醪糟作为我国传统的谷物发酵饮料，与东南亚及非洲等发展中地区的一些发酵饮品极为相似，其特点为低酒精度、高糖度、酸甜适口、醇香诱人，深受人们青睐，是一种常见的地方民间小吃，也是世界上存在的最为古老的传统发酵饮品之一。南方地区的醪糟以糯米为主要原料，因糯米别称江米或酒米，故醪糟有江米酒、甜米酒、伏汁酒、甜酒酿、酒酿儿等别名。在我国北方，醪糟以黍米为主要原料，在玉米与小麦发芽所制成的麦曲的作用下发酵而成。牧区醪糟是内蒙古鄂尔多斯地区传统的谷物发酵类饮品，极具少数民族与地域特色，有着悠久的食用历史、较高的营养与功能价值。
燕麦富含蛋白质、不饱和脂肪酸、矿物质、维生素、酚类化合物及可溶性膳食纤维，具有较高的营养价值、药用价值、美容价值、食用价值[1-2]。研究表明，燕麦具有调节血脂、内皮细胞功能、血凝和纤维蛋白溶解性，提高机体免疫力，降低胆固醇，调节血糖、血压，改善肠道菌群，对抗肥胖、慢性肾脏病、紫外线等生物活性[3-4]。
燕麦醪糟以内蒙古鄂尔多斯地区牧区醪糟为启发，以燕麦-黍米复合粉为原料，加水高温糊化，经玉米芽粉液化，而后经高温发酵得到的固液混合物。燕麦醪糟的研制，既丰富了醪糟的种类，又开发了新型燕麦食品，燕麦醪糟含有丰富的营养成分及功能成分，有助于消化、提高免疫力、降血糖等[5]。迄今为止，醪糟的生产多为家庭或作坊式生产，存在产品品质不稳定、产业化生产困难等问题。燕麦醪糟的接种发酵能够抑制有害微生物生长、增强燕麦醪糟的风味、提升燕麦醪糟的品质稳定性等，已有明确的工艺参数[6]。燕麦醪糟选用燕麦为原料，同时研究燕麦醪糟稳定的生产工艺参数，有别于传统的家庭或作坊式生产的牧区醪糟。独特的发酵工艺和原料造就了燕麦醪糟特有的风味，其主要的风味物质包括挥发性风味成分、氨基酸、脂肪酸、糖类等，但关于燕麦醪糟发酵过程中风味的变化目前研究较少。
本研究对燕麦醪糟发酵过程跟踪取样，检测样品总游离氨基酸、挥发性脂肪酸、挥发性成分等指标，并对样品挥发性成分进行主成分分析（principal component analysis，PCA），探寻不同发酵阶段的样品挥发性成分的差异，深入全面了解接种发酵燕麦醪糟发酵过程中风味物质的动态变化，以期为优质燕麦醪糟的生产提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
燕麦粉、黍米粉、玉米芽粉：市售；牧区醪糟分离菌（乳酪短杆菌、枯草芽孢杆菌）：从鄂尔多斯地区的牧区醪糟中分离得到；果酒酵母：安琪酵母股份有限公司；马克思克鲁威酵母：内蒙古河套酒业集团股份有限公司；2-辛醇标准品（色谱纯）：上海安谱实验科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
7890A/5975C 气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪、G6580-CTC 自动进样器：美国Agilent 公司；DB-WAX 毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.2 μm）：美国Varian 公司；50/30 μm 复合DVB-CAR-PDMS 萃取头：美国Supelco 公司；超声波清洗器（SB-5200DT）：宁波新芝生物科技股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 工艺流程及操作要点
燕麦醪糟发酵工艺流程如下。
燕麦醪糟发酵操作要点如下。
1）燕麦粉、黍米粉、玉米芽粉保证品质完好、新鲜无霉味，过40 目筛，备用。
2）燕麦-黍米复合粉糊化、液化：称取燕麦-黍米复合粉100 g，按照料液比1∶3（g/mL）加水煮制30 min，边煮边搅拌；稍冷却后加入10%的玉米芽粉，液化15 min，无菌环境中搅拌并凉至35 ℃。
3）酵母菌、醪糟分离菌种子液制备：活化后种子液3 000 r/min 离心10 min，离心后弃上清液，加入0.85%的生理盐水制成菌悬液，按10%的接种量于液化液中驯化培养，培养成熟后于4 ℃冰箱冷藏备用[6]。
4）接种：在无菌的环境中，按体积比1∶3 接入酵母菌、醪糟分离菌，将两类菌均匀混合，按10%的接种量接入燕麦-黍米液化液中。
5）发酵：接种后的混合液在30 ℃发酵24 h 后50 ℃继续发酵48 h，共计发酵72 h。
