咖啡是世界三大饮料作物之一，饮用咖啡的人口达15 亿人以上，近年来随着个性化消费需求的快速增长，特殊处理的咖啡具有一定的市场发展空间，如猫屎咖啡、液氮咖啡等[1-2]。特殊处理法能为咖啡提供不同于传统咖啡的风味和香气[3]。研究表明低温有利于咖啡香气前体物质在成熟过程中的积累[4]，同时De Melo Pereira 等[3]研究表明，应激因子（高温或低温）的应用可以用来调节单个或组合化合物的浓度，以改善风味，这为咖啡风味改性提供新思路。
咖啡的滋味包含酸味、苦涩味，酸味呈味物质主要是有机酸（柠檬酸、苹果酸等），其无挥发性，是咖啡豆自身代谢产物，易与糖结合而降低咖啡的尖酸味，增加咖啡活泼感与层次感，但过高也会影响咖啡滋味。苦涩味呈味物质主要有葫芦巴碱、咖啡因及奎尼酸，其中葫芦巴碱对苦味具有明显影响，苹果酸、咖啡因、葫芦巴碱对涩味具有明显影响[5-6]。滋味物质的分析方法一般选用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）[7]、感官评定等。由于咖啡具有高抗氧化活性而对人体健康有益，酚类化合物是抗氧化活性的主要来源，主要包括总酚和总黄酮，通过测定1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）自由基清除率和2，2′-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐[2，2′-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]阳离子自由基清除率等，研究其抗氧化活性[8]。咖啡的加工工艺会影响其抗氧化活性[9]，然而针对超低温冷诱导处理咖啡鲜果对咖啡熟豆中抗氧化化合物变化的影响尚无相关报道。在我国，食品加工领域制冷工程通常把冷库划分为高温库（5～15 ℃）、中温库（-5～5 ℃）、低温库（-18～-25 ℃）和超低温库（-30～-60 ℃）[10]，生产性冷库的温度范围一般在-40～10 ℃[11]，冰箱行业一般有冷藏间（0～4 ℃）、软冷冻（-7 ℃）等这些温度的划分[12]。因此本研究选择超低温（-40 ℃）、低温（-20 ℃）、软冻温度（-7 ℃）、冰温（-2 ℃）、冷藏温度（4 ℃）、常温（25 ℃）作为咖啡鲜豆处理的条件，以云南卡蒂姆咖啡鲜果为对象，分析上述温度处理咖啡鲜果对咖啡熟豆中有机酸、生物碱、酚类物质含量变化及抗氧化活性的影响，通过系统聚类对不同温度处理后的咖啡熟豆进行聚类分析，感官评定验证其结果，以期为开发风味咖啡提供思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
咖啡鲜果：采自云南省保山市潞江坝，品种为‘卡蒂姆’。
甲醇（色谱纯）：美国Sigma 公司；磷酸二氢钾（分析纯）：广东省化学试剂工程技术研究开发中心；甲酸（分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司；咖啡因、葫芦巴碱、草酸、奎尼酸、苹果酸、L-乳酸、柠檬酸标准品（均为色谱纯）：上海源叶生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
电热恒温水浴锅（XMT-DA）：亚星仪器仪表有限公司；集热式加热磁力搅拌器（DF-101S）：上海力辰邦西仪器科技有限公司；高效液相色谱仪（1525 二元高压梯度泵、2707 型自动进样器、2998 二极管阵列检测器、Breeze2 分析系统）（Waters1525）：美国Waters 公司；超纯水器（UPT-I-20T）：成都超纯科技有限公司；电子分析天平（AX124ZH）：上海奥豪斯仪器有限公司；超声波清洗机（BL10-250A）：上海比朗仪器有限公司；酶标仪（MULTISKAN GO）：赛默飞世尔科技有限公司；咖啡烘焙机（Pro-100）：IKAWA 公司。
