南美白对虾因其生长速度快、适应性强、饵料要求低、肉质产量高、肉质美味等特点深受世界水产养殖和水产品市场的欢迎[1]。南美白对虾在加工或食用过程中会产生大量的下脚料，如虾头、虾壳等[2]。部分虾加工下脚料被当作垃圾丢弃或填埋，造成资源浪费、环境负担和经济损失。虾加工下脚料主要由外骨骼和头胸部组成，占其总鲜重的50% 至70%，含有各种较高生物学价值的生物活性肽，如抗菌肽[3]、降压肽[4]、降糖肽[5]等。以酶解法作用于虾加工下脚料，分离提取回收其中的营养物质及生物活性物质的相关研究日益受到重视。
高血压是一种以动脉收缩压或舒张压升高为特征的临床综合征，是普遍的心血管疾病的危险因素之一，世界范围内高血压的平均患病率为15%～20%[6]。血管紧张素转化酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）是高血压发病机制中的关键蛋白靶标，能够促进血管收缩，抑制血管舒张，引起人体形成高血压。故通过抑制ACE 活性，降低血管紧张素Ⅱ的形成并阻碍缓激肽的降解，可达到降低血压的作用。抗高血压药物如卡托普利、贝那普利等可能引起咳嗽、血管性水肿、肾功能损害、味觉丧失等副作用[7]。而食物来源的ACE 抑制肽具有高生物活性、低毒性、易在人体内代谢等优点。近年来，已从蔬菜[8]、肉类[9]、海鲜[10]和乳制品[11]等各种食物蛋白中鉴定出约900 种ACE 抑制肽[12]。例如，Song 等[13]从发酵乳中提取的两种序列分别为VPP和IPP 的ACE 抑制肽具有特殊的降压作用，其降压效果已被广泛研究和证实；Zhou 等[14]用木瓜蛋白酶水解日本囊对虾虾头，其酶解液具有明显的ACE 抑制活性，进一步分离肽段得到的ARL/I 肽的ACE 半抑制浓度（50% inhibitory concentration，IC50）为125.58 μmol/L。
酶解法是ACE 抑制肽的常见提取方法，目前多数采用单酶水解的方式，但得到的ACE 抑制肽的抑制效果有限，复合酶作用于虾类蛋白能够有助于提高水解产物的抑制活性。以南美白对虾虾头为原料，取动、植物和微生物来源的共11 种蛋白酶进行单酶及复合酶筛选，以水解度和ACE 抑制率作为测定指标，从复合酶种类筛选和配比、酶添加量、料液比、酶解时间、酶解温度、初始pH 值等方面进行单因素及响应面酶解工艺的优化，以获得虾头蛋白源ACE 抑制肽制备的最优工艺，以期为虾头蛋白制备ACE 抑制肽的研发和对虾加工副产物资源利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
南美白对虾虾头：广西北海正五有限公司，清洗沥干放于-20 ℃冰箱保存；血管紧张素转化酶（ACE）（≥2.0 U/mg）、马尿酰-组胺酰-亮氨酸（hippuryl-histamine-leucine，HHL）：美国Sigma 公司；中性蛋白酶（100 U/mg）、风味蛋白酶（150 U/mg）、木瓜蛋白酶（200 U/mg）、碱性蛋白酶（200 U/mg）：上海麦克林生化科技有限公司；α-糜蛋白酶（1 200 U/mg）、菠萝蛋白酶（600 U/mg）、蛋白酶K（30 U/mg）、枯草杆菌蛋白酶（150 U/mg）、复合蛋白酶（100 U/mg）、胃蛋白酶（30 U/mg）、胰蛋白酶（40 U/mg）：北京索莱宝科技有限公司；硫酸铜、氯化钠：成都金山化学试剂有限公司；三氯乙酸、乙酸乙酯、甘氨酸、茚三酮、碘酸钾、盐酸、氢氧化钠、硼酸、四硼酸钠：天津市大茂化学试剂厂。所用试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
