膳食纤维是一种不能在小肠中被吸收，但易被结肠中的微生物群发酵的多糖，也被称为“第七种重要营养素[1]”。膳食纤维可以调节肠道菌群平衡[2-3]，降低心血管疾病、2 型糖尿病[4]和肠道疾病[5-6]的发病率。摄入膳食纤维在控制糖尿病、改善胰岛素敏感性、减少体重增加和减少心血管疾病[7]等方面起重要作用。此外，高持油力[8]的膳食纤维可用于稳定食物乳液，减少脂肪在胃肠道中的消化和吸收。
芦苇笋是芦苇的幼茎，芦苇笋一般指沅江芦笋，又叫做“南荻笋”，沅江是我国最大的芦笋产地之一。芦苇笋（Miscanthus lutarioriparius）是一种具有多种生物活性的多年生无性繁殖的草本植物，也是一种品质优良、营养丰富、纯天然无污染的野生植物资源，是我国的特有种属[9]。据数据调查[10]，沅江区域芦笋年产量35～40 万t，居于我国各芦笋产地区域之首。此外，我国芦笋在全球芦笋贸易中占有重要地位。因芦苇笋作为草本植物资源具有很高的开发价值和综合利用价值，国内外对芦苇笋的研究逐渐增多。
芦苇笋是膳食纤维的良好来源，其含有高含量的果胶、纤维素和木质素。经文献查阅，目前有关沅江芦笋的试验研究很少，但有关膳食纤维提取工艺优化的研究[11-13]很多，因此有很多试验方法可供研究。目前常用的膳食纤维提取方法[14]有物理法、化学法、酶法和联合法等。物理法在早期多指浸提法，现一般是指采用粉碎、挤压[15]、蒸煮、超声波、微波[16]及亚临界[17]等物理手段对膳食纤维进行提取的方法。物理法[18]具有操作简便，试验用时短，能得到纯度较高的产物等优点，但具有仪器价格设备昂贵、维修耗时、维修费贵等缺点。化学法主要包括水提取法、酸提取法、碱提取法和絮凝剂提取法[19]。化学法[20]具有操作简单、制备成本低的优点，但酸萃取和碱萃取存在化学结构破坏、溶剂残留和环境污染等缺点。比起化学法，酶法具有更多的优点，比如提取效率高、对环境更友好等，但存在提取工艺复杂、提取时间长、对温度和pH 值条件要求严格等缺点。随研究技术进一步的发展，超声波、微波、超临界等技术越来越成熟，采用辅助联合法对产品进行提取工艺优化研究颇具优势，且多种方法联合在同等试验研究条件下使得膳食纤维提取得率有明显提升，理化性质品质更为优良。例如，Wang 等[21]通过酸提取法和酶法提取法获得的猕猴桃膳食纤维比碱提法所得膳食纤维具有更高的持油能力和持水能力。
联合法与单一法相比具有更大的优势，可以弥补单一法的不足。联合法能使得膳食纤维提取得率提升，纯度更优。本试验采用超声辅助酶法对沅江芦笋中的膳食纤维提取工艺进行优化，通过试验结果分析，得到最佳提取工艺，以期为芦笋膳食纤维在食品工业中的广泛应用提供理论与数据指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
沅江芦笋粉：湖南博大天能实业股份有限公司。
柠檬酸钠（分析纯）：湖南国伦美生物科技有限公司；氢氧化钠、苯酚、浓硫酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；α-淀粉酶（食品级，≥4 000 U/g）：上海瑞永生物科技有限公司；糖化酶（食品级，≥50 000 U/g）：广西南宁庞博生物工程有限公司；中性蛋白酶（食品级，≥50 000 U/g）：河南郑州新仰韶生生物酶制剂有限公司。
1.2 仪器与设备
电热恒温水浴锅（DZKW）：北京市光明医疗仪器厂；数控超声波清洗器（KQ-250DE）：昆山市超声仪器有限公司；微波炉（M1-211A）：广东美的电器制造有限公司；予华牌循环水式真空泵（SHZ-DⅢ）：巩义市予华仪器有限责任公司；湘仪离心机（TGL-16M）：长沙湘仪离心机仪器有限公司；紫外可见分光光度计（UV-1801）：北京北分瑞利分析仪器有限责任公司；医用低温保存箱（MDF-86V408）：安徽中科都菱商用电器股份有限公司；冷冻干燥机（LGJ-25E）：四环福瑞科仪科技发展（北京）有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 提取工艺流程
沅江芦笋粉→恒温提取、调pH 值至中性→控温超声处理→加入α-淀粉酶、糖化酶、中性蛋白酶→恒温水浴酶解→高温灭酶→冷却→真空抽滤→洗涤残渣→二次抽滤→离心→醇沉→离心→透析→测定→冷冻干燥→芦笋可溶性膳食纤维。
1.3.2 操作要点