1.3 试验方法
1.3.1 样品处理
采摘新鲜的咖啡鲜果迅速运回实验室，置于冷库（-40、-20 ℃）、冰箱（-7、-2、4 ℃）及25 ℃培养箱36 h，之后按照湿法加工的方法进行处理[2]。用同一烘焙曲线浅度烘焙，获得6 个熟咖啡豆样品。
1.3.2 提取液制备
将样品中度研磨，取10 g 于锥形瓶中，加入180 mL、80 ℃纯水，使水与咖啡粉充分混合，用双层保鲜膜封口后，于集热式加热磁力搅拌器中，60 r/min、80 ℃水浴6 min。将水浴后盛有咖啡提取液的锥形瓶冷却至室温后，抽滤并用180 mL 纯水冲洗锥形瓶和滤渣（常温），在抽滤瓶滤液中混合、摇匀，过0.45 μm 滤膜，得样品供试品溶液，备用。
1.3.3 草酸、奎尼酸、苹果酸、L-乳酸、柠檬酸、咖啡因和葫芦巴碱含量的测定
测定草酸、奎尼酸、苹果酸、L-乳酸、柠檬酸的含量参考Liu 等[13]的方法并略作修改。色谱条件：色谱柱为Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A 为0.05 mol/L、pH2.7 的KH2PO4 溶液，流动相B 为甲醇。梯度洗脱程序：0～30 min，99% A～1% B；30～55 min，100%B。流速0.8 mL/min；波长210 nm；柱温40 ℃；进样体积15 μL。
测定咖啡因和葫芦巴碱的含量参考Gloess 等[14]的方法并略作修改。色谱条件：色谱柱为Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A 为0.5% 甲酸，流动相B 为甲醇。梯度洗脱程序：0～7 min，5%～10% B；7～10 min，18% B；10～55 min，50% B；55～65 min，80%B；65～85 min，100%B。波长：272、264 nm；柱温40 ℃；进样体积10 μL。
1.3.4 多酚、黄酮含量的测定
多酚含量测定：按照1.3.2 中样品前处理得到提取液，参照Mehari 等[15]方法适当调整。精密量取供试品溶液1 mL，置于25 mL 具塞试管中，加入1 mL 福林酚，摇匀，静置3 min，加入12% 碳酸钠溶液2 mL，用水定容至10 mL。振荡摇匀后室温避光静置2 h，在760 nm 波长处测定吸光度。没食子酸标准曲线为Y=1.420 6X+0.082 2，R2=0.997 6，吸光度为纵坐标（Y），没食子酸浓度为横坐标（X）。从标准曲线上读出供试品溶液中没食子酸的含量，计算即得多酚的含量，结果以没食子酸计。
黄酮含量测定：按照1.3.2 中提取液制备方法得到提取液。取稀释10 倍后的提取液1 mL，加60%乙醇溶液3 mL，摇匀，加入5% 亚硝酸钠溶液0.50 mL，摇匀，静置6 min 后，加入10% 硝酸铝水溶液0.50 mL，立即摇匀，静置6 min，加入4%氢氧化钠溶液5.00 mL，静置15 min。以相应试剂为空白，在510 nm 处测定吸光度。由芦丁标准曲线Y=1.423 3X-0.068 3，R2=0.999 2，得供试品溶液中黄酮含量，结果以芦丁计。
1.3.5 DPPH 自由基、ABTS+自由基清除能力的测定
DPPH 自由基清除能力的测定：取经适当稀释后的样品40 μL，加入160 μL 40 μg/mL DPPH 溶液，混合均匀，室温反应30 min 后，于517 nm 处测定吸光度，记为As；DPPH 溶液于517 nm 处的吸光度记为A1；各样品溶于乙醇中于517 nm 处的吸光度记为A0。DPPH 自由基的清除率（M，%）按下列公式计算。
M=[1-（As-A0）/A1]×100