分析天平（BS-600L）：北京赛多利斯科学仪器有限公司；料理机（JYL-A010）：九阳股份有限公司；离心机（CR21N）：尚仪科学仪器（绍兴）有限公司；水浴锅（HHS）：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；pH 计（PHS-3BW）：上海殷特仪器制造有限公司；马弗炉（SX-2-2.5-10）：余姚金电仪表有限公司；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9023A）：上海齐欣科学仪器有限公司；脂肪测定仪（SZF-06A）：青岛精诚仪器仪表有限公司；紫外-可见分光光度计（SH-6600）：江苏盛奥华环保科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 虾头酶解上清液制备工艺
从冰箱中取出虾头解冻，虾头和水按一定比例破碎混匀，80 ℃水浴20 min 使虾头内源酶失活，依据各蛋白酶最适pH 值调节酸碱度，按固定酶活加入各蛋白酶，在最适温度下水浴反应一定时间将虾头充分酶解。酶解反应结束后，用沸水浴20 min 将酶解液进行灭酶处理，冷却至室温后用HCl 溶液、NaOH 溶液将pH 值调至7.5，8 000 r/min 离心10 min，取上清液测定水解度和ACE 抑制率。
1.3.2 蛋白水解度（degree of hydrolysis，DH）测定
参照罗艳华等[15]的方法进行改进。绘制甘氨酸标准曲线：配制浓度为0‰、1‰、2‰、3‰、4‰、5‰ 的甘氨酸标准溶液。用无水乙醇配制0.5 ‰的茚三酮溶液。取0.1 g 碘酸钾于30 mL 蒸馏水后加入20 mL 无水乙醇混合，配制2‰的碘酸钾溶液。各取1 mL 上述6 组标准溶液，依次加入1 mL pH6.8 的乙酸钠-乙酸缓冲液、1 mL 茚三酮溶液，混合均匀后于沸水浴中加热15 min，之后取出冷却。上述过程结束后，分别加入5 mL碘酸钾溶液，加蒸馏水定容至10 mL。将0 号比色管作为空白调零，紫外可见分光光度计568 nm 依次测出各组样品的吸光度，绘制甘氨酸标准曲线。
虾头酶解后得到的上清液稀释100 倍并取1 mL，按照上述显色方法依次测定吸光度，并根据甘氨酸标准曲线按下列公式计算出水解度（D，%）。
D=（A1-A2）/A1×100
式中：A1 为虾头匀浆的蛋白质含量，g；A2 为虾头匀浆酶解液蛋白质含量，g。
1.3.3 ACE 抑制活性测定
参照Cushman 等[16]的方法进行改进。将酶解上清液样品加入ACE-HHL 反应体系中，测定生成的马尿酸含量，即可定量样品的ACE 体外抑制活性。
具体方法：预先采用硼酸缓冲液（pH8.3）将底物HHL 稀释至5 mmol/L。10 mL 离心管中加入ACE 和酶解液各15 μL，37 ℃水浴5 min，加入75 μL HHL，37 ℃水浴45 min 后，加入1 mol/L HCl 终止反应；然后加入0.7 mL 乙酸乙酯萃取生成的马尿酸，设置4 000 r/min转速进行10 min 的离心，取上部乙酸乙酯萃取层0.5 mL 放入离心管中，在120 ℃电热恒温鼓风干燥箱中挥发完全；取出冷却后加入4 mL 去离子水，涡旋混匀后于波长228 nm 处测定吸光度。空白对照预先用1 mol/L 的盐酸抑制ACE 的活性；全反应对照不添加任何ACE 抑制剂，使得ACE 与HHL 正常充分反应。每组均做3 个平行试验，ACE 抑制率（X，%）计算公式如下。
X=（C-S）/（C-B）×100
式中：C 为全反应对照的吸光度；S 为试验组的吸光度；B 为空白对照组的吸光度。
1.3.4 单酶筛选
选用11 种蛋白酶分别制备虾头蛋白酶解液，固定料液比（虾头∶水）1∶7（g/mL）、酶活力400 U/g、酶解时间2 h，虾头蛋白水解最适pH 值和最适温度见表1，以ACE 抑制率和水解度为指标对虾头酶解上清液进行测定，确定水解效果较好的蛋白酶。
表1 各类蛋白酶最适酶解条件
Table 1 Optimum enzymatic hydrolysis for various proteases
蛋白酶种类胃蛋白酶木瓜蛋白酶胰蛋白酶α-糜蛋白酶蛋白酶K中性蛋白酶菠萝蛋白酶复合蛋白酶枯草杆菌蛋白酶碱性蛋白酶风味蛋白酶最适pH 值2.0 7.0 8.0 8.0 8.0 7.0 6.5 8.0 8.5 9.0 7.0最适温度/℃37 55 37 50 55 55 40 55 50 50 60
1.3.5 复合酶筛选
