1 葡萄糖氧化酶概述
葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）本质是一种黄素糖蛋白，其家族分类属于葡萄糖/甲醇/胆碱氧化还原酶，分子量通常为130～180 kDa。GOD 是一种糖基化的同型二聚体酶，每个亚基（约为80 kDa）都包含1 mol 紧密结合但不共价连接的氧化型黄素二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD）部分，另外一部分能够有效结合底物葡萄糖。GOD 能够在有氧气存在的条件下发生专一性的催化反应，催化过程包括氧化和还原两个反应途径，共同将底物β-D-葡萄糖（C6H12O6）转化为过氧化氢（H2O2）和葡萄糖酸（C6H12O7）。还原反应过程中，β-D-葡萄糖被氧化为葡萄糖酸内酯，进一步水解为葡萄糖酸；与GOD 亚基结合的FAD 作为氧化还原载体被还原为FADH2[1]。氧化反应过程中，分子氧作为电子受体生成H2O2；被还原的FADH2 重新被氧化为FAD。葡萄糖氧化酶反应机制见图1[2]。
图1 葡萄糖氧化酶反应机制
Fig.1 Reaction mechanism of glucose oxidase
2 葡萄糖氧化酶来源及酶学性质
多种动植物和微生物都能够产生GOD，目前生产GOD 的主要来源是曲霉属和青霉属，常见种有尼崎青霉（Penicillium amagasakiense）和黑曲霉（Aspergillus niger）[3-4]。两种菌株产生的GOD 具有相似的碳水化合物组成，主要是甘露糖、己糖胺和葡萄糖；尼崎青霉GOD 中含有更多的甘露糖和己糖胺，葡萄糖含量较少。对氨基酸组成进行分析发现，黑曲霉GOD 中含有更多的组氨酸、精氨酸和酪氨酸，而赖氨酸和苯丙氨酸含量较少[2]。不同的菌种来源和多样的化学组成赋予了GOD 不同的酶学特性。
生产和生活中GOD 通常被制成淡黄色或黄色液体试剂、固体粉末，在纯度高时呈现晶体状态，其中固体GOD 酶制剂在-20 ℃至少可稳定保持2 年。GOD易溶于水，但完全不溶于乙醚和甘油等有机溶剂。不同来源的GOD 的酶学性质会存在部分差异，温度和pH 值的变化也会破坏酶分子结构从而影响酶活。GOD 的最适反应温度一般是在25～40 ℃左右，温度过高或者过低均会降低GOD 活性，尤其是在高温环境中能够导致失活。对于大多数GOD，最适pH 值为5.0～6.5，当pH 值小于2.0 或者大于8.0 时会迅速失活。研究表明，青霉来源的GOD 的催化活性一般普遍高于黑曲霉等其它菌株，但是温度稳定性却不如黑曲霉有优势，所以在超过65 ℃的环境下，青霉属的GOD 酶活会迅速下降，在开发研究过程中也是普遍关注的问题[5]。不同葡萄糖氧化酶的酶学性质见表1。
表1 不同葡萄糖氧化酶的酶学性质
Table 1 Enzymatic properties of different GOD
来源P.notatum P.funiculosum 433 P.variabile P16 A.niger Z-25 A.niger（mutant M4）最适温度/℃35～40 30 45 40 40最适pH 值6.2 6.0～8.6 6.0 6.0 6.0 Km/（mmol/L）83 3.3 15.25 16.95 32.82参考文献[3][6][7][4][8]
由表1 可知，来源于青霉属的GOD 比来源于曲霉属的GOD 最适温度和pH 值范围要广。另外，葡萄糖氧化酶对β-D-葡萄糖有较强的底物专一性，对于α-D-葡萄糖及甘露糖等其它单糖的催化作用不强。通常大多数金属离子对其酶活性无较大影响，但是Ag+、Cu2+和Hg2+的存在会对其产生明显抑制，当然也存在一些起到激活作用离子，如Zn2+和Mg2+等[6]。
3 葡萄糖氧化酶的应用
GOD 被广泛应用于食品、饲料和医药等领域。GOD 在不同领域的可利用性主要取决于它的活性、热稳定性、耐酸碱性等。因此，了解GOD 的应用场景需求，确定最佳的GOD 来源及其稳定性和活性等条件，对于扩大GOD 的工业应用范围具有重要的实际意义。
3.1 葡萄糖氧化酶在畜牧养殖中的应用
农业农村部194 号公告指出我国已于2020 年7月1 日全面禁止饲料企业生产抗生素类商品饲料，因此，选择绿色、安全且高效的替代抗生素对预防畜禽疾病具有重要的现实意义[9]。GOD 作为一种理想的天然抗生素替代品发展潜力较大，其作用机理如图2 所示。
