糜子（Panicum miliaceum L.）原名“稷、黍”，是禾本科黍属一年生草本禾谷类作物，脱壳后称为黄米或大黄米，糜子气候适应力强、生长周期短，糜子营养丰富，富含蛋白质、淀粉、膳食纤维和多种微量元素，是干旱、半干旱地区重要的粮食作物，常用于糜子黄酒的酿造[1]。
谷物发芽期间，酶活性提高[2]，呼吸作用加强，淀粉和蛋白质等大分子物质被分解，还原糖、非还原糖和氨基酸等物质含量上升[3]，γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）[4]、多酚[5]等功能性成分含量显著升高，使得营养品质得到提升。汪昱柯等[4]发现糙米发芽可激活内源酶，增加GABA、酚酸等功能成分含量。Wang等[2]发现经超声波处理糙米活力、黄酮含量得到提高。发芽有利于释放谷物活性成分，便于谷物食品的加工。
超声波处理有利于加快谷物发芽速度，提高种子发芽率[6]。Chen 等[7]发现超声处理使发芽时间缩短，同时，超声处理显著提高了蛋白酶、淀粉酶和过氧化物酶的活性。Zhang 等[8]对玉米进行超声处理后萌发，发现淀粉含量下降，还原糖含量上升，GABA 效果的富集效果显著[9]。
目前，带壳糜子的加工方式比较单一，利用超声波处理发芽可作为改善糜子品质的安全可行方法。本研究以‘榆黍1 号’（糯性）为研究对象，研究超声波处理对发芽糜子色值、还原糖含量、游离氨基酸含量、GABA 含量、总酚含量、总黄酮含量等品质指标、酶活和抗氧化活性的影响，以期为改善发芽糜子的品质及抗氧化活性方面提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
‘榆黍1 号’（糯性）带壳糜子：陕西省榆林市府谷县，常温储存。
多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性检测试剂盒、过氧化物酶（peroxidase，POD）活性检测试剂盒、表儿茶素、槲皮素、阿魏酸、芦丁、17 种氨基酸、没食子酸等标准品、1，1-二苯基-2-苦肼基（1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH）、2，2′-联氨-双3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2，2′-azinobis- 3-ethylbenzthiazoline-6- sulphonate，ABTS）标准品、2，4，6-三（2-吡啶基）-1，3，5-三嗪[2，4，6-tri（2-pyridinyl）-1，3，5-triazine，TPTZ]：北京索莱宝科技有限公司；总蛋白酶活性试剂盒：上海江莱生物科技有限公司；浓硫酸、无水乙醇、盐酸、亚硝酸钠、氯化铝、氢氧化钠、硫酸亚铁（均为分析纯）：四川西陇科学有限公司。
1.2 仪器与设备
育苗盘：迦缘菌业有限公司；UP3200H 超声波清洗机：深圳市洁盟清洗设备有限公司；PTX-FA110 电子天平：福州华志科学仪器有限公司；HC-3018R 高速冷冻离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；UV1780紫外-可见分光光度计、LC-2030 高效液相色谱仪：日本岛津公司；FW-100 型高速万能粉碎机：上海书培实验设备有限公司；SHA-BA 恒温水浴振荡器：常州金坛宏华仪器厂；LRH-250CL 低温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；CM-5 型色差仪：美国HunterLab 公司；A1100 型氨基酸专用高效液相色谱仪：美国Agilent公司。
1.3 方法
1.3.1 发芽糜子制备
将‘榆黍1 号’（糯性）带壳糜子去除病虫害以及不完整的糜子后，用1%次氯酸钠浸泡30 min 消毒，用去离子水冲洗3 次后于25 ℃浸泡12 h；将浸泡好的糜子冲洗，放于育苗盘中，于35 ℃发芽24 h，发芽完毕擦干表面水分，即为普通发芽组（common germination，CG）；在预试验的基础上，在浸泡前进行超声波处理（96 W，40 kHz，15 min）后发芽的糜子，即为超声波处理发芽组（ultrasonic germination，UG）；未经任何处理的糜子为对照组（control check，CK）。
糜子放入-80 ℃冰柜进行12 h 的预冻处理，然后冷冻干燥处理48 h，接着利用高速万能粉碎机进行粉碎处理得到糜子粉。
1.3.2 色值测定