根据单酶筛选结果，选用4 种酶解效果较好的蛋白酶分别以不同的两两组合方式制备虾头蛋白酶解液，固定复合酶配比1∶1（U/U）、酶活力400 U/g、料液比1∶7（g/mL）、酶解时间2 h，水解虾头蛋白pH 值和温度见表2，以ACE 抑制率和水解度为指标对虾头酶解上清液进行测定，筛选出水解效果较好的复合酶。
表2 不同复合酶酶解条件
Table 2 Enzymatic hydrolysis conditions for different complex enzymes
酶种类碱性蛋白酶+胰蛋白酶碱性蛋白酶+风味蛋白酶碱性蛋白酶+α-糜蛋白酶胰蛋白酶+α-糜蛋白酶胰蛋白酶+风味蛋白酶风味蛋白酶+α-糜蛋白酶最适pH 值8.5 8.0 8.5 8.0 7.5 7.5最适温度/℃45 55 50 45 45 55
1.3.6 酶添加量的确定
固定复合酶配比1∶1（U/U）、料液比1∶7（g/mL）、酶解时间2 h，设定总酶添加量分别为300、350、400、450、500 U/g 水解虾头蛋白，测定酶解液ACE 抑制率及水解度。
1.3.7 单因素试验
以ACE 抑制率及蛋白水解度为指标，在料液比1∶3、1∶5、1∶7、1∶9、1∶12（g/mL），初始pH 值为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，酶解温度35、40、45、50、55 min，复合酶（胰蛋白酶∶风味蛋白酶）配比1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1（U/U），酶解时间1、2、3、4、5 h 的条件下分别进行单因素试验，考察料液比、酶解时间、酶解温度、初始pH 值及复合酶配比对ACE 抑制率和水解度的影响，确定单因素试验的最佳条件。每个试验做3 次重复，取平均值。
1.3.8 响应面试验设计
基于单因素试验结果，选用其中对响应值影响较大的4 个因素（酶解时间、初始pH 值、酶解温度、复合酶配比）进行响应面优化试验，以ACE 抑制率为响应值，设置四因素三水平响应面试验，考察不同酶解工艺条件对虾头蛋白酶解液ACE 抑制活性的影响，并优化最佳酶解工艺。响应面试验因素与水平见表3。
表3 响应面试验因素与水平
Table 3 Factors and levels of response surface test
水平因素A 酶解时间/h-1 01 123 B 初始pH 值7.0 7.5 8.0 C 酶解温度/℃40 45 50 D 复合酶配比/（U/U）1∶1 2∶1 3∶1
1.4 数据处理
选取3 次平行试验的平均值作为试验数据，使用SPSS 26.0、Origin 8、Design-Expert 8.0.6 软件进行数据处理及回归方程的拟合，并对数据模型进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 水解度测定标准曲线
以甘氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标进行标准曲线的绘制。水解度标准曲线如图1 所示。
图1 水解度标准曲线
Fig.1 Standard curve of hydrolysis degree
由图1 可知，水解度标准曲线回归方程为y=0.083 4x+0.023 2，R²=0.992 4，在1×10-5～5×10-5 g/mL 范围内线性关系良好，可用于后续水解度的测定。
2.2 最适蛋白酶的筛选
2.2.1 单酶筛选
由于不同蛋白酶的切割位点不同，得到的水解度和ACE 抑制率不同，因此本试验选用多种动物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶等不同来源的蛋白酶进行单酶筛选，以探究各类蛋白酶的酶解效果，11 种蛋白酶水解南美白对虾虾头的酶解效果如图2 所示。
图2 蛋白酶酶解后的ACE 抑制率及水解度
Fig.2 ACE inhibition rate and hydrolysis degree of protease after enzymatic hydrolysis