ABTS+自由基清除能力的测定：由7 mmol/L ABTS和4.9 mmol/L K2S2O8 在黑暗室温下放置12～18 h 产生ABTS+，用磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L，pH7.4）稀释50倍至734 nm 处测得吸光度为0.7 左右时备用。取稀释10 倍的样品50 μL，加入50 μL ABTS+溶液，于室温避光反应6 min，于734 nm 处测定吸光度，记为As；ABTS+溶液于734 nm 处的吸光度记为A0。ABTS+自由基清除率（N，%）按下列公式计算。
N=（A0-As）/A0×100
1.3.6 烘焙咖啡饮用品质评定
本研究参考国际咖啡组织（international coffee organization，ICO）标准、卓越杯（cup of excellence，COE）感官评定细则并进行修改，邀请5 名品鉴师开展盲评，参考陈云兰等[16]的方法，不同处理咖啡豆评分标准见表1。包含项目：风味、酸质、甜感、醇厚度、余韵、干净度、平衡感，每项5 分。杯测前，开展样品烘焙全豆和研磨咖啡粉的Agtron 值测定。感官评分总分=酸质+甜感+口感+余韵+干净度+平衡感；30～35 为非常好喝；25～＜30 为好喝，水准不错；20～＜25 为平均水准；＜20，有明显不佳风味，不建议出品饮用。
表1 不同处理咖啡豆评品标准
Table 1 Evaluation standards for coffee beans with different treatments
评分标准因素中良优风味差（0～＜2.0）木质、异味（3.5～＜4.5）浓郁、强烈、焦糖（4.5～5.0）浓郁、强烈、丰富的花果香酸质（2.0～＜3.5）中等强度、具有坚果、奶油、巧克力的风味柔和、平淡甜感甜度低强烈、丰富、红酒质感甜美、甘甜醇厚度顺滑密实、丝绒感余韵活泼，酸度适中的果酸甜度较好、圆润奶油感、乳脂感持久干净度粗糙、尖锐、酸败青涩、尖酸淡薄、水感不舒爽、烟感杂味平衡感突兀、失衡回甘平淡、持久较短轻微杂味、草腥协调干净、无杂味协调均衡、结构佳优质风味持久不衰层次分明、纯净剔透共鸣性酸味与厚实感和谐
1.4 数据分析
采用Excel 2010 软件和Origin 2018 软件处理数据及作图，SPSS 20.0 软件进行标准差及差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 不同温度处理后咖啡豆有机酸组分分析
不同温度处理咖啡鲜果后有机酸标准曲线见表2。不同温度处理咖啡鲜果后咖啡中有机酸含量差异见表3。
表2 不同温度处理咖啡鲜果后有机酸标准曲线
Table 2 The standard curve of organic acid in coffee treated at different temperatures
序号12345物质草酸奎尼酸苹果酸L-乳酸柠檬酸保留时间/min 4.007 4.763 5.850，10.843 7.463 10.473回归方程y=25.633x+0.977 0 y=12.672x+0.799 7 y=56.390x+1.666 1 y=15.545x-0.052 7 y=31.203x+0.485 8确定系数0.999 5 0.999 1 0.999 2 0.999 8 0.999 7
表3 不同温度处理后咖啡中有机酸含量差异
Table 3 Difference of organic acid content in coffee treated at different temperatures
注：同列不同小写字母表示不同温度处理咖啡鲜果后咖啡中有机酸含量差异显著（P＜0.05）。