使用色差仪测定发芽糜子粉的颜色，颜色特性分别使用L*值、a*值和b*值表示。L*值代表亮度：当L*值为0 时代表黑色，L*值为100 时为白色；a*值代表红色（+）和绿色（-）；b*值代表黄色（+）和蓝色（-）[10]，总色差（ΔE）按公式（1）计算。
式中：ΔL*、Δa*、Δb*分别表示处理组与对照组之间L*值、a*值、b*值的差值。
1.3.3 GABA、游离氨基酸和糖类含量测定
GABA 含量测定参照汪昱柯等[4]的方法，略有改动。称取1.000 g 糜子粉，与60% 乙醇溶液按料液比1∶6（g/mL）混合振荡提取2 h，离心后上清液为GABA提取液。取0.5 mL 提取液与0.4 mL 0.2 mol/L 硼酸盐溶液、2 mL 6% 的苯酚溶液和0.9 mL 8% 次氯酸钠溶液混合均匀，于波长645 nm 处测定吸光度，GABA 含量以mg/g 干样（dry weight，DW）计。
游离氨基酸含量参照徐磊[11]的方法。称取糜子粉1.00 g 于50 mL 容量瓶中，利用1%磺基水杨酸溶液定容，充分混匀后用0.22 μm 的微孔过滤膜过滤后使用高效液相色谱仪进行检测。色谱条件为色谱柱：hypersil ODS C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温：40 ℃，流速：1.0 mL/min，紫外检测器：254 nm，流动相A 为甲醇；流动相B 为80%乙腈；流动相C 为0.05 mol/L 乙酸钠-乙酸缓冲液（pH6.5），利用外标法测得样品中17 种氨基酸含量。
还原糖、非还原糖含量按照GB 5009.7—2016《食品安全国家标准食品中还原糖的测定》测定。
1.3.4 糜子酶活性的测定
萌发糜子的酶活性测定均以鲜样（fresh weight，FW）计；PPO 活性、POD 活性和总蛋白酶活性采用试剂盒测定；淀粉酶活性根据3，5-二硝基水杨酸比色法测定[12]。
1.3.5 黄酮和总酚含量测定
1.3.5.1 提取液的制备
参考杨苗等[10]的方法进行黄酮和多酚含量的测定。将糜子粉过60 目筛后取0.5 g 粉末加入5 mL 甲醇，超声辅助提取30 min。8 000 r/min 离心10 min，收集上清液。
1.3.5.2 总酚含量的测定
糜子提取液中总酚含量的测定采用福林酚法。将1 mL 提取液与2 mL 10% 的福林酚溶液混合，再加入2.5 mL 2.0% Na2CO3 溶液，暗反应在25 ℃下进行60 min，于765 nm 处测定吸光度。以没食子酸为标准绘制标准曲线，结果以没食子酸（gallic acid，GA）当量表示，单位为mg GA/g DW（DW 表示以干重计）。
1.3.5.3 总黄酮含量的测定
糜子提取液中的总黄酮含量采用氯化铝比色法[10]测定。以芦丁为标准绘制标准曲线，结果以芦丁（rutin equivalent，RE）当量表示，单位为mg RE/g DW。具体方法如下：将1 mL 的提取液与0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液混合反应5 min，随后加入0.3 mL 10% 三氯化铝溶液反应5 min，然后加入2 mL 2 moL/L NaOH 溶液，黑暗处反应15 min，于510 nm 波长处测定吸光度。
1.3.5.4 酚类物质的含量及组成
根据杨苗等[10]的方法略作修改。将标准品溶液过0.22 μm 的微孔过滤膜过滤后使用高效液相色谱仪进行检测，绘制标准曲线。色谱柱为Waters C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流动相A 为0.1% 甲酸水溶液；流动相B 为乙腈。所有样品均经过0.22 μm 的微孔滤膜过滤后检测。流速为1 mL/min，柱温箱温度为30 ℃，检测波长为280 nm。
1.3.6 抗氧化活性
DPPH 自由基清除率和ABTS+自由基清除率按照杨苗等[10]的方法测定，计算公式如公式（2）～（3）所示。铁离子还原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）参考常强等[13]的方法测定，以水溶性维生素E（Trolox）为标准绘制标准曲线，结果以Trolox 当量表示，单位为μmol Trolox/g DW。
式中：D 为DPPH 自由基清除率，%；A0 为提取液的空白吸光度；A1 为加提取液后样品的吸光度；A2 为工作液的吸光度。
式中：A 为ABTS+自由基清除率，%；A0 为空白管的吸光度；A1 为样品吸光度；A2 为ABTS 工作液吸光度。
1.4 数据统计与处理
