高血压是一类以血压增高为特征的慢性病，主要症状为血压增高、眩晕、头疼等，而血压过高则可造成心、脑、肾等主要脏器的损伤[1-2]。随着人口老龄化和城镇化速度的加快，高血压的发病人数呈现快速增长的发展趋势[3]，目前市场上有很多常用的降压药，包括人造卡托普利、依那普利、赖诺普利等，但服药后可能会出现头晕、头痛、咳嗽、味觉丧失、呕吐等不适症状。随着人们药物安全和保健意识的不断提升，应用非药物治疗的观念深入人心，因此寻找食源性降压肽已经成为备受关注的问题[4-6]。
硒是人类和动物生长发育过程中不可缺少的一种微量元素，硒摄入量过多或过少都对人体有所损害[7]。生物转化可以将硒转化为毒性更小的有机硒，转化后的有机硒存在形式大部分是硒代氨基酸，研究人员发现硒代氨基酸有硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸等形式[8]。研究显示，硒缺乏会引起各种疾病，造成机体的新陈代谢失调[9]。人类可以通过日常膳食补充硒，虽然食品中的硒含量与土壤中的硒含量之间存在着直接的联系，但由于高、低硒区的土壤中硒水平存在显著差异，仅通过日常膳食补充硒远远不够，因此富硒食品的开发和利用是人类补充硒的有效途径[10]。
纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）属于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的一个亚种[11]，对酸、碱、高温都有抵抗力，在酸性胃环境中仍能保持较高的稳定性[12]。作为一种益生菌，它不仅具备分解蛋白质、碳水化合物、脂类等生物大分子物质的能力，还同时含有氨基酸、有机酸、低聚糖等能被人体消化吸收的营养素，而且还能够把无机硒转变为稳定性更高的有机硒，因此选择纳豆芽孢杆菌作为发酵菌种[13]。鹰嘴豆是世界上仅次于大豆和豌豆的第三大重要谷类作物，它富含谷物中缺乏的赖氨酸，除此之外，还在鹰嘴豆中分离出了花青素、黄酮、多酚类物质以及有机酸等活性成分[14-15]。鹰嘴豆的种子在防治糖尿病、失眠、皮肤疾病等方面都有很好的应用价值，尤其对糖尿病、心脑血管疾病、胃病等疾病的防治效果极为显著[16]。
血管紧张素转化酶（angiotensin I converting enzyme，ACE）抑制肽是一类能够抑制ACE 活性的生物活性肽片段，它所含有的2～12 个氨基酸残基具有降压作用。ACE 抑制肽与ACE 的结合具有竞争性，从而阻止血管紧张素I 转化为血管紧张素II，以此达到降血压的目的[17]。研究发现，食物源ACE 抑制剂与化学合成ACE 抑制剂具有类似的效果，是良好的ACE 抑制剂替代品，与普通降压药相比虽然有着相同的作用，但同时具有安全性更高、无副作用、成本低、易吸收、转化快等优点[18-19]，可以提供给人体一些必需氨基酸，酶解法、微生物发酵法、化学合成法等是制备ACE 抑制肽较为常用的方法。目前，研究人员已经从粮油作物、乳制品、海洋生物中分离得到食源性ACE 抑制肽。ACE抑制肽的制备方法主要有以下3 种：Abdel-Hamid 等[20]采用酶解法对水牛脱脂乳的残渣进行水解，经过质谱鉴定，发现了4 个新的具有ACE 抑制活性的肽段；Gao等[21]采用微生物发酵法发酵栉孔扇贝，并从中筛选ACE 抑制肽；赵元晖等[22]采用化学合成法制备ACE 抑制肽。
本试验选择富硒能力较强的纳豆芽孢杆菌作为发酵菌种，以鹰嘴豆为原料，对纳豆芽孢杆菌富硒发酵鹰嘴豆产ACE 抑制肽进行研究，在单因素试验结果基础上，应用响应面法确定纳豆芽孢杆菌富硒产ACE 抑制肽的最佳产肽条件，并进一步分析各单因素对ACE 抑制率的影响。同时采用超高效液相色谱-电喷雾电离-串联质谱（ultra performance liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry，UPLC-ESIMS/MS）法对鹰嘴豆纳豆富硒后的有机硒进行测定，以期为纳豆的高值化利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