处理温度/℃-40草酸含量/（mg/g）19.45±0.79c 24.46±0.50b 25.54±0.59a 25.03±0.26b 24.37±0.20bc 24.60±0.29b奎宁酸含量/（mg/g）531.91±2.40d 563.55±3.00b 568.13±4.11b 576.38±4.05a 556.21±0.91c 553.31±2.73c L-乳酸含量/（mg/g）9.15±0.30a 9.74±0.39a 9.25±0.46a 8.62±1.32a 9.48±0.53a 8.33±1.13a苹果酸含量/（mg/g）3.83±0.17b 4.19±0.68a 4.92±0.10a 5.02±0.01a 4.33±0.24a 4.11±0.00b柠檬酸含量/（mg/g）3.61±0.80abc-20 3.20±0.02c 3.45±0.01bc-7-2 3.55±0.01abc 4 25 4.11±0.07a 3.97±0.00ab
由表2 可知，各有机酸色谱分离度较好，回归曲线确定系数均在0.999 以上，拟合度较好。因有机酸带有大量氢离子，它的含量将直接影响咖啡的酸度[5]。由表3 可知，-40 ℃处理鲜果后其草酸含量最低，为19.45 mg/g，-7 ℃处理鲜果其草酸含量最高，为25.54 mg/g，-20、-2、4、25 ℃处理样品草酸含量没有显著性差异；奎宁酸含量在所有测定有机酸组分中含量最高，在-40 ℃处理下含量最低，为531.91 mg/g，-2 ℃条件下最高，为576.38 mg/g，-2 ℃降低到-40 ℃，随温度降低其含量也不断减少。奎宁酸是一种环状多羟基化合物，其含量会因外界刺激而改变，这与红薯受到切断伤害后奎宁酸含量的变化趋势一致[17]；各处理样品中L-乳酸含量没有显著性差异；苹果酸含量较稳定，在-20、-7、-2、4 ℃处理下没有显著性差异，但-40 ℃和25 ℃处理后，其含量与其他处理之间有显著性差异；柠檬酸含量在-20 ℃处理下含量最低为3.20 mg/g，4 ℃处理后其含量最高为4.11 mg/g，柠檬酸是一种三羧酸化合物，易分解[18]。试验结果显示，不同温度处理咖啡鲜果对咖啡熟豆中有机酸的含量有一定影响，其中超低温处理后草酸、奎宁酸、苹果酸含量均最低。从-2 ℃开始，随温度降低，咖啡中的奎宁酸、苹果酸含量不断降低，该结果与刘汉珍等[19]关于滁菊储存温度对总有机酸含量的影响研究结果一致。
2.2 不同温度对咖啡中生物碱含量的影响
咖啡中生物碱标准曲线见表4。不同温度处理后咖啡中生物碱含量的差异见图1。
图1 不同温度处理后咖啡豆生物碱含量的差异
Fig.1 Difference of alkaloid content in coffee treated at different temperatures
同一物质不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
表4 咖啡中生物碱标准曲线
Table 4 The standard curve of alkaloid in coffee
序号1 2物质葫芦巴碱咖啡因保留时间/min 3.237 24.497回归方程y=221.07x+0.433 9 y=425.65x-0.506 2确定系数0.999 8 0.999 9
咖啡因和葫芦巴碱属于生物碱类化合物，是咖啡中重要的活性成分，会产生平滑的苦味[20]。由表4 可知，葫芦巴碱、咖啡因色谱分离度较好，且回归曲线确定系数均在0.999 以上，拟合度较好，能准确计算样品中的含量。由图1 可知，-40 ℃处理咖啡鲜果后，其葫芦巴碱含量最低为9.31 mg/g，其他处理葫芦巴碱含量均在10.20 mg/g 以上。葫芦巴碱是存在于细胞质中的一种亲和性溶质，当植物受到外界环境胁迫时，它起着渗透调节的作用[21]，当温度降低到-40 ℃时，冷冻速度快，可快速通过冰晶生成带，植物细胞结构破坏程度小，-20 ℃低温速冻冻结速率慢，会产生大且不规则的胞外冰晶，破坏细胞结构[22]，因此-40 ℃处理，细胞结构保存较好，咖啡豆烘焙后葫芦巴碱降解为吡啶和烟酸的较多[23]，含量降低。而另一种生物碱类物质咖啡因，其含量随不同温度处理改变较小，研究表明，咖啡因含量随处理方式的改变变化较小[24]，与本研究结果一致。