1）提取：以一定料液比向沅江芦笋粉中加入0.1 mol/L柠檬酸钠溶液，在60 ℃条件下恒温提取2 h。2）调pH值：用柠檬酸钠缓冲液调节pH 值至中性。3）控温超声处理：在40 ℃、150 W 处理20 min。4）加入α-淀粉酶、糖化酶、中性蛋白酶，加酶量分别为60、100、200 U/mL。5）恒温水浴酶解：55 ℃酶解3 h。6）高温灭酶：微波灭酶至沸腾。7）冷却：冷却至55 ℃。8）醇沉：加入4 倍体积的95% 乙醇醇沉。9）离心：保持平衡，10 000 r/min，4 ℃下5 min。10）透析：使用8 000～14 000 Da 透析袋，在4 ℃下透析36 h，除去单糖。11）冷冻干燥：将样品于-80 ℃预冷30 min 并在-40 ℃、50 Pa 的条件下进行真空冷冻干燥，得到干燥粉末，保藏备用。
1.3.3 可溶性膳食纤维的测定
1.3.3.1 标准曲线的制作
参考刘秀凤等[22]的方法，采用苯酚-硫酸法进行测定（标品为葡萄糖标准溶液），绘制标准曲线。经线性回归分析得葡萄糖标准曲线的回归方程：y=4.245 2x+0.009 4（R2=0.991 4），式中：x 为葡萄糖浓度，mg/mL；y为吸光度。
1.3.3.2 沅江芦笋可溶性膳食纤维的测定
吸取1.0 mL 透析后的待测样液，测定样液于490 nm处的吸光度，按下列公式计算沅江芦笋可溶性膳食纤维提取得率。
式中：Y 为沅江芦笋膳食纤维提取得率，%；x 为沅江芦笋膳食纤维样液中的葡萄糖浓度，mg/mL；D 为稀释倍数；W 为样品质量，g。
1.3.4 可溶性膳食纤维提取条件优化
1.3.4.1 酶的不同处理方式对可溶性膳食纤维提取得率影响
精确称取0.5 g 样品3 份，在1.3.1 工艺流程下，按以下3 种方式进行酶处理，考察不同的酶处理方式对可溶性膳食纤维提取得率的影响。具体处理方式见表1。
表1 3 种不同的酶处理方式
Table 1 Three different enzyme treatments
酶处理方式A B C步骤先加入α-淀粉酶于55 ℃条件下恒温水浴酶解2 h，再加入糖化酶于60 ℃条件下恒温水浴酶解1.5 h，最后加入中性蛋白酶于50 ℃条件下恒温水浴酶解3 h同时加入α-淀粉酶和糖化酶于57.5 ℃条件下恒温水浴酶解2 h，再加入中性蛋白酶于50 ℃条件下恒温水浴酶解3 h同时加入α-淀粉酶、糖化酶和中性蛋白酶于55 ℃条件下恒温水浴酶解3 h
1.3.4.2 α-淀粉酶与糖化酶质量比对可溶性膳食纤维提取得率影响
精确称取0.5 g 样品，在1.3.1 工艺流程下，考察α-淀粉酶与糖化酶质量比（3∶5、4∶5、5∶5、6∶5、5∶3、5∶4）对可溶性膳食纤维提取得率的影响。
1.3.4.3 浸提时间对可溶性膳食纤维提取得率影响
精确称取0.5 g 样品，在1.3.1 工艺流程下，考察浸提时间（1、2、3、4、5 h）对可溶性膳食纤维提取得率的影响。
1.3.4.4 超声功率对可溶性膳食纤维提取得率影响
精确称取0.5 g 样品，在1.3.1 工艺流程下，考察超声功率（100、150、200、250 W）对可溶性膳食纤维提取得率的影响。
1.3.4.5 超声温度对可溶性膳食纤维提取得率影响
精确称取0.5 g 样品，在1.3.1 工艺流程下，考察超声温度（20、30、40、50、60 ℃）对可溶性膳食纤维提取得率的影响。
1.3.4.6 料液比对可溶性膳食纤维提取得率影响
精确称取0.5 g 样品，在1.3.1 工艺流程下，考察料液比[1∶20、1∶50、1∶100、1∶150、1∶200（g/mL）]对可溶性膳食纤维提取得率的影响。
1.3.4.7 最佳工艺确定
根据单因素试验结果分析，以料液比、浸提时间和α-淀粉酶与糖化酶质量比设计三因素三水平的正交试验，因素和水平见表2。
表2 正交试验因素和水平设计
Table 2 Factors and levels in the orthogonal design
因素水平C 浸提时间/h 123 A α-淀粉酶与糖化酶质量比3∶5 4∶5 5∶5 B 料液比/（g/mL）1∶100 1∶150 1∶200 345
1.4 数据分析
通过SPSS 软件分析试验数据，使用Origin 2022软件作图。
2 结果与分析
2.1 酶的不同处理方式对可溶性膳食纤维提取得率影响
酶的不同处理方式对沅江芦笋可溶性膳食纤维提取得率影响见图1。
图1 酶的不同处理方式对沅江芦笋可溶性膳食纤维提取得率的影响
Fig.1 Effects of different enzyme treatment methods on the yield of soluble dietary fiber extracted from Miscanthus lutarioriparius
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