纳豆芽孢杆菌（BNCC185325）：陕西科技大学1C320 食品理化分析实验室提供；鹰嘴豆粉：新疆天山奇豆生物科技有限责任公司；LB 培养基（分析纯）：北京奥博星生物技术有限责任公司；亚硒酸钠（分析纯）：山东西亚化学有限公司；盐酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；硼酸、硼砂、氯化钠、氢氧化钠（均为分析纯）：天津市天力化学试剂有限公司；血管紧张素转化酶（0.25 U）、N-[3-（2-呋喃基）丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸{N-[3-（2-furyl）acryloyl]-L-phenylalanyl-glycyl-glycine，FAPGG}：上海麦克林生化科技有限公司；无菌双蒸水：福州飞净生物科技有限公司；C18 色谱柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）：美国赛默飞世尔科技公司；固相萃取柱（MAX SPE 柱，60 mg，3 mL）：美国Waters公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯）、超纯水：美国Fisher 公司；L-硒代胱氨酸标准品（纯度＞95%）、L-硒代蛋氨酸标准品（纯度≥98%）：美国Sigma 公司；Se-甲基硒代-L-半胱氨酸标准品（纯度＞98%）：东京化成工业株式会社。
1.2 仪器与设备
立式压力蒸汽灭菌锅（DSX-18L）：上海申安医疗器械厂；台式叠加振荡培养箱（YJSY-110）：上海铱晶科技有限公司；全波长扫描式多功能读数仪（VARIOSKAN FLASH）：美国赛默飞世尔科技有限公司；台式低速离心机（TD5A）：湖南赫西仪器装备有限公司；超净工作台（SW-CJ-1D）：苏州净化设备有限公司；涡旋混匀器（Vortex 3）：德国IKA 公司；恒温水浴锅（HH-2）：北京科伟永兴仪器有限公司；pH 计（EL20）、分析天平（XPR）：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；液相色谱质谱联用仪（LCMS-8050）：日本岛津公司；超声清洗仪（IDH20）：德国爱安姆科技有限公司；高速冷冻离心机（5427R）、掌上离心机（MiniSpin plus）：德国艾本德股份公司；涡旋振荡器（vortex-genie 2）：美国Scientific Industries 公司。
1.3 方法
1.3.1 LB 培养基的制备
称取3 g 的LB 培养基于250 mL 锥形瓶中，加入150 mL 蒸馏水，加热使其充分溶解后在立式压力蒸汽灭菌锅中灭菌1.5 h，灭菌结束后静置至室温，于4 ℃冰箱保存备用。
1.3.2 菌种活化及富硒培养
吸取10 mL 菌悬液，在超净工作台上将菌悬液接种到LB 培养基中，在恒温培养箱中37 ℃培养24 h，连续活化三代，使纳豆芽孢杆菌处于对数生长期，三代菌继续活化6 h，按照接种量1% 接种1.5 mL 10-5 mol/L亚硒酸钠（Na2SeO3），富硒培养24 h，于4 ℃冰箱保存备用。
1.3.3 富硒鹰嘴豆纳豆的制备
称取1 g 鹰嘴豆粉，溶于10 mL 水中，灭菌结束静置至室温后保存备用。在超净工作台上将配制好的富硒菌悬液按照接种量3% 加入鹰嘴豆培养液中，在4 ℃下保存备用。
1.3.4 ACE 抑制率的检测方法
以FAPGG 作为血管紧张素I 的模拟底物，检测原理是ACE 水解FAPGG 释放N-[3-（呋喃）丙稀醇酰]-2-苯丙氨酸{N-[3-（2-furyl）acryloyl]-L-phenylalanyl，FAP}和双甘氨肽（glycyl-glycine，GG），随着肽类的释放，FAPGG 在340 nm 处的吸光度会降低，通过测定340 nm处的吸光度即可得到ACE 抑制率[23]。参考骆琳等[24]的方法，在简化试验步骤的同时减少了样品用量、节省试验时间，具体测定方法见表1。
表1 FAPGG 为模拟底物测定ACE 抑制率
Table 1 Determination of ACE inhibition rate with FAPGG as simulated substrate
试剂ACE FAPGG ACE 抑制肽无菌双蒸水样品/μL 10 50 40 0空白对照/μL 10 50 0 40
分别测定340 nm 下空白对照和样品的吸光度，记为A1 和A2，然后将96 孔板置于37 ℃振荡培养箱中反应30 min，再次测量吸光度，记为A3 和A4，进行3 次平行试验，结果取平均值。ACE 抑制率（E，%）按照下式（1）计算。
式中：ΔAa 为空白对照在30 min 内吸光度的变化，ΔAa=A1-A3；ΔAb 为样品在30 min 内的吸光度的变化，ΔAb=A2-A4。
1.3.5 单因素试验