2.3 不同温度对咖啡抗氧化性的影响
不同温度处理后咖啡豆中活性成分含量及抗氧化性差异见图2。
图2 不同温度处理后咖啡活性成分含量及抗氧化性差异
Fig.2 Differences of active ingredient content and antioxidant activity in coffee treated at different temperatures
A.活性成分（黄酮、多酚）含量；B.自由基清除率。同一指标不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
咖啡中酚类化合物与其高抗氧化活性密切相关[8]。如图2A 所示，不同温度处理咖啡鲜果后咖啡熟豆中多酚含量差异显著，-2 ℃处理后咖啡熟豆中多酚含量最高，达144.27 mg/g，-7 ℃条件下样品多酚含量与-2 ℃条件下差异显著，为138.70 mg/g，-40、25 ℃条件下样品多酚含量差异不显著，含量依次为131.64、129.80 mg/g，不同温度下多酚含量由低到高依次为25 ℃＜-40 ℃＜-7 ℃＜4 ℃＜-20 ℃＜-2 ℃。黄酮含量均在60 mg/g 以上，-7、-2、4 ℃条件下样品黄酮含量之间差异不显著，分别为68.10、70.68、69.37 mg/g，25 ℃条件下样品黄酮含量最低，为63.32 mg/g，黄酮含量由低到高依次为25 ℃＜-40 ℃＜-7 ℃＜4 ℃＜-2 ℃＜-20 ℃。
DPPH 和ABTS 是目前使用较为广泛的自由基试剂，样品清除自由基的能力反映了其抗氧化的能力[15]。如图2B 所示，不同温度处理对咖啡熟豆DPPH 自由基、ABTS+自由基清除能力差异均显著（P＜0.05），其中-2 ℃处理鲜果后其ABTS+自由基清除能力最强，为59.75%，-40 ℃处理样品ABTS+自由基清除能力最弱，为51.04%。这可能是由于-2 ℃会对鲜果的抗氧化能力产生积极影响[25]，此条件下，鲜果的细胞不被破坏，鲜果表面的有害微生物活动受到抑制，呼吸速率减慢，同时植物组织因为受到低温胁迫，会在细胞间隙结冰使细胞脱水、浓缩，从而防止冻结和过多失水，此时细胞中会产生由糖、高级醇及蛋白质组成的不冻液，这对果蔬的品质及风味会产生有利影响[26]。-40、-20、-2 ℃处理鲜果后其DPPH 自由基清除能力之间分别无显著性差异，4 ℃处理鲜果后其DPPH 自由基清除能力最强为72.95%，Haile 等[8]的研究表明DPPH 自由基清除能力与多酚含量相关，但不是一一对应关系，本研究中咖啡鲜果经过超低温处理、湿法加工及烘焙等加工工序后，多酚、黄酮的生物利用率受到不同程度的影响，同时咖啡中其他的抗氧化成分的存在也会影响其抗氧化活性，这可能使得多酚、黄酮含量与抗氧化活性之间的相关性不明确。
2.4 系统聚类
不同温度处理后咖啡豆品质聚类分析谱系见图3。
图3 不同温度处理后咖啡豆品质聚类分析谱系
Fig.3 Cluster analysis pedigree of the quality of coffee beans treated at different temperatures
系统聚类分析是一种无监督模式识别方法[27]，对所测咖啡熟豆中生物碱类物质（葫芦巴碱、咖啡因）、有机酸（草酸、奎宁酸、L-乳酸、苹果酸、柠檬酸）含量、多酚、黄酮含量、DPPH 自由基、ABTS+自由基清除能力进行标准化处理，选用平方欧氏距离计算样品间相似性测度，用瓦尔德法进行聚类，聚类分析结果将样品分为4 类。以平方欧氏距离15 为标度，第一类是-20、-7、-2 ℃，第二类是4、25 ℃，第三类是-40 ℃，这与-40 ℃处理咖啡中有机酸、生物碱类物质、活性成分含量及抗氧化活性的趋势一致。