6）样品制备：燕麦醪糟终产品为发酵后的固液混合物。从发酵0 h 开始，每发酵24 h 取样1 次，共计取样4 次，每个样品均进行3 次重复。
1.3.2 燕麦醪糟发酵过程中pH 值、总酸含量、氨态氮含量的测定
氨态氮含量、总酸含量、pH 值参考GB/T 13662—2018《黄酒》中的方法测定。
1.3.3 总游离氨基酸含量的测定
参考文献[7]的方法测定总游离氨基酸含量。测定条件：分析柱（4.6 mm×60 mm）；树脂为2622#；柱温57 ℃；反应柱温135 ℃；缓冲液为柠檬酸、柠檬酸钠缓冲液；显色液为茚三酮溶液。前处理方法：准确称取100 mg（精确至0.000 1 mg）样品，放入玻璃试管中，加入15 mL、6 mol/L 盐酸溶液，抽真空，拧紧螺盖。在110 ℃条件下，水解22～24 h，过滤、超纯水定容至50 mL。取1 mL 过滤液减压蒸干。用0.02 mol/L 盐酸溶液定容至一定体积，上机分析。
1.3.4 燕麦醪糟发酵过程中挥发性成分分析方法
1.3.4.1 挥发性香气成分的吸附与解吸
吸取8 mL 燕麦醪糟样品放入20 mL 干净的顶空进样瓶中，加入2.5 g 氯化钠，四氟乙烯密闭瓶口，置于25 ℃超声波清洗器中保持20 min，然后将其置于自动进样装置，50 ℃平衡45 min，将75 μm DVB-CARPDMS 萃取头插入进样瓶中，250 ℃解吸5 min，进行GC-MS 检测。
1.3.4.2 GC-MS 分析条件
色谱柱：DB-WAX 毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.2 μm）；升温程序：起始温度35 ℃，保持4 min，以5 ℃/min 升温至150 ℃，保持2 min，再以3 ℃/min 升温至210 ℃，保持5 min[8]。
1.3.4.3 质谱条件
电子轰击离子源（electron impact ion source，EI）、温度200 ℃、电子能量70 eV、质量扫描范围m/z 35～450、扫描速度909 u/s、光电倍增管电压800 V。扫描方式：全扫描；质谱库：NIST147 和NIST27。
1.3.4.4 定性与定量分析
对检测的挥发性成分与NIST147 和NIST27 质谱库进行对比解析，根据匹配度初步确定各易挥发成分的结构，进行定性。各香气组分的相对含量以各色谱峰的峰面积与总峰面积之比表示[9]。内标法定量：以2-辛醇为内标，将2-辛醇的色谱峰面积与挥发性香气化合物的色谱峰面积进行比较，每种香气化合物在样品中相对于内标的浓度计算公式如下。
Ci=Si/Sa×Ca
式中：Ci 为未知挥发性化合物的浓度，ng/L；Si 为内标物浓度，ng/L；Sa 为内标物的峰面积；Ca 为未知化合物的峰面积。
1.4 数据处理
采用Excel 对数据进行处理并作图；采用SPSS 25.0 分析软件进行方差分析及主成分分析；每组试验做3 组平行，数据结果以平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 燕麦醪糟发酵过程中理化指标的分析
2.1.1 燕麦醪糟发酵过程中pH 值、总酸含量的变化
图1 为燕麦醪糟发酵过程中pH 值、总酸含量的变化。
图1 燕麦醪糟发酵过程中pH 值、总酸含量的变化
Fig.1 Changes in pH and acid content of oat Laozao during the fermentation process
由图1 可知，燕麦醪糟接种发酵，随着燕麦醪糟发酵时间的延长，pH 值呈下降趋势，总酸含量整体呈上升趋势。pH 值的变化趋势与于晓妮[10]的研究结果一致。随着发酵的进行，产酸菌的产酸量不断升高，pH 值持续下降，发酵24 h 内，pH 值下降最明显；发酵24 h后，pH 值趋于稳定，这是由于随着发酵时间的延长，燕麦醪糟中可发酵性糖转化为酸，总酸含量上升，pH 值下降。燕麦醪糟中的营养成分随着发酵时间的延长而减少，产酸菌逐渐老化，产酸能力降低。pH 值与总酸含量变化规律呈负相关，与陈小琴[11]的研究结果相符。pH 值和总酸含量的变化，能够改善燕麦发酵制品的风味，因此实时监控发酵过程中总酸含量与pH 值的变化非常必要，若酸值过大则会影响最终发酵成品的品质与口感，适当的酸类物质可以抑制杂菌，增加燕麦醪糟的浓厚感，缓冲甜味。