不同小写字母表示存在显著差异（P＜0.05）。
由图2 可知，碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、α-糜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、风味蛋白酶的ACE 抑制率较高，均在50% 以上；碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、风味蛋白酶的水解度较高，均在15% 以上。中性蛋白酶的ACE 抑制率较高但水解度较低（10.25%），木瓜蛋白酶的水解度较高但ACE 抑制率较低（11.25%）。在相同酶活的条件下，酶解产物ACE 抑制率的差异可能是由于不同蛋白酶具有不同的特异性，水解出的肽段活性位点不同而造成的。Sun等[17]以黄斑海蜇为原料，经胰蛋白酶水解后所得的酶解产物ACE 抑制活性最强。而水解度的差异取决于酶切位点和虾头底物的结合能力，也会依据各蛋白酶最适水解条件不同，受到温度、酸碱度的影响。综上，选取碱性蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、α-糜蛋白酶4 种蛋白酶参与复合酶的筛选。
2.2.2 复合酶筛选
将单酶筛选出的碱性蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、α-糜蛋白酶分别以1∶1（U/U）的配比两两组合对虾头进行水解，酶解效果如图3 所示。
图3 复合酶酶解后的ACE 抑制率及水解度
Fig.3 ACE inhibition rate and hydrolysis degree after enzymatic hydrolysis of complex enzyme
不同小写字母表示存在显著差异（P＜0.05）。
由图3 可知，不同蛋白酶组合得到的酶解液ACE抑制率和水解度均高于单酶酶解效果，其中胰蛋白酶和风味蛋白酶组合的ACE 抑制率最高达75.25%；碱性蛋白酶和风味蛋白酶组合次之，为71.50%；胰蛋白酶和α-糜蛋白酶组合水解度最高达52.47%，胰蛋白酶和风味蛋白酶组合次之，为52.45%。
目前有关水产品复合酶解法制备ACE 抑制肽的研究较少，李佳伶等[18]在分步酶解法制备鮰鱼蛋白ACE 抑制肽的研究中，胰蛋白酶和风味蛋白酶复合酶解虾头肽混合物ACE 抑制活性最高，这可能是因为胰蛋白酶优先裂解蛋白中的Arg、Lys，从而得到C 末端为Arg、Lys 的肽段。侯成杰等[19]的研究发现，肽段C末端的Arg、Lys 有助于提高ACE 抑制率。而采用含有风味蛋白酶作为复合酶有效成分制备ACE 抑制肽的研究尚未发现。风味蛋白酶是一种从米曲霉中提取的肽酶，Ghassem 等[20]研究发现，风味蛋白酶具有3 种内肽酶以及2 种氨肽酶、2 种二肽基肽酶和1 种淀粉酶等其他酶的活性。风味蛋白酶由于其同时具有内切、外切多个不同酶切位点的特性，能够高效快速的将蛋白分解为不同形式的小肽，在水解过程中可能暴露更多具有胰蛋白酶酶切位点的肽段，使得ACE 抑制肽种类数量增多，活性增强，从而体现出较高的水解度及较好的ACE 抑制活性。Wang 等[21]在复合酶酶解双胞菇ACE 抑制肽的研究中，得到的蛋白酶解液ACE 抑制率为65.12%。Lu 等[22]用复合酶对芝麻蛋白进行水解，得到的酶解液多肽得率达（93.96±0.35）%，ACE 抑制活性达98.10%。综上，选择胰蛋白酶和风味蛋白酶作为酶解虾头蛋白的最适复合蛋白酶进行后续试验。
2.2.3 酶添加量筛选
不同酶添加量的ACE 抑制率及水解度如图4 所示。
图4 不同酶添加量对ACE 抑制率及水解度的影响
Fig.4 Effect of different enzyme dosages on ACE inhibition rate and hydrolysis degree
不同小写字母表示存在显著差异（P＜0.05）。
