氧化、酯化等化学反应，缩短后发酵时间。同时，超声波还可以加速酒体中的不良风味物质的挥发，从而改善酒体的风味[9]。
煎酒：于85 ℃下水浴10 ～15 min，杀灭黄酒中的细菌，以使酒体更加稳定，并有助于避免成品酒酸败[10]。
1.3.3 单因素试验设计
固定料水比为1∶1（g/mL），糯米质量为200 g，花茶总体积为200 mL。
1.3.3.1 酒曲添加量的确定
以酒曲添加量为研究对象，将其梯度设置为10%、12%、14%、16%、18%（以糯米的质量作为参考），花茶体积比为2∶1，在25 ℃条件下进行发酵，发酵时间为10 d，考察不同酒曲添加量对黄酒的酒精度的影响。
1.3.3.2 花茶体积比的确定
以两种花茶的体积比（均指康乃馨与勿忘我两花茶浸出液的比值）为研究对象（液体总体积不变，为200 mL），将其梯度设置为4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2，酒曲添加量为12%，在25 ℃条件下进行发酵，发酵时间为10 d，考察不同花茶体积比对黄酒的酒精度的影响。
1.3.3.3 发酵时间的确定
以发酵时间为研究对象，将其梯度设置为7、8、9、10、11 d，酒曲添加量为12%，花茶体积比为3∶1，在25 ℃条件下进行发酵，考察不同发酵时间对黄酒的酒精度的影响。
1.3.3.4 发酵温度的确定
以发酵时间为研究对象，将其梯度设置为20、23、26、29、32 ℃，酒曲添加量为12%，花茶体积比为3∶1，发酵时间为10 d，考察不同发酵温度对黄酒的酒精度的影响。
1.3.4 响应面试验设计
在单因素试验的基础上，选择酒曲添加量、花茶体积比、发酵时间和发酵温度4 个因素，以酒精度作为响应值，运用中心组合试验设计法（Box-Behnken，BBD）进行四因素三水平的响应面优化试验，具体因素与水平见表1。
表1 BBD 法响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface test by BBD method
因素水平-1 C 发酵时间/d 01 A 酒曲添加量/%10 12 14 B 花茶体积比4∶1 3∶1 2∶1 891 0 D 发酵温度/℃23 26 29
1.3.5 验证试验
对所得的响应面试验结果的可行性和有效性加以验证，进行3 次平行试验并取平均值，确定最优化的试验方法。
1.3.6 指标检测方法
1.3.6.1 理化指标
酒精度的测定：依据GB/T 13662—2018《黄酒》[11]中的方法进行检测。黄酒试样进行蒸馏后，用酒精计测定馏出液中的酒精度。
1.3.6.2 微生物指标
1）细菌总数、大肠杆菌的测定
参考GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验菌落总数测定》[12]中的方法进行测定。先吸取1 mL 酒样于消毒过的培养基上，并将试样于平皿上均匀涂抹，同时在另一平皿上不接种其他试样进行空白对照，随后翻转两个平皿，并将底部朝上，最后于36 ℃的恒温培养箱中放置约48 h，然后用肉眼观察并记录菌落总数。
2）致病菌的测定
参照GB 29921—2021《食品安全国家标准预包装食品中致病菌限量》[13]中的方法进行致病菌的检测。
1.4 数据统计
采用Excel 2019 软件进行试验数据的录入、计算和绘图等。采用Design-Expert 8.0.6 对响应面进行设计和数据统计分析。
2 结果与分析
2.1 复合花茶黄酒发酵单因素试验结果
2.1.1 酒曲添加量对复合花茶黄酒酒精度的影响
酒曲添加量对复合花茶黄酒酒精度的影响见图1。
图1 酒曲添加量对复合花茶黄酒酒精度的影响
Fig.1 Effect of distiller's yeast on the alcohol content of flowertea yellow rice wine
由图1 可知，随着酒曲添加量的增加，酒精度呈现出先增加后减少的态势。酒曲中添加量过低时，酵母的数量少，微生物会首先利用糯米中的营养物质完成自身的繁殖，不能充分利用糯米进行发酵，所产生的酒精少。当酒曲添加量为12% 时，酒精度达到最高，为12.47% vol。而酒曲添加量过多时，酵母含量增加，但营养物质的含量固定不变，微生物数量众多，在群落中会出现竞争关系，酒精的生成量减少[14-15]。因此，选择酒曲添加量10%、12%、14%进行响应面优化试验。