2.1.2 燕麦醪糟发酵过程中氨态氮的分析
氨态氮也称为氨基氮或氨基酸态氮，是以氨基酸形式存在的氮元素含量，是判断发酵程度的重要指标之一。燕麦醪糟发酵过程中氨态氮含量的变化见图2。
图2 燕麦醪糟发酵过程中氨态氮含量的变化
Fig.2 Changes in ammonia nitrogen content of oat Laozao during the fermentation process
由图2 可知，燕麦醪糟接种发酵，氨态氮含量随着燕麦醪糟发酵时间的延长呈现先升高后降低的趋势；在0～24 h 时，氨态氮含量明显升高，24 h 时含量达到最大值（0.39 g/L），随后下降，变化趋势与史晓萌等[12]的研究结果基本一致。燕麦醪糟发酵过程中氨态氮呈现转化、消耗、合成的复杂态势，微生物利用蛋白酶及肽酶等将发酵体系中的蛋白高效降解，将其分解成自身生长所需的小分子氮源，同时丰富了燕麦醪糟的风味，提高了人体对燕麦蛋白的利用[13]。
2.2 燕麦醪糟发酵过程中风味物质含量变化分析
2.2.1 燕麦醪糟发酵过程中总游离氨基酸含量的变化分析
燕麦醪糟中的氨基酸具有呈味作用，对燕麦醪糟的风味及感官品质有重要的贡献[14]。燕麦醪糟发酵过程中总游离氨基酸含量的变化见表1。
表1 燕麦醪糟发酵过程中总游离氨基酸含量的变化
Table 1 Free amino acid content in oat Laozao during the fermentation process
注：不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
总游离氨基酸含量/%1.46±0.03b 1.60±0.10a 1.44±0.12b 1.42±0.10b发酵时间/h 0 24 48 72
由表1 可知，总游离氨基酸含量随着燕麦醪糟发酵时间的延长呈先上升后下降趋势；发酵24 h 时，燕麦醪糟总游离氨基酸含量达到最大，显著高于其他发酵时间（P＜0.05）。总游离氨基酸含量呈动态变化，发酵初始阶段（0～24 h），总游离氨基酸增长迅速，与黄和升等[15]的研究结果一致。燕麦醪糟发酵前期，营养成分充足，接入的微生物生长代谢比较旺盛并能够分泌产生蛋白酶、肽酶等，水解原料中的蛋白质、多肽等大分子物质，进而使氨基酸含量增加[16]。不同的氨基酸分别呈鲜、甜、苦、涩等味感，在一定程度上决定着燕麦醪糟的口味；多种、多量、多味的氨基酸赋予燕麦醪糟丰富的味觉层次，与发酵体系中的酯类、醇类、酸类等呈味物质相互作用，使燕麦醪糟更为鲜美、醇厚、浓郁[17]。
2.2.2 燕麦醪糟发酵过程中挥发性脂肪酸的变化分析
燕麦醪糟发酵过程中挥发性脂肪酸含量的变化见表2。
表2 燕麦醪糟发酵过程中挥发性脂肪酸的含量变化
Table 2 Content of volatile fatty acids in oat Laozao during the fermentation process ng/L
注：同列不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
发酵时间/h 0 24 48 72乙酸异丁酸丁酸正戊酸489.22±12.59c 1 214.63±29.14b 1 127.40±57.71b 1 797.60±67.36a 8.78±0.48c 26.56±3.74b 26.93±4.18b 35.75±4.80a 103.73±12.00a 25.63±5.06b 10.76±2.05c 8.38±1.98c 38.15±2.31b 45.02±3.29b 44.74±5.25b 50.27±5.44a
挥发性脂肪酸（volatile fatty acids，VFA）是由微生物以膳食纤维为底物代谢产生的短链脂肪酸（shortchain fatty acids，SCFA），由1～6 个碳原子组成，能够改善食品的风味，主要包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、正戊酸[18]。酸是燕麦醪糟重要的呈香呈味物质，在发酵体系中适量的酸具有缓冲、调和、谐味的作用，并与醇类物质相互作用共同形成发酵燕麦醪糟的独特芳香。由表2 可知，丁酸的含量随着燕麦醪糟发酵的进行，呈下降趋势；发酵72 h，丁酸的含量显著低于发酵初始阶段（0～24 h）（P＜0.05）。乙酸、异丁酸、正戊酸的含量随着燕麦醪糟发酵的进行整体呈现不同程度的升高；发酵72 h，乙酸、异丁酸的含量约为发酵0 h 的4 倍。燕麦醪糟发酵过程中，乙酸的含量高于其他短链脂肪酸[19]，这与马岩石等[20]的研究结果一致。乙酸含量的增加有助于降低发酵过程燕麦醪糟的pH 值，赋予燕麦醪糟醋香及绵柔的口感；乙酸还可与醇类发生酯化反应生成相应的乙酸酯类，为燕麦醪糟提供特有的花香[21]。
