黑色素是一种由吲哚类、酚类形成的异质聚合物[1]，主要呈深褐色至黑色[2]，少量呈红色或黄色[3]。黑色素具有抗氧化[4]、抑菌[5]、抗辐射[6]、抗肿瘤[7]和免疫调节[8]等功能，在农业、食品加工、化妆品、生物医用材料等行业应用前景广阔，已经成为国内外科学领域中的一个研究热点。黑色素来源广泛，天然黑色素主要来源于动物、植物和真菌[9]。真菌具有生产周期短、易于工业化生产、发酵产物得率高等优点，因此，真菌是获取黑色素的重要来源之一。
黑木耳（Auricularia heimuer）是一种食药兼用的大型真菌[10]，不仅营养丰富，还含有多糖、黑色素、腺苷等活性成分，具有清肺润肺、止咳化痰、抗氧化、降血糖等功效。黑木耳是黑五类食品之一，黑色素是其重要的生物活性物质。研究发现黑木耳子实体和发酵液中均含有黑色素[11]。袁源等[12]采用纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶等，利用复合酶法提取了黑木耳子实体干品中的黑色素。张敏[13]以深层发酵法制备了黑木耳黑色素。然而，关于黑木耳菌丝体黑色素的研究较少，且比较不同来源黑木耳黑色素的结构表征、溶解性、稳定性和体外抗氧化等研究较少。
本研究以黑木耳“1703”的子实体、菌丝体和发酵液为试验材料，采用碱溶酸沉法提取黑色素，比较研究3 种来源黑色素的结构表征、溶解性、稳定性和体外抗氧化活性，以期为不同来源黑木耳黑色素的开发和利用提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
1.1.1 材料与试剂
黑木耳“1703”：黑龙江省科学院微生物研究所菌种保藏中心。黑木耳“1703”子实体干品采用大棚栽培出耳获得，菌丝体和发酵液为黑木耳“1703”发酵培养后12 000 r/min 离心10 min 后获得。
马铃薯葡萄糖（potato dextrose，PD）培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，KH2PO4 2 g，MgSO4 2 g，水1 000 mL，pH 自然。
NaOH、无水乙醇、甲醇、氯仿、丙酮、乙醚、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、葡萄糖（均为分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；浓盐酸（36%～38%）：天津渤海化工集团有限责任公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：哈尔滨纳川生物技术有限公司；2，2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]：北京博奥拓达科技有限公司。
1.1.2 仪器与设备
UV757CRT 紫外可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；AR2140 电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；TGL20M-II 台式通用高速冷冻离心机：湖南省凯达实业发展有限公司；FDU-1200 冻干机：日本EYELA 公司；HWS24 电热恒温水浴锅：上海一恒科技有限公司；FT/IR-3000 傅里叶变换红外光谱仪：日本Jasco 公司；S3400 扫描电子显微镜：日本日立公司。
1.2 方法
1.2.1 黑木耳黑色素的制备
将活化后的黑木耳“1703”接种于PD 培养基，25 ℃下160 r/min 避光培养10 d，分别收集菌丝体和发酵液。参照文献[14]的方法，采用碱溶酸沉法提取子实体和菌丝体中黑色素粗提物。参照文献[15]的方法，采用碱溶酸沉法提取发酵液中黑色素粗提物。
1.2.2 黑木耳黑色素的纯化
称取0.1 g 黑木耳黑色素粗提物，溶解于0.1 mol/L NaOH 中，采用3 mol/L NaOH 调整pH 值为12，70 ℃水浴锅中水浴浸提60 min。8 000 r/min 离心20 min，取上清液。采用1 mol/L HCl 调整pH 值为2，室温静置10 min 使黑木耳黑色素沉淀完全。8 000 r/min 离心20 min，将沉淀用去离子水、氯仿、乙酸乙酯和无水乙醇分别洗涤3 次。采用去离子水悬浊黑色素纯化物，于-80 ℃冰箱冷冻24 h，采用冻干机冻干后备用。