2.1.2 花茶体积比对复合花茶黄酒酒精度的影响
花茶体积比对复合花茶黄酒酒精度的影响见图2。
图2 花茶体积比对复合花茶黄酒酒精度的影响
Fig.2 Effect of volume ratio of flower tea on alcohol content of flower-tea yellow rice wine
由图2 可知，复合花茶黄酒的酒精度随康乃馨添加量的减少呈现先上升后下降的趋势。当花茶体积比为3∶1 时，酒精度达到最高，为12.51%vol。康乃馨泡花茶浸出液甜味较浓，勿忘我花茶浸出液甜味较为薄弱、苦涩味稍浓，所以当康乃馨的添加量占据主导地位时，有利于微生物对糯米的利用，从而使发酵彻底，酒精的转化效率升高；而勿忘我的添加量过多时，苦涩味较重，甜味较少，所含黄酮类物质具有抑菌活性，抑制了微生物的生长[16]，所以导致对糯米的利用不充分，从而使酒精的转化效率降低。因此，选择花茶体积比4∶1、3∶1、2∶1 进行响应面优化试验。
2.1.3 发酵时间对复合花茶黄酒酒精度的影响
发酵时间对复合花茶黄酒酒精度的影响见图3。
图3 发酵时间对复合花茶黄酒酒精度的影响
Fig.3 Effect of fermentation time on the alcohol content of flowertea yellow rice wine
由图3 可知，随着发酵时间的延长，酒精度呈现出先上升后趋于平稳的态势。当发酵时间为9 d 时，酒精度已到最高点，达到12.30% vol。由于发酵时间过短，细菌处于增殖阶段，将糯米转变为酒精的效果有限[17]，所以酒精度最低；但由于发酵时间的延长，细菌不断增殖[18]、产量增加，从而能够大量地把糯米转变为酒，效率较高；然而随着发酵时间的不断延长，糯米中的营养基本已经消耗完全，酒精度也基本趋于稳定。因此，选择发酵时间8、9、10 d 进行响应面优化试验。
2.1.4 发酵温度对复合花茶黄酒酒精度的影响
发酵温度对复合花茶黄酒酒精度的影响见图4。
图4 发酵温度对复合花茶黄酒酒精度的影响
Fig.4 Effect of fermentation temperature on the alcohol content of flower-tea yellow rice wine
由图4 可知，随着发酵温度的升高，黄酒的酒精度呈现出先升高后降低的态势。当发酵温度未达到26 ℃时，随着发酵温度的升高，微生物不断增殖，整个体系产生酒精的能力随之增强，微生物体内产生酒精的酶活力也随之增强[19]；当发酵温度为26 ℃时，此时为微生物增殖的最佳温度，也是体内酶的最适温度，对糯米中糖的转化效果也相应最强，酒精度达到最大值，为12.43% vol；当发酵温度超过26 ℃以后，由于远离微生物群的最适温度，微生物的整体数量不再增长，产生酒精的酶活力也逐渐减弱，这时微生物对糯米中糖的转化效率减弱[20]，导致酒精度降低。因此，选择发酵温度23、26、29 ℃进行响应面优化试验。
2.2 复合花茶黄酒发酵条件的响应面优化试验
2.2.1 响应面设计及结果
根据中心组合试验设计原则，在单因素试验研究结果的基础上，进行响应面分析试验，试验设计与试验结果见表2。
表2 响应面设计及试验结果
Table 2 Design and results of response surface test
试验号B 花茶体积比C 发酵时间D 发酵温度1234567891 0 A 酒曲添加量-1 10000000-00-00001-11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 11010-111000010-1 1111010010-100100--1 100-1 001-1000-1-1-1-1-1 100-1000001-100100001 10001-0000-11000 10000-1011001-1 100-1 0-1 Y 酒精度/%vol 12.46±0.05 12.57±0.04 12.50±0.04 12.61±0.06 