2.2.3 燕麦醪糟发酵过程中挥发性成分的变化分析
发酵能够加强谷物的营养、改善谷物食品的感官品质，发酵过程中微生物的作用能够促进发酵食品挥发性香气成分的形成，使产品的多种香气成分达到平衡[22-23]。燕麦醪糟发酵过程中，酵母菌、乳酸菌等利用蛋白质、碳水化合物等大分子物质形成挥发性风味物质，在乳酸菌的作用下，葡萄糖经糖酵解途径转化为丙酮酸，再由柠檬酸代谢等一系列生物化学反应形成醇类、醛酮类、酸类、酯类挥发性成分，这些挥发性化成分的产生对燕麦醪糟的滋味和风味起决定性作用[24]。燕麦醪糟发酵过程中挥发性成分变化见表3。
表3 发酵过程中各类挥发性成分的变化
Table 3 Content of volatile components of oat Laozao during the fermentation process
注：同列不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
发酵时间/h 0含量/（ng/L） 占比/%酯类24.74醇类51.23酸类21.38醛酮类1.20杂环类1.00烃类0.47 24 28.31 55.85 14.57 0.34 0.77 0.17 48 26.56 55.45 16.29 0.44 1.04 0.21 72酯类4 955.33±123.88d 8 941.64±228.20a 7 364.01±162.13b 6 644.73±236.37c醇类10 260.31±896.55d 17 637.30±1 159.33b 15 370.92±1859.76c 18 913.25±1 899.53a酸类4 284.66±55.68a 4 600.34±87.60a 4 515.76±78.43a 5 383.17±99.70a醛酮类239.05±28.34b 107.19±10.82d 123.34±10.11c 258.18±26.72a杂环类195.41±11.87d 244.48±13.15c 289.16±13.25b 358.12±11.31a烃类95.76±2.96a 53.90±2.18c 57.78±3.61c 70.57±3.05b 21.00 59.80 17.02 0.82 1.13 0.22
由表3 可知，燕麦醪糟发酵过程中，挥发性成分包括酯类、醇类、酸类、醛酮类、杂环类、烃类6 类，其中醇类挥发性成分含量最高，占比超过50%；酯类挥发性成分含量次之，酸类挥发性成分为第三大类成分。醇类、酯类、酸类作为发酵过程中燕麦醪糟的主要挥发性成分，含量远高于醛酮类、杂环类、烃类挥发性成分，对发酵过程中总挥发性物质的含量变化趋势有决定作用。其中，燕麦醪糟发酵过程中，酯类与醇类是整个发酵阶段的主要挥发性风味物质，与陈小琴[11]、苏佳佳等[25]的研究结论一致；酯类与醇类挥发性成分的变化趋势与陈青柳等[16]的研究结果相似。
酯类挥发性成分是含醇发酵饮品最重要的风味物质之一，在很大程度上决定了含醇发酵饮品的花香味和果香味[26]。由表3 可知，随着燕麦醪糟发酵的进行，酯类挥发性成分的含量先上升后下降，发酵24 h 时酯类挥发性成分含量显著高于其余阶段（P＜0.05）。燕麦醪糟接种发酵，微生物利用淀粉产生醇类和酸类等前体物质，在微生物代谢及其酶的作用下，发酵前期产生的醇类和酸类挥发性成分发生酯化反应生成酯类挥发性成分，但发酵24 h 后，随着发酵的进行由于酯化反应速率的降低，亦或是酯类挥发性成分分解，或参与其他风味物质的合成，导致酯类挥发性成分的含量有所下降，但酯类挥发性成分的阈值较小，在含量较低的情况下对样品香气也有较高的贡献[26]。