1.2.3 紫外可见光谱（ultraviolet-visible spectroscopy，UV-Vis）扫描
参照李晓敏等[16]的方法并稍作修改。称取0.01 g黑木耳黑色素，溶解到0.1 mol/L NaOH 溶液中配成0.025 mg/mL 的黑色素溶液。采用紫外可见分光光度计测定黑色素在190～600 nm 的吸光度。
1.2.4 傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectrometer，FTIR）扫描
参照李秀萍等[17]的方法并稍作修改。称取烘干至恒重的2 mg 黑木耳黑色素和40 mg KBr，研磨均匀后压成片。采用傅里叶变换红外光谱仪在4 000～400 cm-1范围内扫描测定。
1.2.5 扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）
参照应正河等[18]的方法并稍作修改。取少量黑木耳黑色素样品固定于导体胶上，于喷金台上进行真空喷金镀膜90 s，采用扫描电子显微镜观察并拍照。
1.2.6 高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）测定
参照文献[19]的方法并稍作修改。采用0.1 mol/L NaOH 溶液配成0.5 g/L 黑色素溶液。在安捷伦1100 HPLC 系统上进行高效液相色谱分析，在Waters Sun-Fire 上进行黑色素的HPLC 的C18 柱（150 mm×4.6 mm，5 cm）与保护柱C18 柱（4.0 mm×3.0 mm）耦合。流动相由甲醇和1% 乙酸组成，等度洗脱30 min。流速为1.0 mL/min，加样体积为20 μL。检测波长为210 nm，柱温为25 ℃。采用GPC 软件进行数据分析。
1.2.7 溶解性测定
在室温下准确称取一定量黑木耳黑色素，分别溶解于0.1 mol/L HCl、0.1 mol/L NaOH、水、75% 乙醇、甲醇、氯仿、丙酮、乙醚、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇，研究黑木耳黑色素在不同溶剂中的溶解性。
1.2.8 稳定性测定
称取0.01 g 黑木耳黑色素，溶解到0.1 mol/L NaOH溶液中备用。
温度稳定性：黑色素溶液分别置于0、20、40、60 ℃和80 ℃中，分别于0、2、4 h 和6 h 取样，10 000 r/min离心5 min，以0.1 mol/L NaOH 为对照，测定210 nm 处的吸光度。
光照稳定性：黑色素溶液分别置于黑暗、自然光和强光下，分别于0、2、4 h 和6 h 取样，10 000 r/min 离心5 min，以0.1 mol/L NaOH 为对照，测定210 nm 处的吸光度。
金属离子稳定性：配制0.05 mol/L Na+、Ca2+、Mg2+、A13+、Fe3+、Fe2+、Cu2+溶液。与黑色素溶液按照1∶1（体积比）混合，以0.1 mol/L NaOH 为对照，测定210 nm 处的吸光度。
1.2.9 体外抗氧化活性测定
1.2.9.1 DPPH 自由基清除率测定
参照刘鑫等[20]的方法并稍作修改。用无水乙醇配制0.2 mmol/L DPPH 溶液，分别取2 mL DPPH 无水乙醇溶液和2 mL 不同质量浓度（0.25、0.5、1、2、4 mg/mL）的黑色素溶液混匀，室温避光反应30 min，在517 nm下测定吸光度（A1），2 mL 无水乙醇代替DPPH 无水乙醇溶液，测定517 nm 下吸光度（A2），2 mL 蒸馏水代替黑色素溶液，测定517 nm 下吸光度（A0）。DPPH 自由基清除率（R1，%）计算公式如下。
1.2.9.2 ABTS+自由基清除率测定
参照徐颖等[21]的方法并稍作修改。量取50 mL 7.4 mmol/L 的ABTS 溶液和50 mL 2.6 mmol/L 的过硫酸钾溶液，摇匀后于室温下避光反应12 h，测定其在734 nm 处的吸光度。再用pH7.4 的磷酸盐缓冲溶液稀释，调节吸光度至0.7 附近，制成ABTS 工作液，记吸光度为A0。精准移取不同浓度样品溶液0.2 mL，加入0.8 mL ABTS 工作液摇匀混合，避光放置6 min，测定其在734 nm 处的吸光度，记为A1。ABTS+自由基清除率（R2，%）计算公式如下。