由图4 可知，ACE 抑制率和水解度随酶添加量的增加均呈现先上升后下降的趋势。酶添加量为400 U/g时，水解度为77.53%，ACE 抑制率为83.13%，均达到最大值。在此之后随酶添加量增多，水解度趋于稳定后迅速下降，这可能是由于酶添加量过高时，溶液中酶与底物之间的活性位点达到饱和[23]；也可能是因为风味蛋白酶复杂的酶切位点使肽段进一步水解成无ACE 抑制活性的小肽或游离的氨基酸。因此，酶添加量过多影响了水解过程的效果。李爽等[24]用碱性蛋白酶水解南极磷虾制备ACE 抑制肽，加酶量在1.5%时，酶解产物的ACE 抑制率与水解度均处于最优水平，ACE 抑制率达68.49%。综上，选择400 U/g 作为酶解过程的最适酶添加量。
2.3 单因素试验结果
2.3.1 料液比对酶解效果的影响
料液比对酶解效果的影响如图5 所示。
图5 不同料液比对ACE 抑制率及水解度的影响
Fig.5 Effect of different solid-liquid ratios on ACE inhibition rate and hydrolysis degree
不同小写字母表示存在显著差异（P＜0.05）。
由图5 可知，料液比为1∶3～1∶12（g/mL）时，随溶剂添加量增加，水解度呈先上升后下降的趋势，在料液比1∶7（g/mL）时，水解度达到最大，为58.15%。在料液比1∶3～1∶7（g/mL）时ACE 抑制率呈上升趋势，在1∶7（g/mL）达最高74.86%，后随溶剂添加量增加，ACE 抑制活性缓慢下降，此时料液比改变对ACE 抑制率无显著影响（P＞0.05）。反应体系过于黏稠会导致酶与底物接触速度较慢，酶解效果不完全，导致ACE 抑制率和水解度均偏低。因此酶解虾头最佳料液比为1∶7（g/mL）。
2.3.2 酶解时间对酶解效果的影响
酶解时间对酶解效果的影响如图6 所示。
图6 不同酶解时间对ACE 抑制率及水解度的影响
Fig.6 Effect of different enzymatic hydrolysis time on ACE inhibition rate and hydrolysis degree
不同小写字母表示存在显著差异（P＜0.05）。
由图6 可知，随酶解时间的延长，ACE 抑制率先升高后下降，在2 h 时达到最高值80.13%。水解度在2 h 后变化不明显，酶解时间为3 h 时，达到最大值54.19%。酶解时间过长可能导致已经分离出的肽段被进一步分解，进而影响酶解产物的ACE 抑制活性。综上，选择酶解时间1、2、3 h 进行后续试验。
2.3.3 初始pH 值对酶解效果的影响
初始pH 值对酶解效果的影响如图7 所示。
图7 不同初始pH 值对ACE 抑制率及水解度的影响
Fig.7 Effect of different initial pH values on ACE inhibition rate and hydrolysis degree
不同小写字母表示存在显著差异（P＜0.05）。
由图7 可知，随着初始pH 值的增加，水解度和ACE 抑制活性均呈现出先增加后减小的趋势。在pH7.5 时水解度为69.11%，ACE 抑制率为83.00%，均达到最大值。过酸或过碱的溶液环境均会影响虾头蛋白及蛋白酶的活性，使水解度和ACE 抑制活性降低。综上，选择初始pH 值为7.0、7.5、8.0 进行后续试验。
2.3.4 酶解温度对酶解效果的影响
酶解温度对酶解效果的影响如图8 所示。
图8 不同酶解温度对ACE 抑制率及水解度的影响
Fig.8 Effect of different enzymatic hydrolysis temperatures on ACE inhibition rate and hydrolysis degree
不同小写字母表示存在显著差异（P＜0.05）。
由图8 可知，随着酶解反应体系温度的上升，ACE抑制率在35～45 ℃范围内呈上升趋势，在45 ℃达最大值83.13%；在45 ℃以上时，ACE 抑制率随温度变化趋势不明显。水解度随酶解温度的上升呈先升高后下降的趋势，在酶解温度为50 ℃时达到最大值68.55%。过低的酶解温度会降低蛋白酶的酶解速率，过高的酶解温度会使蛋白酶的酶活力降低，高温也会导致蛋白酶失活。综上，选择酶解温度40、45、50 ℃进行后续试验。