采用Excel 2017 进行数据平均值和标准差的计算；Minitab 18.0 统计软件的Turkey 试验法进行显著差异性（P＜0.05）分析；采用Origin 2023 进行绘图；每组试验重复3 次，结果以平均值±标准差的形式表示。
2 结果与分析
2.1 超声波处理对糜子粉色值的影响
发芽过程中存在色素代谢，会导致色值的变化[14]。不同处理对糜子粉色值的影响如图1、表1 所示。
表1 不同处理对糜子粉色值的影响
Table 1 Effect of different treatments on the color value of proso millet powder
注：同列不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
不同处理CK CG UG L*值76.13±0.01c 80.21±0.01a 79.93±0.01b a*值4.18±0.01a 3.14±0.01c 3.18±0.01b b*值18.16±0.02a 15.99±0.01c 16.28±0.01b ΔE 4.74±0.01 4.36±0.02
图1 不同处理对糜子粉色值的影响
Fig.1 Effect of different treatments on the color value of proso millet powder
由表1 可知，糜子发芽后，L*值升高，a*值和b*值下降（P＜0.05），整体颜色偏白（图1）。与CG 处理组相比，UG 处理下糜子L*值显著下降，a*值和b*值显著上升。超声波提高内源酶活性，淀粉与蛋白的分解速度加快，同时富集类胡萝卜素、叶黄素等色素，从而导致亮度值降低，红黄值有所提升[3]。ΔE 值越大说明其色泽变化越大。当3.0＜ΔE＜6.0 时，说明样品与对照组相比有差异；ΔE＞6.0 时，样品与对照组相比有显著差异。发芽后糜子粉的ΔE 值均大于3.0，说明发芽糜子与对照组相比色泽有差异，这可能是发芽过程中色素代谢导致的[11]。
2.2 超声波处理对糜子糖类、GABA 和游离氨基酸含量的影响
不同处理条件下对糜子糖类物质的影响如图2所示。
图2 不同处理对糜子糖类物质的影响
Fig.2 Effect of different treatments on sugar substances of proso millet
不同字母表示同一指标差异显著（P＜0.05）。
由图2 可知，糜子发芽后，CG 组和UG 组还原糖含量显著上升，分别上升271.42%和328.57%；非还原糖含量显著提高，分别提高9.42%和10.14%。还原糖和非还原糖含量的上升使得总糖含量显著提高（P＜0.05），发芽导致糜子中淀粉酶活性提高，将淀粉水解成小分子糖类物质[15]。与CG 组相比，UG 组的还原糖含量升高15.38%。这是因为在超声波的空化效应及热能效应下，生化反应进程加快，同时淀粉酶活力提升，促进淀粉分解生成还原糖[16]。
不同处理条件下对糜子GABA 含量的影响如图3所示。
图3 不同处理对糜子GABA 含量的影响
Fig.3 Effect of different treatments on GABA content in proso millet
不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图3 可知，发芽可使糜子中的GABA 含量显著提高。与CK 组对比，CG 组和UG 组GABA 含量提高了284.61% 和353.85%；与CG 组相比较，UG 组的GABA 含量升高了18.00%。这可能是由于发芽后，与GABA 生成密切相关的谷氨酸脱羧酶活性升高。超声波处理下，谷氨酸脱羧酶的活性有进一步的提升，加快GABA 的合成[17]。
本研究共检测了17 种游离氨基酸，游离氨基酸按照人体能否自行合成分为必需游离氨基酸和非必需游离氨基酸。表2 为不同处理的糜子中游离氨基酸的含量。
表2 不同处理的糜子游离氨基酸含量
Table 2 Free amino acid content of proso millet in different treatments mg/100 g
注：同行不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