12.58±0.05 12.44±0.05 12.65±0.03 12.68±0.03 12.59±0.04 12.56±0.05 12.53±0.07 12.55±0.09 12.60±0.07 12.69±0.09 12.49±0.06 12.43±0.05 12.60±0.04 12.39±0.04 12.47±0.06 12.37±0.05 12.57±0.10 12.45±0.08 12.70±0.08 12.48±0.07 12.57±0.06 12.60±0.05 12.50±0.06 12.65±0.04 12.48±0.04
运用Design-Expert 8.0.6 软件对表2 试验数据进行多元回归拟合，得到以黄酒酒精度为响应值的回归方程：Y=12.67+0.041A+0.005 8B+0.014C+0.009 2D-0.077AB+0.018AC+0.042AD-0.070BC-0.010BD+0.050CD-0.11A²-0.047B²-0.082C²-0.080D²。
2.2.2 回归分析
方差分析结果见表3。
表3 方差分析结果
Table 3 Analysis of variance for the regression model
方差来源模型自由度14 ABCDA B显著性******AC AD平方和0.20 0.020 0.000 4 0.002 4 0.001 0 0.024 0.001 2 0.007 2 1111111均方0.015 0.020 0.000 4 0.002 4 0.001 0 0.024 0.001 2 0.007 2 F 值12.25 16.84 0.34 2.03 0.85 20.22 1.03 6.08 P 值＜0.000 1 0.001 1 0.567 1 0.176 5 0.372 6 0.000 5 0.327 2 0.027 2*
续表3 方差分析结果
Continue table 3 Analysis of variance for the regression model
注：*表示影响显著（P＜0.05）；**表示影响极显著（P＜0.01）。
方差来源BC BD CD自由度 显著性***A2 B2 C2 D2 F 值16.49 0.34 8.42 62.49 12.06 36.70 34.50 P 值0.001 2 0.571 0 0.011 6＜0.000 1 0.003 7＜0.000 1＜0.000 1********残差失拟项纯误差总和平方和0.020 0.000 4 0.010 0.074 0.014 0.044 0.041 0.017 0.015 0.002 1 0.22 11111111 4 10 4 28均方0.020 0.000 4 0.010 0.074 0.014 0.044 0.041 0.001 2 0.001 5 0.000 5 2.74 0.171 9
由表3 可知，回归项模型P＜0.000 1，说明该二次方程模型极显著，而失拟项P=0.171 9＞0.05，失拟项不突出，说明响应面试验结论和模型已拟合正确，有一定的统计学价值，即能够利用模型推断试验结论。方程决定系数R2=0.924 5，模型的拟合程度相对较高，可以用于对复合花茶黄酒酒精度的理论预测。根据F 值可得出影响复合花茶黄酒酒精度因素的主次顺序为酒曲添加量＞发酵时间＞发酵温度＞花茶体积比。由P 值可知，因素A 对花茶黄酒酒精度影响极显著（P＜0.01），因素B、C、D 对其影响不显著（P＞0.05）；AB、BC 交互作用对其影响极显著（P＜0.01），AD、CD 显著（P＜0.05），AC、BD 对其影响不显著（P＞0.05）；A²、B²、C²、D²极显著（P＜0.01）。回归方程很好地反映了各试验参数和响应值之间的相互作用，表明试验方法具有可行性。
2.2.3 因素间交互作用分析
响应曲面是对二元线性回归方程图像化的描述[21]，依据交互作用与响应值之间的关系，得到三维响应曲面和等高线，结果见图5～图8。
图5 酒曲添加量和花茶体积比的交互作用
Fig.5 Addition of distiller's yeast and volume ratio of flower tea on the alcohol content of flower-tea yellow rice wine