以ACE 抑制率为判定标准，选取接种量、液料比、发酵温度、发酵时间4 个单因素进行单因素试验。每个单因素分别选取5 个水平，固定接种量3%、液料比10∶1（mL/g）、发酵温度37 ℃、发酵时间24 h[25]。
1.3.5.1 接种量对ACE 抑制率的影响
按照液料比10∶1（mL/g）配制发酵液，充分混合均匀，灭菌后静置至室温，设置接种量分别为1%、3%、5%、7%、9% 接种纳豆芽孢杆菌富硒，置于37 ℃振荡培养箱中培养24 h，培养完成后于4 ℃冰箱保存，等待检测。
1.3.5.2 液料比对ACE 抑制率的影响
设置液料比分别为10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g），按照设置的液料比加入蒸馏水，灭菌后静置至室温，按照接种量3%接种纳豆芽孢杆菌富硒，置于37 ℃振荡培养箱中培养24 h，培养完成后于4 ℃冰箱保存，等待检测。
1.3.5.3 发酵温度对ACE 抑制率的影响
按照液料比10∶1（mL/g）配制发酵液，充分混合均匀，灭菌后静置至室温，按照接种量3%接种纳豆芽孢杆菌富硒，设置发酵温度分别为27、32、37、42、47 ℃，每个温度分别培养24 h，培养完成于4 ℃冰箱保存，等待检测。
1.3.5.4 发酵时间对ACE 抑制率的影响
按照液料比10∶1（mL/g）配制发酵液，充分混合均匀，灭菌后静置至室温，按照接种量3%接种纳豆芽孢杆菌富硒，置于37 ℃振荡培养箱中，设置发酵时间分别为24、30、36、42、48 h，培养完成于4 ℃冰箱保存，等待检测。
1.3.6 响应面优化试验
根据单因素试验结果，选取接种量（A）、液料比（B）、发酵温度（C）3 个因素，以ACE 抑制率（Y1）为指标进行三因素三水平的响应面试验。根据优化结果进行验证试验，通过对比纳豆芽孢杆菌富硒和纳豆芽孢杆菌不富硒的ACE 抑制率，验证优化结果是否准确。试验因素与水平见表2。
表2 试验因素与水平
Table 2 Factors and levels of experimental
水平因素A 接种量/%-1 0 1 1 3 5 B 液料比/（mL/g）10∶1 15∶1 20∶1 C 发酵温度/℃34 37 40
1.3.7 UPLC-ESI-MS/MS 法测定富硒鹰嘴豆纳豆中的硒代氨基酸
1.3.7.1 标准溶液的配制
用分析天平称取适量的L-硒代胱氨酸、Se-甲基硒代-L-半胱氨酸、L-硒代蛋氨酸标准品，在超纯水中溶解后形成高浓度标准储备液，将储存液稀释成0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 μg/mL 的混合标准溶液，进行UPLC-ESI-MS/MS 分析。
1.3.7.2 样品前处理
准确称取液氮研磨好的0.200 g 富硒鹰嘴豆纳豆于5 mL 离心管中，加入1.0 mL 超纯水，冰上超声30 min，低速涡旋、离心混匀，4 ℃浸提12 h 后以12 000 r/min 离心20 min，过滤后取上清液过0.2 μm尼龙膜，采用UPLC-ESI-MS/MS 法对滤液中硒代氨基酸进行定性定量分析。
1.3.7.3 仪器分析条件
液相色谱条件：色谱柱为C18 色谱柱（2.1 mm×100 mm，3 μm），进样量为2.0 μL；流动相：A 为0.2%甲酸-水溶液，B 为乙腈溶液；流速0.4 mL/min。梯度洗脱程序见表3。
表3 梯度洗脱程序
Table 3 Gradient elution
时间/min 0 0.5 2.5 3.5 3.6 6.0流动相A/%75 75 5 5 7 5 75流动相B/%25 25 95 95 25 25
质谱条件：电喷雾正离子源模式（electrospray ionization，ESI）；离子源接口电压3.0 kV；雾化气为氮气（3.0 L/min）；干燥气为氮气（10 L/min）；碰撞气为氩气；脱溶剂管温度250 ℃；加热模块温度350 ℃；扫描模式为多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）；驻留时间100 ms。
1.4 数据处理
数据图采用Origin 2019 进行绘制，响应面优化试验采用Design-Expert 8.0.6.1 软件进行分析与设计，样品中的硒代氨基酸数据采用LabSolutions Ver.5.53 色谱工作站分析，应用SPSS 26.0 软件对数据进行差异显著性分析（P＜0.05）。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 接种量对ACE 抑制率的影响