游离氨基酸含量组氨酸苏氨酸缬氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸异亮氨酸赖氨酸亮氨酸必需游离氨基酸总量天冬氨酸谷氨酸丝氨酸甘氨酸精氨酸丙氨酸酪氨酸半胱氨酸脯氨酸非必需游离氨基酸总量游离氨基酸总量CK 1.57±0.11c 1.05±0.00b 1.68±0.06b 0.70±0.11b 0.80±0.00b 0.54±0.01b 0.95±0.02b 0.47±0.03b 7.25±1.04b 9.43±0.14b 10.69±2.44b 2.29±0.09b 1.03±0.03b 3.76±0.09b 5.78±0.12b 0.50±0.55b 2.81±0.00a 5.70±0.25b 42.00±2.11b 49.77±2.41b CG 3.30±0.12a 5.29±0.04a 11.50±0.14a 4.24±0.01a 11.75±0.07a 7.82±0.05a 24.50±0.28a 2.85±0.33a 68.60±3.79a 9.87±0.04a 18.68±0.03a 7.45±0.06a 3.07±0.04a 9.64±0.09a 32.61±0.01a 9.67±0.02a 0.44±0.03b 16.00±0.99a 107.40±0.94a 178.64±1.09a UG 2.80±0.02b 5.21±0.15a 11.53±0.42a 4.30±0.21a 12.09±0.58a 8.19±0.45a 24.92±1.03a 2.15±0.35a 68.57±5.89a 9.64±0.11ab 17.37±0.27a 7.47±0.24a 2.94±0.10a 9.31±0.34a 34.25±1.33a 9.94±0.28a 0.20±0.04c 15.62±1.41a 106.75±4.13a 177.95±6.59a
由表2 可知，糜子发芽后，游离氨基酸总量显著提高（P＜0.05）。与CK 组相比，CG 组和UG 组必需游离氨基酸总量均升高8.46 倍，非必需游离氨基酸总量升高1.56 倍和1.54 倍，游离氨基酸总量升高2.58 倍和2.57 倍。这是由于发芽后蛋白酶活性增强，蛋白质和多肽发生水解，使得游离氨基酸含量增加[18]。单迪[19]研究发现超声处理的发芽粟米游离氨基酸含量比普通发芽组高，本研究UG 组与普通发芽组（CG）的游离氨基酸含量变化不明显，这可能是由于超声浸泡后发芽促使游离氨基酸在浸泡液中损失[20]。与CG 组相比，UG 组苯丙氨酸和酪氨酸含量提高2.89%和3.11%，增强发芽糜子的芳香味；精氨酸和亮氨酸含量降低3.72%和42.56%，减少了发芽糜子中的苦味。
2.3 超声波处理对糜子酶活性的影响
不同处理对糜子淀粉酶、蛋白酶、PPO 和POD 活性的影响如图4 所示。
图4 不同处理对糜子酶活性的影响
Fig.4 Effect of different treatments on enzymatic activity of proso millet
A.淀粉酶；B.蛋白酶；C.多酚氧化酶和过氧化物酶。不同小写字母表示同一指标不同组别差异显著，P＜0.05。
由图4 可知，发芽后，α-淀粉酶活性显著上升，CG 和UG 组的α-淀粉酶活性分别提高13.10% 和30.13%；总淀粉酶活性在CG 组提高了15.13%；在UG 处理组显著提高108.21%。蛋白酶活性在CG 组和UG 组分别提高了68.75%和106.25%；与CG 组相比，UG 组的蛋白酶活性提高了22.22%。与CK 组和CG 组对比，UG 组的PPO 和POD 活性显著升高。UG 组糜子PPO活性分别是CK 和CG 的1.54 倍和1.23 倍；POD 活性分别是CK 组和CG 组的1.42 倍和1.26 倍。超声波辅助处理使得糜子酶活性提高，可能是由于超声波作用时出现空化效应，产生高温、高压、高能量密度冲击波、微射流等，影响酶分子的构象，进而影响酶的活性[21]。
2.4 超声波处理对糜子总酚、总黄酮和抗氧化活性的影响
2.4.1 超声波处理对糜子总酚、总黄酮含量的影响
不同处理对糜子黄酮和总酚含量的影响如图5所示。
图5 不同处理对糜子黄酮和总酚含量的影响
Fig.5 Effect of different treatments on flavonoid and total phenol content of proso millet
不同字母表示同一指标不同组别差异显著，P＜0.05。
由图5 可知，发芽后，糜子的总酚和总黄酮含量显著升高。与CK 组相比，CG 组和UG 组的总黄酮含量上升8.04%和41.37%，总酚含量上升95.77%和83.80%。与CG 组相比，UG 组的总黄酮含量上升了30.85%。这是因为超声波技术可有效增强查耳酮合成酶的表达，这类酶与类黄酮的生物合成有关；此外，苯丙氨酸解氨酶是类黄酮合成代谢过程中的关键限速酶，通过超声波处理增加其活性将有利于黄酮类物质的合成[19]。与CG 组相比，UG 组的多酚含量下降6.11%，这可能是由于UG 组的多酚氧化酶的活性高于CG组，多酚被氧化分解的速率提升（图4）；也可能是超声作用使得多酚在浸泡过程中在浸泡液中的损失增加[20]，导致多酚含量有所下降。