醇类挥发性成分的形成与糖代谢、氨基酸代谢等反应有关，醇类挥发性成分具有芳香、甜香等独特香气，且与酸类挥发性成分间存在协同效应，对风味有较大影响[27]。醇类挥发性成分既呈味又呈香，是燕麦醪糟味感和助香的主要成分之一[28]。由表3 可知，随燕麦醪糟发酵的进行，醇类挥发性成分的含量先上升后下降再上升；发酵72 h 醇类挥发性成分含量显著高于其余阶段（P＜0.05）。醇类挥发性成分是含酒精发酵饮料中的重要风味成分，酵母菌是醇类挥发性成分的重要微生物来源。适量的醇类挥发性成分是含醇发酵饮品醇香的主要来源，赋予含醇发酵饮品独特的香味，还能通过酯化反应与酸形成酯类物质，使含醇发酵饮品风味更为丰满[29]。
酸类挥发性成分是影响含醇发酵饮品风味及口感的重要指标之一，具有缓冲和协调其他风味物质的作用[29]。由表3 可知，酸类挥发性成分的含量随发酵时间的延长整体呈升高趋势；发酵72 h 时酸类挥发性成分的含量明显高于其他阶段。酸类挥发性成分含量较高对燕麦醪糟的香气有消极影响，而低浓度的酸类挥发性成分能够丰富燕麦醪糟香气，进而提高燕麦醪糟的风味；酸类挥发性成分是酵母菌蛋白质代谢及微生物脂肪酸代谢的产物之一，是形成酯类挥发性成分的前体物质；酸类挥发性成分还能够抑制酯类挥发性成分的水解[22]。
由表3 可知，随着燕麦醪糟发酵的进行，醛酮类挥发性成分、烃类挥发性成分的含量先下降后升高，杂环类挥发性成分的含量呈现升高的趋势，发酵72 h 时醛酮类和杂环类挥发性成分含量显著高于其余阶段（P＜0.05）。醛酮类挥发性成分又称为羰基化合物，醇类物质的氧化是其主要来源；醛酮类挥发性成分阈值较低，赋予燕麦醪糟清香和果香。
2.2.4 燕麦醪糟发酵过程中挥发性成分的主成分分析
利用SPSS 25.0 对燕麦醪糟发酵过程中的挥发性成分进行主成分分析，得到主成分相关矩阵的特征值、贡献率及累计贡献率，结果如表4 所示。
表4 2 个主成分的特征值及贡献率
Table 4 Eigenvalues and cumulative contribution rates of the first two principal components
主成分初始特征值12总计3.928 1.938贡献率/%65.461 32.300累计贡献率/%65.461 97.761
当前n 个主成分的累计贡献率达到85%时，说明这n 个主成分即可代表原指标中的信息。由表4 可知，主成分1、主成分2 贡献率分别为65.461%、32.300%，主成分1 与主成分2 的累计贡献率为97.761%，说明2 个主成分代表大多数样本信息。
不同发酵时间的燕麦醪糟及风味物质在第1 主成分和第2 主成分中的分布见图3。
图3 不同酿造时间的燕麦醪糟及风味物质在第1 主成分和第2主成分中的分布
Fig.3 PCA plots of oat Laozao samples and flavor components at different time points of the fermentation process
A.样品的得分；B.载荷图。
由图3A 可知，燕麦醪糟4 个发酵阶段显著区分成3 类：1）发酵0 h；2）发酵72 h；3）发酵24 h 与发酵48 h。燕麦醪糟发酵0、72 h 的样品与其他发酵时间的样品距离较远，说明发酵0 h 及72 h 的样品与其他样品显著不同，第1 主成分能较好地区分不同发酵阶段的样品。由图3B 可知，酯类、醇类、杂环类、酸类与第2 主成分呈正相关，烃类、醛酮类与第1 主成分呈正相关。
3 结论
接种发酵可通过对燕麦醪糟发酵过程的温度、发酵时间等进行控制，从而提高燕麦醪糟产品品质的均一性。对燕麦醪糟发酵过程进行跟踪取样，并对燕麦醪糟发酵过程中风味物质进行检测，发现总游离氨基酸、酯类、醇类、杂环类挥发性成分在前24 h 持续增长，说明这些风味物质主要在前酵期产生。在燕麦醪糟的不同发酵阶段，燕麦醪糟挥发性成分包括酯类、醇类、酸类、醛酮类、杂环类、烃类，含量较高的挥发性成分依次为醇类、酯类、酸类，这3 种挥发性成分的总含量高于95%。不同发酵时间燕麦醪糟挥发性成分主成分分析，提取出两个主成分且累计贡献率达到97.761%，酯类、醇类、杂环类、酸类与第2 主成分呈正相关，烃类、醛酮类与第1 主成分呈正相关，且第1 主成分能较好地区分不同发酵阶段的样品。
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