接种量对ACE 抑制率的影响见图1。
图1 接种量对ACE 抑制率的影响
Fig.1 Effect of inoculation amount on ACE inhibition rate
不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
由图1 可知，当接种量为3%时，ACE 抑制率处于最大值85%。当接种量较低时，菌体产生的蛋白酶ACE 含量少，蛋白酶酶解蛋白质产生的ACE 抑制肽含量也较少，所以ACE 抑制率低；当接种量逐渐增大时，纳豆芽孢杆菌生长加快，ACE 抑制率增大；当接种量继续增大时，培养基中有限的营养物质会限制纳豆芽孢杆菌的生长，菌体凋亡导致其产生的具有抑制效果的蛋白酶含量随之减少，因此ACE 抑制率逐渐降低。因此，选择接种量1%、3%、5%进行响应面优化试验。
2.1.2 液料比对ACE 抑制率的影响
液料比对ACE 抑制率的影响见图2。
图2 液料比对ACE 抑制率的影响
Fig.2 Effect of liquid material ratio on ACE inhibition rate
不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
由图2 可知，当液料比为15∶1（mL/g）时，ACE 抑制率处于最大值，为89%。当提取液体积过少时，培养基中含水量较少，对纳豆芽孢杆菌富硒的生长和增殖不利，且蛋白酶的生成量也很少，相应的酶解蛋白质产生的ACE 抑制肽含量也较少，所以ACE 抑制率较低；当提取液体积逐渐增大时，适合富硒纳豆芽孢杆菌的生长和增殖，ACE 抑制率逐渐增大；但随着提取液体积继续增大，稀释了培养基中的营养物质，导致纳豆芽孢杆菌富硒难以满足自身生长所需要的营养物质，ACE 抑制率逐渐降低。因此，选择液料比10∶1、15∶1、20∶1（mL/g）进行响应面优化试验。
2.1.3 发酵时间对ACE 抑制率的影响
发酵时间对ACE 抑制率的影响见图3。
图3 发酵时间对ACE 抑制率的影响
Fig.3 Effect of fermentation time on ACE inhibition rate
不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
由图3 可知，当发酵时间为36 h，ACE 抑制率处于最大值84%。当发酵时间较短时，蛋白酶还没有完全释放，酶解蛋白质释放的ACE 抑制肽含量也较低；ACE 抑制肽含量随着发酵时间的延长逐渐增大，ACE抑制率升高；发酵时间延长到一定程度时，纳豆芽孢杆菌富硒生长进入稳定期，在前期通过发酵产生的小部分ACE 抑制肽被蛋白酶分解，失去了ACE 抑制活性，进而ACE 抑制率下降。因此，发酵时间最佳为36 h。
2.1.4 发酵温度对ACE 抑制率的影响
发酵温度对ACE 抑制率的影响见图4。
图4 发酵温度对ACE 抑制率的影响
Fig.4 Effect of fermentation temperature on ACE inhibition rate
不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
由图4 可知，当发酵温度为37 ℃时，ACE 抑制率为最大值84%。当发酵温度过高或过低时，纳豆芽孢杆菌富硒的生长受到抑制，蛋白酶活性减弱，代谢能力较差，酶解蛋白质产生的ACE 抑制肽较少，ACE 抑制率较低。因此，选择发酵温度34、37、40 ℃进行响应面优化试验。
2.2 响应面优化试验
根据单因素试验结果，选择接种量、液料比和发酵温度3 个因素进行响应面优化试验，响应面设计及结果如表4 所示。
表4 响应面设计及结果
Table 4 Response surface design and results
试验号A 1234567891 0-1 00-B00-1110-C10100000-11 12 13 14 15 16 17 1101000-10-10-11010 101001-1000-1 110-101-1 ACE 抑制率/%81.12 70.67 50.14 65.71 68.08 79.21 61.85 71.57 54.67 80.63 59.78 76.26 58.83 76.27 75.48 68.51 54.82
利用Design-Expert 8.0.6.1 软件，对多项式进行回归分析，得到的二次回归方程Y1=75.75+1.14A+4.88B+3.85C-0.18AB-7.34AC+6.61BC+4.60A2-12.28B2-4.45C2。