2.5 不同温度处理后咖啡感官评定
不同温度处理鲜果后咖啡的品质见表5，饮用品质雷达图见图4。
图4 不同温度处理后咖啡的饮用品质雷达图
Fig.4 The Radar chart of coffee drinking quality treated at different temperatures
表5 不同温度处理后咖啡的品质
Table 5 The quality of coffee treated at different temperatures
处理温度/℃-40全豆的Agtron 值57.4咖啡粉的Agtron 值84.8差值27.4平均综合评分30.0-20-7-2 4 52.3 60.0 54.3 55.4 67.1 75.2 73.8 73.2 14.8 15.2 19.5 17.8 28.0 28.1 28.6 27.5 25 53.7 76.0 22.3风味热带水果、牛奶巧克力，黑莓黑巧克力柑橘、柠檬黑莓、柠檬坚果、普洱茶、大麦茶坚果、谷物、黑糖27.8
由表5 可知，不同温度处理咖啡鲜果对咖啡熟豆的感官品质影响不同，但整体上未出现风味明显不佳的样品，且与品质的聚类分析结果相对应，平均综合评分依次为：30.0、28.0、28.1、28.6、27.5、27.8（-40、-20、-7、-2、4、25 ℃）。-40 ℃处理得到风味独特的咖啡，4 ℃和25 ℃处理得到的咖啡风味类似。-40 ℃处理鲜果后，咖啡豆的风味丰富，有热带水果、牛奶巧克力及黑莓风味，层次鲜明，甜感、醇厚度、余韵、干净度有明显优势（图4），这在全豆和咖啡粉的Agtron 差值上也得到验证，豆粉值差异大，其风味层次更明显。-20 ℃处理样品其干净度、平衡感较突出，-7 ℃处理鲜果后其醇厚度较低，-2 ℃处理样品酸质、醇厚度、干净度有优势，这与咖啡中滋味物质呈味相关的奎宁酸、苹果酸、柠檬酸、葫芦巴碱含量呈正相关，这3 个温度处理后的样品其含量之间差异不大。4 ℃处理样品干净度较为突出，有坚果、普洱茶、大麦茶风味，25 ℃处理样品其平衡感突出，有黑糖风味，这可能是由25 ℃常温放置，咖啡鲜果发酵引起。
3 结论
不同温度处理咖啡鲜果对咖啡熟豆的品质指标影响显著，-40 ℃超低温处理能得到一款具有热带水果、牛奶巧克力、黑莓等独特风味的咖啡。这与超低温冷诱导对咖啡滋味相关的呈味化合物的影响相关，聚类分析及感官评定的结果验证了这一点。对于有机酸，不同温度处理咖啡后苹果酸含量由低到高依次为-40 ℃＜25 ℃＜-20 ℃＜4 ℃＜-7 ℃＜-2 ℃，柠檬酸含量由低到高依次为-20 ℃＜-7 ℃＜-2 ℃＜-40 ℃＜25 ℃＜4 ℃，奎宁酸含量由低到高依次为-40 ℃＜25 ℃＜4 ℃＜-20 ℃＜-7 ℃＜-2 ℃，葫芦巴碱含量由低到高依次为-40 ℃＜25 ℃＜4 ℃＜-20 ℃＜-2 ℃＜-7 ℃。由含量比较看出-2、-7、-20 ℃处理样品其滋味物质中酸质、苦味明显。对于抗氧化性来说，多酚含量由低到高依次为25 ℃＜-40 ℃＜-7 ℃＜4 ℃＜-20 ℃＜-2 ℃，黄酮含量由低到高依次为25 ℃＜-40 ℃＜-7 ℃＜4 ℃＜-2 ℃＜-20 ℃，ABTS+自由基清除率由低到高依次为-40 ℃＜-7 ℃＜25 ℃＜4 ℃＜-20 ℃＜-2 ℃，DPPH 自由基清除率由低到高依次为-20 ℃＜-40 ℃＜-2 ℃＜-7 ℃＜25 ℃＜4 ℃。-40 ℃处理咖啡鲜果后咖啡中苹果酸、奎宁酸、葫芦巴碱含量最低，活性成分含量则与咖啡传统25 ℃处理最接近，聚类分析将-40 ℃处理单独分为一类，感官评分-40 ℃处理咖啡达到最高。本研究一定程度上构建了超低温冷诱导与咖啡滋味、抗氧化活性之间的关系，并建立了-40 ℃处理得到风味独特咖啡的加工处理工艺。
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