从图1 中可以看出，按A 方式酶处理（α-淀粉酶→糖化酶→中性蛋白酶），可溶性膳食纤维提取得率最低；按C 方式酶处理（α-淀粉酶、糖化酶、中性蛋白酶），可溶性膳食纤维提取得率最高。故最佳的酶处理方式为C 方式。推测原因是C 方式中，3 种酶的作用时间最长，淀粉、蛋白等杂质降解较为彻底，促进了可溶性膳食纤维的溶出。
2.2 α-淀粉酶与糖化酶质量比对可溶性膳食纤维提取得率影响结果
α-淀粉酶与糖化酶质量比对沅江芦笋可溶性膳食纤维的提取得率影响见图2。
图2 α-淀粉酶与糖化酶质量比对沅江芦笋可溶性膳食纤维提取得率的影响
Fig.2 Effect of α-amylase and glucoamylase mass ratio on the yield of soluble dietary fiber extracted from Miscanthus lutarioriparius
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图2 可知，随着α-淀粉酶添加量的增加，可溶性膳食纤维提取得率先增加后下降，当α-淀粉酶与糖化酶质量比为4∶5 时，可溶性膳食纤维提取得率达到峰值。根据GB 5009.88—2014《食品安全国家标准食品中膳食纤维的测定》进行酶种类的选择[23]，选用α-淀粉酶酶解，可以使淀粉中的长链断裂，而膳食纤维不会被酶解消化，而糖化酶可进一步加速α-1，4-糖苷键以及α-1，6-糖苷键的断裂，使酶解更充分。因此选择α-淀粉酶与糖化酶质量比3∶5、4∶5、5∶5 进行后续正交试验。
2.3 浸提时间对可溶性膳食纤维提取得率影响结果
不同浸提时间对沅江芦笋可溶性膳食纤维提取得率的影响见图3。
图3 浸提时间对沅江芦笋可溶性膳食纤维提取得率的影响
Fig.3 Effect of extraction time on the yield of soluble dietary fiber extracted from Miscanthus lutarioriparius
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
从图3 可以看出，随着浸提时间的延长，可溶性膳食纤维提取得率变化为先升高后下降再上升达到最高值后急剧下降，在浸提时间达到4 h，此时的可溶性膳食纤维提取得率最高。由于浸提时间过短会导致沅江芦笋可溶性膳食纤维提取反应不完全，未充分提取至溶液中；但浸提时间过长则会导致可溶性膳食纤维自身发生降解，使得提取得率下降[24]；故以浸提时间3、4、5 h 作为正交试验的3 个水平。
2.4 超声功率对可溶性膳食纤维提取得率影响结果
超声功率对沅江芦笋可溶性膳食纤维的提取得率影响见图4。
图4 超声功率对沅江芦笋可溶性膳食纤维提取得率的影响
Fig.4 Effect of ultrasonic power on the yield of soluble dietary fiber extracted from Miscanthus lutarioriparius
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图4 可知，提取得率随超声功率的升高呈现先升高后下降的趋势。超声功率低于150 W 时可能是由于超声作用未能将沅江芦笋中的可溶性膳食纤维充分浸出，而当超声功率高于150 W 时可能是存在于液体中的微气核空化泡在声波作用下引起的空化效应破坏了膳食纤维的结构[25]，使大分子物质打碎成为小分子物质，从而影响了可溶性膳食纤维的提取得率；故最佳超声功率为150 W。
2.5 超声温度对可溶性膳食纤维提取得率影响结果
超声温度对沅江芦笋可溶性膳食纤维的提取得率影响见图5。
图5 超声温度对沅江芦笋可溶性膳食纤维提取得率的影响
Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on the yield of soluble dietary fiber extracted from Miscanthus lutarioriparius
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图5 可知，提取得率随超声温度的升高呈现先下降后升高再下降的趋势。超声温度大于50 ℃后提取得率下降的原因推测为温度过高破坏了膳食纤维的结构，导致可溶性膳食纤维提取得率降低。超声温度为20、40、50 ℃时，可溶性膳食纤维提取得率变化不大，故选择提取得率最高时的超声温度50 ℃为最佳超声温度。
2.6 料液比对可溶性膳食纤维提取得率影响结果
料液比对沅江芦笋可溶性膳食纤维的提取得率影响见图6。