回归模型的方差分析见表5。
表5 回归模型的方差分析
Table 5 Analysis of variance of regression model
来源模型自由度显著性**ABCA B AC BC A2平方和1 456.28 10.31 190.13 118.58 0.12 215.21 174.77 0.14 91111111均方161.81 10.31 190.13 118.58 0.12 215.21 174.77 0.14 F 值10.08 0.64 11.84 7.39 7.631×10-3 13.41 10.89 8.977×10-3 P 值0.003 0 0.449 3 0.010 8 0.029 9 0.932 8 0.008 1 0.013 1 0.927 2**
续表5 回归模型的方差分析
Continue table 5 Analysis of variance of regression model
注：**表示影响极显著，P＜0.01。
来源B2 C2残差失拟项纯误差总误差平方和634.94 83.57 112.37 23.04 89.33 1 568.65自由度117341 6均方634.94 83.57 16.05 7.68 22.33 F 值39.55 5.21 P 值0.000 4 0.056 5显著性**0.34 0.796 5
由表5 可知，各因素对ACE 抑制率影响的顺序依次为接种量（A）＜发酵温度（C）＜液料比（B），说明液料比对纳豆芽孢杆菌富硒发酵鹰嘴豆产ACE 抑制肽的影响最大，发酵温度和接种量的影响较小。模型的R2为0.928 4，表明所建立的回归模型能够反映92.84%的响应值，所建立的回归模型具有很好的拟合度，可用于分析各因素对ACE 的抑制作用，数据可靠，分析结果具有可信性。
通过Design-Expert 8.0.6.1 软件得到的最优培养条件为接种量1.38%、液料比为18∶1（mL/g）、发酵温度39.49 ℃，预测的ACE 抑制率为91.90%。为了便于实际操作，将最优培养条件修正为接种量2%、液料比为18∶1（mL/g）、发酵温度40 ℃。重复3 组平行试验，计算得到ACE 抑制率为89.24%，在此培养条件下，纳豆芽孢杆菌不富硒发酵鹰嘴豆产ACE 抑制肽活性为66.35%。
图5～图7 为各因素间交互作用对ACE 抑制率影响的等高线及响应曲面。
图5 接种量和液料比的交互作用对ACE 抑制率影响的等高线及响应曲面
Fig.5 Contour line and response surface of the effect of the interaction between inoculation amount and liquid material ratio on ACE inhibition rate
图6 接种量和发酵温度的交互作用对ACE 抑制率影响的等高线及响应曲面
Fig.6 Contour line and response surface of the effect of the interaction between inoculation amount and fermentation temperature on ACE inhibition rate
图7 液料比和发酵温度的交互作用对ACE 抑制率影响的等高线及响应曲面
Fig.7 Contour line and response surface of the effect of the interaction between liquid material ratio and fermentation temperature on ACE inhibition rate
由图5～图7 可知，响应面的坡度表示试验因素对ACE 抑制率的影响大小，坡度越大表示影响越大。交互项AC 的等高线图为椭圆形，说明两两存在交互作用，AC 的交互作用极显著（P＜0.01），BC 和AB 的交互作用较小，近乎圆形。
2.3 鹰嘴豆纳豆中硒代氨基酸的检测分析
2.3.1 硒代氨基酸定量分析的标准曲线
根据1.3.7.1 配制标准溶液，横纵坐标分别为浓度和峰面积，绘制L-硒代胱氨酸、Se-甲基硒代-L-半胱氨酸、L-硒代蛋氨酸的标准曲线如图8 所示。
图8 硒代氨基酸的标准曲线
Fig.8 Standard curve for seleno-amino acids
（a）L-硒代胱氨酸；（b）Se-甲基硒代-L-半胱氨酸；（c）L-硒代蛋氨酸。