2.3.5 复合酶配比对酶解效果的影响
复合酶与单酶水解相比，能够大大提高水解效率，由胰蛋白酶和风味蛋白酶组合的复合酶在水解度和ACE 抑制活性方面均高于单酶水解效果。复合酶配比对酶解效果的影响如图9 所示。
图9 不同复合酶配比对ACE 抑制率及水解度的影响
Fig.9 Effect of different complex enzyme ratios on ACE inhibition rate and hydrolysis degree
不同小写字母表示存在显著差异（P＜0.05）。
由图9 可知，不同复合酶配比对ACE 抑制率影响不明显，复合酶配比为1∶3～1∶2（U/U）时，水解度变化不明显。随着胰蛋白酶的比例增加，水解度逐渐上升，在3∶1（U/U）时抑制率达到最大68.70%，而ACE 抑制率在2∶1（U/U）时达到最高84.25%。综上，选择复合酶配比1∶1、2∶1、3∶1（U/U）进行后续试验。
2.4 响应面优化试验
基于单因素试验的数据分析结果，选取酶解时间（A）、初始pH 值（B）、酶解温度（C）和复合酶配比（D）为考察因素，以ACE 抑制率（Y）为响应值，进行四因素三水平的响应面优化试验，试验结果如表4 所示，方差分析结果如表5 所示。
表4 响应面设计试验结果
Table 4 Results of response surface design test
编号C 酶解温度D 复合酶配比1234567891 0 A 酶解时间-1 1-1 B 初始pH 值-1-1 10000-0000-11-0000-1-1 11-1-1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 11-110000-1100000000-11-110000-1-1 11-11-1-1 110 110000-1 110 1100000000-1 Y ACE 抑制率/%73.65 69.38 63.63 71.57 70.13 65.63 68.13 75.02 73.63 64.63 66.88 78.88 71.88 71.25 75.38 68.38 69.13 69.38 69.56 73.25 72.13
续表4 响应面设计试验结果
Continue table 4 Results of response surface design test
编号22 23 24 25 26 27 28 29 A 酶解时间C 酶解温度00000000 B 初始pH 值1-1 D 复合酶配比-1 100000 00000000 1100000 Y ACE 抑制率/%66.25 74.55 75.62 82.22 83.25 82.63 83.88 82.25
表5 回归模型与方差分析
Table 5 Regression model and analysis of variance
注：***表示影响高度显著（P＜0.001）；**表示影响极显著（P＜0.01）；*表示影响显著（P＜0.05）。
方差来源模型A 酶解时间B 初始pH 值C 酶解温度D 复合酶配比AB AC AD BC BD CD A2 B2 C2 D2残差失拟项纯误差总和平方和926.24 9.39 34.19 4.48 59.37 37.36 2.96 110.25 10.16 12.06 32.47 293.30 193.41 255.89 213.41 23.09 21.07 2.01 949.33自由度14.