2.4.2 超声波处理对糜子单体酚的影响
为进一步分析超声波处理对糜子发芽酚类物质的影响，本研究进行了单体酚组成及其含量的测定，结果如表3 所示。
表3 不同处理对糜子发芽单体酚含量的影响
Table 3 Effect of different treatments on the free phenol content in germination of proso millet μg/g DW
注：同列不同字母表示差异显著（P＜0.05）；ND 表示未检出。
组别CK CG UG没食子酸2.20±0.84b 3.78±0.37b 5.08±0.17a儿茶素574.83±5.08b 591.31±5.01ab 601.27±11.45a表儿茶素ND 1.63±0.85b 6.77±0.10a芦丁23.66±0.97a 11.23±0.15b 12.44±0.06b原儿茶素5.73±0.45a 2.51±1.27b 2.87±0.23b咖啡酸0.35±0.08b 0.69±0.10b 1.09±0.16a对香豆酸ND ND 1.46±0.16阿魏酸2.81±0.47b 6.69±0.29a 7.40±1.04a槲皮素45.59±0.61a 48.75±4.89a 46.78±1.55a
由表3 可知，发芽后，没食子酸、儿茶素、表儿茶素、咖啡酸、阿魏酸和槲皮素含量提高；芦丁和原儿茶素含量有所下降。发芽使得糜子中的单体酚的含量和组成发生变化，有利于把糜子中结合型的没食子酸、儿茶素、咖啡酸和槲皮素游离出来，有利于酚类物质的释放。芦丁和原儿茶素含量降低可能是由于发芽过程中该酚类化合物被转化或代谢[22]。
2.4.3 超声波处理对糜子抗氧化活性的影响
不同处理对糜子发芽抗氧化活性的影响如图6所示。
图6 超声波处理对糜子发芽抗氧化活性的影响
Fig.6 Effect of ultrasonic treatment on antioxidant activity in germination of proso millet
A.DPPH 自由基清除率和ABTS+自由基清除率；B.铁离子还原能力（FRAP）。不同字母表示同一指标不同组别差异显著，P＜0.05。
由图6 可知，与CK 组相比，CG 组和UG 组的ABTS+自由基清除率分别提升10.23%和6.73%，DPPH自由基清除率提高了3.71% 和2.96%，FRAP 显著升高，分别升高6.07%和10.64%。与CG 组相比，UG 组的FRAP 提高了4.29%。由此可知，发芽能使抗氧化活性提高，超声波处理发芽在一定程度上进一步促进了抗氧化活性的提升。抗氧化活性的增强可能与物质中总酚和总黄酮化合物含量的增加有关[23]。
2.5 相关性分析
为了进一步分析超声波处理对糜子发芽总酚、总黄酮含量和抗氧化活性的关系，本研究对其进行了相关性分析，结果如表4 所示。
表4 酚类和抗氧化活性之间的皮尔逊相关系数
Table 4 Pearson's correlation coefficients between phenol compounds and antioxidant activity
注：*表示相关性显著（P＜0.05）。
指标总酚含量总黄酮含量DPPH 自由基清除率ABTS+自由基清除率FRAP总酚含量总黄酮含量DPPH 自由基清除率ABTS+自由基清除率FRAP 1 0.559 0.997*1 0.494 1 0.974 0.357 0.988 1 0.849 0.912 0.807 0.708 1
由表4 可知，总酚和总黄酮含量与抗氧化活性均呈现正向关系，总酚和DPPH 自由基清除率呈显著正相关。由此可以得出结论，总酚对抗氧化活性贡献较大[13]。
4 结论
本研究结果表明，发芽后，L*值升高，a*值和b*值下降；酶活性和抗氧化能力增强；游离氨基酸含量增加。与CG 组相比，UG 组的GABA 含量升高了18.00%，还原糖含量升高了15.38%，黄酮含量上升了30.85%，蛋白酶活性提高22.22%，多酚氧化酶活性是CG 组的1.23 倍，过氧化物酶活性分别是CG 组的1.26 倍，酶活性和抗氧化活性得到进一步提升。超声波处理有利于发芽糜子的酶活性和抗氧化活性的提升。
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