由图8 可知，在各自的浓度范围内，3 种硒代氨基酸浓度与峰面积呈现线性关系，说明该方法具有较高的灵敏度。
2.3.2 待测样品检测结果
对鹰嘴豆纳豆进行测定，将L-硒代胱氨酸、Se-甲基硒代-L-半胱氨酸和L-硒代蛋氨酸的峰面积分别代入标准曲线方程中计算出待测样本中各硒代氨基酸的浓度，结果如表6 所示。
表6 样品中硒代氨基酸浓度
Table 6 Concentration of seleno-amino acids in the sample
注：ND 表示在样品中未检测到该指标。
含量/（μg/g）1.780 0.160 ND项目L-硒代胱氨酸Se-甲基硒代-L-半胱氨酸L-硒代蛋氨酸浓度/（μg/mL）0.356 0.032 ND
由表6 可知，样品中的L-硒代胱氨酸含量最多，不含有L-硒代蛋氨酸。
3 讨论
研究表明，抗氧化活性越好，抑制ACE 活性的能力越强。硒元素可以与活性氧发生氧化反应生成Se-O化合物，之后Se-O 化合物又被迅速还原，表明硒元素具有良好的还原能力，其抗氧化能力较好[26]。Li 等[27]对卵清蛋白进行富硒化处理后，发现富硒后卵清蛋白抗氧化活性的增强与硒的偶联和蛋白质的熔融小球构象有关。程天德等[28]通过动物实验研究富硒大豆低聚肽在降血压方面的作用，结果表明，富硒大豆低聚肽能降低大鼠血清中ACE 活性，且这种降血压效果是硒和大豆低聚肽共同作用的结果。刘文颖等[29]开发了大豆低聚肽的中试生产，分析了大豆低聚肽的体外抗氧化活性和ACE 抑制活性，结果表明，大豆低聚肽含有两个新的强效抗氧化肽片段[Tyr-Glu：（8.61±0.42）mmol 等同物/g 样品；Asp-Tyr-Arg：（6.53±0.34）mmol 等同物/g 样品]和4 个ACE 抑制肽片段（Leu-Val-Arg：半抑制浓度IC50=51.75 μmol/L；Leu-Tyr：半抑制浓度IC50=305.76 μmol/L；Asp-Tyr-Arg：半抑制浓度IC50=1082.95 μmol/L；Asp-Phe：半抑制浓度IC50=1 106.04 μmol/L），这些肽片段的发现有助于开发功能性食品。根据温雪琴等[30]的研究，大豆不富硒得到的ACE 抑制率为64.21%，本研究得到的富硒鹰嘴豆的ACE 抑制率为89.24%，在富硒后ACE 抑制率提高了25.03%，为纳豆的高值化利用提供理论依据。综上，富硒后物质的抗氧化活性提高，从而抑制ACE 活性的能力也有所提高。
4 结论
在单因素试验结果基础上，通过响应面优化试验对纳豆芽孢杆菌富硒的培养条件进行优化，得到最优条件：接种量2%、液料比18∶1（mL/g）、发酵温度40 ℃。重复做3 组平行试验，得到ACE 抑制率为89.24%。对比纳豆芽孢杆菌富硒和纳豆芽孢杆菌不富硒发酵鹰嘴豆产ACE 抑制肽的活性，结果显示，纳豆芽孢杆菌富硒发酵鹰嘴豆产ACE 抑制肽活性为89.24%，纳豆芽孢杆菌不富硒发酵鹰嘴豆产ACE 抑制肽活性为66.35%，表明纳豆菌富硒后发酵鹰嘴豆对其ACE 抑制肽活性有促进作用。采用UPLC-ESI-MS/MS法对鹰嘴豆纳豆富硒后硒代氨基酸进行定性定量分析，结果表明，L-硒代胱氨酸是富硒鹰嘴豆纳豆中主要的硒代氨基酸。通过研究富硒鹰嘴豆纳豆中的ACE抑制肽，旨在探究其潜在的降压效果，并以此为基础，为富硒鹰嘴豆纳豆的高值化利用提供理论依据，同时也为开发新型食源性降压药物提供研究基础。
[1] 蔡金秀,夏姗姗,马佳雯,等.马面鱼皮ACE 抑制肽的制备、分离纯化及稳定性[J].中国食品学报,2022,22(3):225-234.CAI Jinxiu, XIA Shanshan, MA Jiawen, et al. Preparation, isolation and stability of collagen ACE inhibitory peptides from the skin of navodon septentrionalis[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology,2022,22(3):225-234.
[2] 周丽杰.牡蛎ACE 抑制肽的分离鉴定及性质研究[D].大连:大连海洋大学,2017.ZHOU Lijie. Studies on isolation and identification of ACE inhibitory peptides from oyster and their properties[D]. Dalian: Dalian Ocean University,2017.