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 14.00 10.00 4.00 28.00均方66.16 9.39 34.19 4.48 59.37 37.36 2.96 110.25 10.16 12.06 32.47 293.30 193.41 255.89 213.41 1.65 2.11 0.50 F 值40.12 5.69 20.73 2.72 36.00 22.65 1.79 66.86 6.16 7.31 19.69 177.85 117.29 155.17 129.41 P 值＜0.000 1 0.031 7 0.000 5 0.121 6＜0.000 1 0.000 3 0.201 8＜0.000 1 0.026 4 0.017 1 0.000 6＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1显著性******************************4.19 0.090 1
由表5 可知，响应面回归模型差异高度显著（P＜0.000 1），该模型的相关系数R2=0.975 7，表明响应面97.57% 的变化与所选因素相关，校正决定系数为R2Adj =0.951 4，表明模型的预测值与实际响应值的拟合程度为95.14%。失拟项P=0.090 1＞0.05 表明模型失拟项不显著。信噪比=20.626 6＞4，表明该回归方程的可信度较高。变异系数CV 值为1.76%＜10%，模型的置信度较高。结合F 值进行分析，得出4 个因素对ACE 抑制率的影响大小顺序为复合酶配比＞初始pH值＞酶解时间＞酶解温度。该模型的拟合程度和可信度较高，建立的模型能够预测复合酶解法制备虾头蛋白源ACE 抑制肽的最佳工艺条件。
通过Design-Expert 8.0.6 对以上试验数据进行模型拟合，得到的二次多项式回归方程如下。
根据Design-Expert 8.0.6 软件分析各因素间的交互作用对ACE 抑制率的影响，得到三维响应面图及对应的等高线图如图10 所示。
图10 各试验因素交互作用的三维响应面及等高线
Fig.10 Three-dimensional response surface and contour map of interaction among test factors
由图10 可知，AB、AD、BC、BD、CD 的等高线均呈现椭圆形，两因素之间具有较强的交互作用，AC 的等高线接近圆形，两因素间交互作用较弱。AB、AD 的响应曲面坡度较大，等高线较密集，说明酶解时间与初始pH 值、酶解时间与复合酶配比的交互作用对ACE 抑制率的影响较大，AC 的响应曲面坡度相对较平缓，等高线较稀疏，说明酶解时间与酶解温度交互作用对ACE 抑制率的影响较小。
通过Design-Expert 8.0.6 软件分析及预测，根据回归方程求得模型极值点，确定最佳酶解工艺条件为酶解时间2.17 h、初始pH7.46、酶解温度45.68 ℃、复合酶（胰蛋白酶∶风味蛋白酶）配比2.29∶1（U/U），在此工艺条件下得到的ACE 抑制率预测值为83.357%，可信度0.974。
2.5 验证优化结果
为使得试验可行，将各因素条件调整为酶解时间2.17 h、初始pH7.5、酶解温度46 ℃、复合酶配比2.29∶1（U/U），进行3 次平行验证试验，在此条件下得出ACE 抑制率的平均值为83.57%，与预测值相似，说明模型对试验结果的分析预测准确，重复效果较好。
3 结论
采用胰蛋白酶和风味蛋白酶进行双酶复合酶解制备南美白对虾虾头ACE 抑制肽，并对酶解工艺进行优化。以ACE 抑制率和水解度为指标，通过单因素及响应面优化试验，最终确定最佳酶解工艺条件为料液比1∶7（g/mL）、酶添加量400 U/g、初始pH7.5、酶解温度45.68 ℃、复合酶（胰蛋白酶∶风味蛋白酶）配比2.29∶1（U/U）、酶解时间2.17 h，在此条件下水解度达71.48%，ACE 抑制率达83.57%。与工艺优化前的单酶水解相比，酶解效率提高了35.05%。本研究证实虾头蛋白经胰蛋白酶和风味蛋白酶复合酶解后的产物具有较高的ACE 抑制活性，此方法可作为开发食源性ACE 抑制肽的来源，促进对虾加工下脚料的综合利用，并为虾头水解产物ACE 抑制肽进一步分离纯化及作用机制研究提供参考。
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