图6 花茶体积比和发酵时间的交互作用
Fig.6 Volume ratio of flower tea and fermentation time on the alcohol content of flower-tea yellow rice wine
图7 酒曲添加量和发酵温度的交互作用
Fig.7 Ddistiller's yeast and fermentation temperature on the alcohol content of flower-tea yellow rice wine
图8 发酵时间和发酵温度的交互作用
Fig.8 Fermentation time and fermentation temperature on the alcohol content of flower-tea yellow rice wine
利用软件Design-Expert 8.0.6 软件生成的三维响应面图能直观反映不同因素间交互作用对响应值的影响程度，响应面坡度越陡，表明两因素间交互作用越显著[22-23]，由图5～图8 可知，各因素间交互作用的反应平面曲线上均出现了极大值，表明这4 个试验因素间所选取的水平范围比较合理，能反映出AB、BC、AD、CD的交互作用对复合花茶黄酒酒精度的发展趋势。根据方差分析可以得知，酒曲添加量与花茶体积比、花茶体积比与发酵时间间的相互作用影响极显著（P＜0.01），说明对复合花茶黄酒酒精度存在极显著影响；酒曲添加量与发酵温度、发酵时间与发酵温度间交互作用显著（P＜0.05）。
2.2.4 复合花茶黄酒响应面试验结果分析
响应面数据分析可得，复合花茶黄酒的最佳工艺条件为酒曲添加量12.65%、花茶体积比3.13∶1、发酵时间9.17 d、发酵温度26.71 ℃，预测值为12.66%vol。
2.3 验证试验结果
虽通过回归模型预测了酒精度达到最大时的最优发酵条件，但是还需要进一步验证最优发酵条件的可行性和有效性[24]，调整响应面优化试验条件为酒曲添加量13%、花茶体积比3∶1、发酵时间9 d、发酵温度27 ℃，并进行3 次重复试验。结果表明，经单因素优化的花茶黄酒酒精度平均值为12.28% vol，经响应面优化的花茶黄酒酒精度平均值为12.75% vol，明显高于单因素优化条件下花茶黄酒的酒精度平均值，且与模型预测值相近，说明此模型有效[25]，优化后的复合花茶黄酒的发酵工艺可行。
2.4 复合花茶黄酒成品检测
2.4.1 感官指标评价结果
酒体呈黄褐色且透亮，澄清度较好，有光泽，无明显杂质，杯底有微量凝聚物。具有两种花茶的清香和黄酒独特的醇香，酒体入口后微苦，但回味甘甜，无异味。口感丰富，口味协调，有黄酒的典型风格。
2.4.2 理化指标测定结果
以酒精度、总糖及总酸为评价指标，酒精度为主要指标，得到的花茶黄酒总糖含量为8.6 g/L，酒精度为12.75%vol，总酸含量为3.6 g/L，符合GB/T 13662—2018《黄酒》[11]的标准。
2.4.3 微生物指标检测结果分析
微生物指标检测：菌落总数≤50 CFU/mL，大肠杆菌≤3 CFU/100 mL，致病菌未检出，符合GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》[12]及GB 29921—2021《食品安全国家标准 预包装食品中致病菌限量》[13]检测标准。
3 结论
选择两种花茶和糯米为主体原材料，通过液态法进行发酵，选取酒曲添加量、花茶体积比、发酵时间和发酵温度为主要影响因子，进行单因素及响应面试验优化发酵工艺，最后得出最佳工艺条件为酒曲添加量13%、花茶体积比3∶1、发酵时间9 d、发酵温度27 ℃，此条件下的验证试验所得花茶黄酒的酒精度12.75%vol，酒体为黄褐色，清亮透明，有光泽，具有花茶特有的浓郁醇香、醇和、爽口，具有黄酒品种的典型风格。对花茶黄酒进行微生物指标检测，最终结果显示，菌落总数≤50 CFU/mL，大肠杆菌≤3 CFU/100 mL，致病菌未检出。
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