[3] 王琳琳, 陈立, 李建科. 食源血管紧张素转化酶抑制肽研究进展[J].中国果菜,2020,40(6):71-76.WANG Linlin, CHEN Li, LI Jianke. Research progress of natural dietary ACE inhibitory peptide[J]. China Fruit & Vegetable, 2020,40(6):71-76.
[4] 杨云梅. 家蚕丝素蛋白ACE 抑制肽的制备及性能研究[D]. 镇江:江苏科技大学,2019.YANG Yunmei. Preparation of ACE-inhibitory peptides from bombyx mori silk fibroin and their physicochemical properties[D].Zhenjiang:Jiangsu University of Science and Technology,2019.
[5] 马文君,马涵萍,王运红,等.《2021 年中国心血管病医疗质量报告》概要[J].中国循环杂志,2021,36(11):1041-1064.MA Wenjun, MA Hanping, WANG Yunhong, et al. 2021 medical quality report of cardiovascular diseases in China: An executive summary[J].Chinese Circulation Journal,2021,36(11):1041-1064.
[6] HADIAN B,ZAFARMOHTASHAMI A,CHAGHERVAND Z,et al.Angiotensin-converting enzyme gene insertion/deletion polymorphism and hypertension disease[J].Archives of Physiology and Biochemistry,2022,128(5):1165-1169.
[7] 陈志钢,詹悦,张玉梅,等.新冠肺炎疫情对全球食物安全的影响及对策[J].中国农村经济,2020(5):2-12.CHEN Zhigang, ZHAN Yue, ZHANG Yumei, et al. The impacts of COVID-19 on global food security and the coping strategy[J]. Chinese Rural Economy,2020(5):2-12.
[8] 董亚蕾,刘文婧,曹进,等.超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法测定富硒食品中的硒代氨基酸[J]. 食品安全质量检测学报,2017,8(7):2401-2406.DONG Yalei, LIU Wenjing, CAO Jin, et al. Determination of selenoaminoacid in selenium enriched foods by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Food Safety&Quality,2017,8(7):2401-2406.
[9] 李浩男, 谢晓宇, 王立平. 硒营养与人体健康[J]. 食品工业,2022,43(3):325-330.LI Haonan,XIE Xiaoyu,WANG Liping.Selenium nutrition and human health[J].The Food Industry,2022,43(3):325-330.
[10] 王宇璇,孟淑娟,王雅栋,等.人体内硒检测与富硒食品开发的研究进展[J].食品工业科技,2022,43(4):428-437.WANG Yuxuan, MENG Shujuan, WANG Yadong, et al. Research progress of selenium detection in human body and development of selenium-rich food[J]. Science and Technology of Food Industry,2022,43(4):428-437.
[11] SUN P, LI J N, BU D P, et al. Effects of Bacillus subtilis natto and different components in culture on rumen fermentation and rumen functional bacteria in vitro[J]. Current Microbiology, 2016, 72(5):589-595.
[12] ZHANG J,BILAL M,LIU S,et al.Isolation,identification and antimicrobial evaluation of bactericides secreting Bacillus subtilis natto as a biocontrol agent[J].Processes,2020,8(3):259.
[13] 张雯,李宏杰,贾鸥,等.纳豆芽孢杆菌菌剂的制备工艺[J].陕西科技大学学报(自然科学版),2014,32(4):108-113.ZHANG Wen,LI Hongjie,JIA Ou,et al.Preparation process of Bacillus subtilis natto agents[J]. Journal of Shaanxi University of Science & Technology (Natural Science Edition), 2014, 32(4): 108-113.
[14] 王筝,李梦琴,林顺顺,等.鹰嘴豆全麦粉酥性饼干研制及品质分析表征[J].食品安全质量检测学报,2022,13(10):3352-3358.WANG Zheng,LI Mengqin,LIN Shunshun,et al.Development and quality analysis and characterization of chickpea whole wheat flour crisp biscuit[J]. Journal of Food Safety & Quality, 2022, 13(10):3352-3358.
[15] ZHAO X Y, SUN L, ZHANG X W, et al. Nutritional components,volatile constituents and antioxidant activities of 6 chickpea species[J].Food Bioscience,2021,41:100964.
[16] 马宏,赵雅霞,杨美娟,等.浅析鹰嘴豆粉的营养功能性及其应用[J].农产品加工,2021(14):17-19,21.MA Hong, ZHAO Yaxia, YANG Meijuan, et al. The analysis of the nutrition function and application of chickpea flour[J]. Farm Products Processing,2021(14):17-19,21.