图6 料液比对沅江芦笋可溶性膳食纤维提取得率的影响
Fig.6 Effect of solid-to-liquid ratio on the yield of soluble dietary fiber extracted from Miscanthus lutarioriparius
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图6 可知，提取得率随液体量的增加呈现先升高后下降的趋势。当料液比为1∶150（g/mL）时，提取得率达到15.3%，此时为提取得率最高值，与料液比1∶20（g/mL）时相比，提取得率提升了13.3%。液体量较少时，提取得率偏低的原因在于沅江芦笋粉与溶液未能充分接触，导致提取不完全；当液体量不断增加，沅江芦笋粉能与溶液充分混匀提取，使得浸提完全，反应充分；但当液体量过大，水浴浸提的溶液内部温度上升至浸提温度所需反应时间更长，会进一步导致膳食纤维自身降解，使得可溶性膳食纤维提取得率降低；故以料液比1∶100、1∶150、1∶200（g/mL）作为正交试验的3 个水平。
2.7 正交试验设计结果分析
根据单因素试验结果分析，选择α-淀粉酶与糖化酶质量比、料液比、浸提时间3 个因素进行正交试验，正交试验设计及结果见表3，方差分析见表4。
表3 正交试验设计及其结果
Table 3 Orthogonal design and test results
试验号因素1 2 3 4 5 6 7 8 A 1 11222 3 3 B 1 23123 1 2 C 1 2 3 2 3 1 3 1 D 1 23312 2 3可溶性膳食纤维提取得率/%6.40 9.49 11.57 7.10 11.70 12.91 5.45 13.52
续表3 正交试验设计及其结果
Continue table 3 Orthogonal design and test results
试验号9 K1 K2 K3 k1 k2因素A3 B3 C2 D1可溶性膳食纤维提取得率/%16.77 k3R 27.457 31.704 35.748 9.152 10.568 11.916 2.764 18.949 34.711 41.250 6.316 11.570 13.750 7.434 32.827 33.363 28.720 10.942 11.121 9.573 1.547 34.872 27.843 32.194 11.624 9.281 10.731 2.343主要因素优化方案B＞A＞C A3B3C2
表4 正交试验方差分析
Table 4 Analysis of variance of orthogonal test results
注：**表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
方差来源修正模型截距试验号误差总计修正后总计平方和335.304自由 均方41.913 F 值4 488.847 P 值0.000显著性3 002.607 335.304 0.168 3 338.078 335.472度8 181 8 3 002.607 41.913 0.009 321 577.065 4 488.847 0.000 0.000**27 26
由表3 可知，影响沅江芦笋可溶性膳食纤维提取的各因素主次关系顺序为料液比（B）＞α-淀粉酶与糖化酶质量比（A）＞浸提时间（C）。从表4 可知，正交试验的9 次处理对沅江芦笋可溶性膳食纤维提取得率影响极显著（P＜0.01），该模型R2 为0.999，所以进一步通过邓肯新复极差法进行多重比较，得到最佳工艺组合，其与正交试验结果的优化方案一致。最佳工艺组合为A3B3C2，即料液比1∶200（g/mL）、α-淀粉酶与糖化酶质量比5∶5、浸提时间4 h 时可溶性膳食纤维提取得率最大，提取得率为16.77%。
3 结论
本试验采用单因素试验以及正交试验对超声辅助酶法提取沅江芦笋中可溶性膳食纤维进行工艺优化，通过试验结果发现料液比等因素对膳食纤维提取得率有显著影响。影响沅江芦笋中可溶性膳食纤维提取得率的各因素主次关系顺序为料液比＞α-淀粉酶与糖化酶质量比＞浸提时间。确定最佳提取工艺条件为料液比1∶200（g/mL）、α-淀粉酶与糖化酶质量比5∶5、浸提时间4 h。在该工艺条件下沅江芦笋可溶性膳食纤维提取得率最高，为16.77%。沅江芦笋中可溶性膳食纤维的提取工艺优化，为沅江芦笋可溶性膳食纤维在食品工业中的综合利用提供了良好的理论支撑以及数据参考。
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