1.2.9.3 ·OH 清除率测定
采用水杨酸法测定黑木耳黑色素对羟基自由基的清除率。不同质量浓度（0.25、0.5、1、2、4 mg/mL）的黑色素溶液，加入0.5 mL 7.5 mmol/L FeSO4、0.5 mL 7.5 mmol/L 水杨酸、0.5 mL 8.8 mmol/L H2O2 混合均匀，37 ℃水浴30 min，冷却后，于510 nm 处测定吸光度A1。用同体积的蒸馏水替代水杨酸测得吸光度A2；用同体积蒸馏水替代提取液测得吸光度A0。·OH 清除率（R3，%）计算公式如下。
1.3 数据统计与分析
所有试验均进行3 次重复，数据以平均值±标准差表示。采用SPSS 16.0 进行单因素方差分析，P＜0.05为组间差异显著。
2 结果与分析
2.1 黑木耳黑色素的制备
黑木耳“1703”子实体、菌丝体和发酵液中黑色素得率分别为2.58%、0.02% 和0.26%，黑木耳子实体中黑色素得率最高，其次为发酵液中黑色素，菌丝体中黑色素得率最低。子实体黑色素呈深黑色，菌丝体黑色素和发酵液黑色素均呈浅黑色。
2.2 紫外可见光谱（UV-Vis）结果
3 种来源黑木耳黑色素的UV-Vis 图谱如图1 所示。
图1 3 种来源黑色素紫外可见光谱扫描图谱
Fig.1 UV-Vis spectrum of three melanins from A.heimuer
A.子实体黑色素；B.菌丝体黑色素；C.发酵液黑色素。
由图1 可知，3 种来源黑色素在紫外区域（190～400 nm）具有最大吸收。随着波长的增加，吸光度逐渐增加；当波长大于210 nm 时，随着波长的增加，吸光度逐渐降低。因此，3 种来源黑色素的最大吸收波长为210 nm。3 种来源黑色素在260 nm 和280 nm 处没有明显的吸收峰，表明3 种来源黑色素中几乎不含有蛋白质、多肽或者核酸等杂质。
2.3 傅里叶变换红外光谱（FTIR）结果
3 种来源黑木耳黑色素傅里叶变换红外光谱图谱如图2 所示。
图2 3 种来源黑色素傅里叶变换红外光谱图谱
Fig.2 FTIR spectrum of three melanins from A.heimuer
由图2 可知，子实体黑色素的特征吸收峰：在3 427 cm-1 处有一个O—H 宽吸收峰。在1 647 cm-1 处有一个苯环吸收峰。在1 039 cm-1 处有一个C—O 拉伸吸收峰。菌丝体黑色素的特征吸收峰：在3 458 cm-1处有一个O—H 宽吸收峰。在1 647 cm-1 处有一个苯环吸收峰。在1 047 cm-1 处有一个C—O 拉伸吸收峰。发酵液黑色素的特征吸收峰：在3 419 cm-1 处有一个O—H 宽吸收峰。在1 652 cm-1 处有一个苯环吸收峰。在1 047 cm-1 处有一个C—O 拉伸吸收峰。因此，3 种来源黑色素特征吸收区基本一致。
2.4 扫描电子显微镜（SEM）结果
3 种来源黑木耳黑色素SEM 图谱如图3 所示。
图3 3 种来源黑木耳黑色素扫描电镜图谱（2 000×）
Fig.3 SEM spectrum of three melanins from A.heimuer（2 000×）
A.子实体黑色素；B.菌丝体黑色素；C.发酵液黑色素。
由图3 可知，3 种来源黑木耳黑色素均呈小块状、表面不规则的结构，且块状样品之间相互粘连在一起。刘文婷[22]研究发现梯棱羊肚菌（Morchella esculenta）黑色素呈现表面光滑并粘连在一起的结构，与本文研究结果一致。
2.5 高效液相色谱（HPLC）结果
3 种来源黑木耳黑色素的HPLC 图谱如图4 所示。
图4 3 种来源黑木耳黑色素HPLC 图谱
Fig.4 HPLC chromatograms of three melanins from A.heimuer
由图4 可知，3 种来源黑木耳黑色素均存在一个吸收峰。子实体黑色素的保留时间为2.435 min；菌丝体黑色素和发酵液黑色素的保留时间均为2.410 min，较子实体黑色素的早0.025 min。
2.6 溶解性结果
3 种来源黑木耳黑色素均易溶于0.1 mol/L NaOH溶液，微溶于75% 乙醇溶液，难溶于水和甲醇、氯仿、丙酮、乙醚、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等有机溶剂。因此，3 种来源的黑木耳黑色素具有相同的溶解性。