[17] 莘继强.研究高血压的病因及发病机制[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(53):114-115.SHEN Jiqiang. To study the etiology and pathogenesis of hypertension[J].World Latest Medicine Information,2019,19(53):114-115.
[18] WU C H,MOHAMMADMORADI S,CHEN J Z,et al.Renin-angiotensin system and cardiovascular functions[J]. Arteriosclerosis,Thrombosis,and Vascular Biology,2018,38(7):e108-e116.
[19] TAMARGO M,TAMARGO J.Future drug discovery in renin-angiotensin-aldosterone system intervention[J]. Expert Opinion on Drug Discovery,2017,12(8):827-848.
[20] ABDEL-HAMID M, OTTE J, DE GOBBA C, et al. Angiotensin Iconverting enzyme inhibitory activity and antioxidant capacity of bioactive peptides derived from enzymatic hydrolysis ofbuffalo milk proteins[J].International Dairy Journal,2017,66:91-98.
[21] GAO J, LIU Q, ZHAO L, et al. Identification and antihypertension study of novel angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides from the skirt of Chlamys farreri fermented with Bacillus natto[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2021,69(1):146-158.
[22] 赵元晖,李八方,马敬军,等.海地瓜蛋白水解物中ACE 抑制肽的分离纯化及合成[J].高等学校化学学报,2012,33(2):308-312.ZHAO Yuanhui,LI Bafang,MA Jingjun,et al.Purification and synthesis of ACE inhibitory peptide from Acaudina molpadioidea protein hydrolysate[J]. Chemical Journal of Chinese Universities,2012,33(2):308-312.
[23] VERMEIRSSEN V, VAN CAMP J, VERSTRAETE W. Optimisation and validation of an angiotensin-converting enzyme inhibition assay for the screening of bioactive peptides[J]. Journal of Biochemical and Biophysical Methods,2002,51(1):75-87.
[24] 骆琳,丁青芝,马海乐.96 孔板法用于高通量血管紧张素转化酶抑制剂体外检测[J].分析化学,2012,40(1):129-134.LUO Lin,DING Qingzhi,MA Haile.Establishment of in vitro highthroughput activity detection method for angiotensin converting enzyme inhibitors based on 96 well plates[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry,2012,40(1):129-134.
[25] 高洁,高翔,于佳,等.纳豆菌发酵扇贝裙边制备ACE 抑制肽的工艺优化[J].现代食品科技,2018,34(11):165-175.GAO Jie, GAO Xiang, YU Jia, et al. Process optimization of ACE inhibitory peptides from scallop skirt fermented by Bacillus natto[J].Modern Food Science and Technology,2018,34(11):165-175.
[26] REICH H J, HONDAL R J. Why nature chose selenium[J]. ACS Chemical Biology,2016,11(4):821-841.
[27] LI C P, HE Z K, WANG X Y, et al. Selenization of ovalbumin by dry-heating in the presence of selenite: Effect on protein structure and antioxidant activity[J].Food Chemistry,2014,148:209-217.
[28] 程天德,戴必胜,梁延省.富硒大豆低聚肽降血压作用的研究[J].现代食品科技,2012,28(12):1664-1666.CHENG Tiande, DAI Bisheng, LIANG Yansheng. Blood pressure lowering of Se-riched soybean oligopeptides[J]. Modern Food Science and Technology,2012,28(12):1664-1666.
[29] 刘文颖,陈亮,谷瑞增,等.中试规模酶解制备的大豆低聚肽中抗氧化肽和ACE 抑制肽的分离和鉴定[J]. 现代食品科技,2017,33(9):147-158.LIU Wenying, CHEN Liang, GU Ruizeng, et al. Antioxidative peptides and angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides obtained from soybean by protease treatment at pilot scale[J]. Modern Food Science and Technology,2017,33(9):147-158.
[30] 温雪琴,刘屾,黄弢,等.大豆粕碱性蛋白酶水解肽及ACE 抑制活性的研究[J].食品研究与开发,2014,35(9):9-12,86.WEN Xueqin, LIU Shen, HUANG Tao, et al. ACE inhibitory activity on hydrolytic peptides from soybean meal hydrolyzed by alkaline protease[J]. Food Research and Development, 2014, 35(9): 9-12,86.