2.7 稳定性结果
不同温度对3 种来源黑木耳黑色素稳定性的影响如图5 所示。
图5 3 种来源黑木耳黑色素温度稳定性
Fig.5 Temperature stability of three melanins from A.heimuer
A.子实体黑色素；B.菌丝体黑色素；C.发酵液黑色素。
由图5 可知，相同温度下，随着处理时间的延长，3 种来源黑木耳黑色素的吸光度均呈下降的趋势。在相同处理时间条件下，温度越高，黑木耳黑色素的吸光度越低，但是不同温度对3 种来源黑木耳黑色素吸光度影响不明显。因此，3 种来源黑木耳黑色素具有良好的温度稳定性。
不同光照对3 种来源黑木耳黑色素稳定性的影响如图6 所示。
图6 3 种来源黑木耳黑色素光照稳定性
Fig.6 Light stability of three melanins from A.heimuer
A.子实体黑色素；B.菌丝体黑色素；C.发酵液黑色素。
由图6 可知，不同光照条件下，随着处理时间的延长，3 种来源黑木耳黑色素的吸光值均呈下降的趋势。在相同处理时间条件下，黑暗和自然光对黑木耳黑色素吸光度影响不大，但是强光对黑木耳黑色素吸光度有一定影响。因此，3 种来源黑木耳黑色素具有一定的光照稳定性。
不同金属离子对3 种来源黑木耳黑色素稳定性的影响如图7 所示。
图7 3 种来源黑木耳黑色素的金属离子稳定性
Fig.7 Metalion stability of three melanins from A.heimuer
A.子实体黑色素；B.菌丝体黑色素；C.发酵液黑色素。不同小写字母表示组内差异显著，P＜0.05。
由图7 可知，3 种来源黑木耳黑色素在Na+、Ca2+、Mg2+、Al3+下均较稳定。Fe3+提高3 种来源黑木耳黑色素的溶解性，吸光度增加，而Fe2+和Cu2+加入后黑木耳黑色素吸光度降为0，使黑木耳黑色素沉淀，这可能是黑木耳黑色素具有较强的抗氧化性，与还原性较强的Fe2+发生反应所致。Cu2+是黑木耳黑色素的中心结合金属离子，黑木耳黑色素可能与Cu2+发生螯合反应。黑木耳黑色素与Na+、Ca2+、Mg2+、Al3+不发生反应，黑木耳黑色素的吸光度变化不明显。
2.8 体外抗氧化活性结果
3 种来源黑木耳黑色素的DPPH 自由基清除率、ABTS+自由基清除率、羟基自由基清除率结果如图8所示。
图8 3 种来源黑木耳黑色素的体外抗氧化活性
Fig.8 Antioxidant activities in vitro of three melanins from A.heimuer
A.DPPH 自由基清除率；B.ABTS+自由基清除率；C.OH 自由基清除率。
由图8A 可知，随着黑木耳黑色素浓度的升高，3 种来源黑木耳黑色素DPPH 自由基清除率均呈上升趋势，且表现出明显的浓度依赖关系。发酵液黑色素、子实体黑色素和菌丝体黑色素对DPPH 自由基清除能力的IC50 分别为3.82、44.98 mg/mL 和236.60 mg/mL。
由图8B 可知，随着黑木耳黑色素浓度的升高，3 种黑木耳黑色素ABTS+自由基清除率均呈上升趋势，且表现出明显的浓度依赖关系。发酵液黑色素、子实体黑色素和菌丝体黑色素对ABTS+自由基清除能力的IC50 分别为2.16、2.16 mg/mL 和5.90 mg/mL。
由图8C 可知，随着黑木耳黑色素浓度的升高，3 种黑木耳黑色素羟基自由基清除率均呈上升趋势，且表现出明显的浓度依赖关系。发酵液黑色素、子实体黑色素和菌丝体黑色素对·OH 清除能力的IC50 分别为144.2、809.1 mg/mL 和10 815.0 mg/mL。
3 结论
本研究发现3 种来源黑木耳黑色素的最大吸收波长为210 nm，傅里叶变换红外光谱结果表明3 种来源黑木耳黑色素在天然黑色素3 个特征吸收区域均有特征吸收峰。HPLC 结果表明3 种来源黑木耳黑色素均只有一个吸收峰，且保留时间基本一致。3 种来源黑木耳黑色素均不溶于水和大部分有机溶剂，具有良好的温度和光照稳定性，受Fe2+和Cu2+影响较严重，对DPPH 自由基、ABTS+自由基和OH 自由基均具有较强的清除能力，相同浓度下对ABTS+自由基清除能力最强。因此，3 种来源的黑木耳黑色素性质基本相同，具有较好的体外抗氧化活性，可用于食品和医药工业。
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