图2 GOD 促进动物生长的机制
Fig.2 The mechanisms of animal growth promoted by GOD
将GOD 添加到猪、牛、羊、鸡等动物饲料中，通过产生H2O2 能够预防并缓解因金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌等引起的猪、牛、羊等家畜禽类腹泻等症状[10]，预防和降低霉菌毒素中毒的风险。同时，产生的葡萄糖酸可以降低pH 值从而改善体内肠道环境，提高对营养物质的消化吸收率。侯振平等[11]研究表明，饲料中添加GOD 可明显起到增重效果和产仔量。添加GOD 酶制剂还能够增强机体抗感染疾病的能力和健康水平，提高存活率。
肠道屏障主要包括机械屏障、免疫屏障和微生物屏障。其中免疫屏障是人体的第一道免疫防线，摄入GOD 可以通过调节炎性细胞因子的表达来增加免疫球蛋白（immune globulin，sIgA）的浓度并抑制炎症[12]。Qu 等[13]的研究发现，摄入GOD 增加了肉鸡血清中sIgA 和抗炎细胞因子（interleukin 10，IL-10）的水平，并抑制了霉菌毒素暴露后引起的炎症反应。Wu 等[12]对比了尼崎青霉和黑曲霉产生的GOD（GOD-P 和GODA）对肉鸡生长性能、肉质和肠道菌群的差异影响，发现两种GOD 都能通过诱导肠道菌群的变化改善肉鸡肉质，显著提高肉鸡的生长性能，GOD-P 显著提升与抗氧化和能量吸收相关菌的丰度；与抗生素相比，GOD处理能够增加有益菌的丰度，肠道屏障明显增强[2，12]。Wang 等[14]研究发现，GOD 能够减轻产肠毒素大肠杆菌所致仔猪生长性能和肠道健康等受到的影响，这同样与GOD 减轻肠道微生物群失调的能力有关。大多数有益菌（如乳酸杆菌和双歧杆菌等）的增加可能与GOD 催化的关键代谢产物葡萄糖酸引起的pH 值降低有关，另外，pH 值降低使得致病菌需要消耗大量三磷酸腺苷（adenosine 5′-triphosphate，ATP）泵出多余质子，导致能量消耗和细胞损伤[15]。葡萄糖酸在肠道中经过微生物发酵能够产生短链脂肪酸如丁酸，这对于维持肠道屏障的完整性非常重要。同时，短链脂肪酸还能作为免疫调节剂参与调节炎症反应。Biagi 等[16]发现葡萄糖酸能够调节盲肠菌群，增加短链脂肪酸（shortchain fatty acid，SCFA）产量，降低氨浓度，提高仔猪的生长性能。通过膳食补充250 U/kg GOD 可改善肉鸡肠道形态，增加回肠免疫功能和回肠消化物中SCFAs的浓度，改善肠道的酸碱平衡从而促进营养物质的吸收[17]。然而，需要更多的研究来确定饲料中添加GOD对畜禽肠道健康各项指标的影响机制。
研究证实，GOD 所具有的脱氧、杀菌、产酸等特点在替代抗生素领域应用潜力巨大，但目前研究仍处于起步阶段。今后可以根据饲料行业的要求对GOD 进行改造，制备热稳定性较高的酶，提高GOD 在胃液中稳定性和抗蛋白酶水解，适合通过胃肠道途径摄入[15]。另外，肠道中的氧气含量较低，而GOD 的催化反应需要氧气的参与，开发在低氧环境下可以保持活性的GOD 替代抗生素的研究也具有重要意义。
3.2 葡萄糖氧化酶在食品工业中的应用
3.2.1 防止食品褐变
食品在加工或贮藏过程中发生美拉德反应产生的类黑精褐色色素能够导致食品的风味和色泽发生改变，尤其是鸡蛋和马铃薯制品[18]。通过除去葡萄糖，避免了羧基与氨基化合物发生美拉德反应引起的非酶促褐变[19]。将GOD 与过氧化氢酶（catalase，CAT）联合使用能够抑制GOD 与葡萄糖反应过程中产生的过量H2O2。Mislovičová 等[20]研究发现，固定化GOD 能够将D-葡萄糖含量降低到其初始浓度的0～0.005%。例如，鸡蛋粉的制作过程一般需要在喷雾干燥之前脱去多余葡萄糖[21]。马铃薯制品也是一类较为典型的容易受到美拉德反应危害的食品，在蒸煮马铃薯条时添加GOD能够有效分解葡萄糖，减少非酶促褐变的发生。应用于蒸煮或者其他需要加热的食品时，需要提高GOD 的耐高温特性，尽量减少发生蛋白质变性影响酶活。在果蔬汁、脱水果蔬等产品的加工储藏过程中，GOD 的添加同样有助于防止食品褐变，从而使食品有较好的色泽和感官效果[22]。
3.2.2 食品保鲜防腐
传统食品工业中通常使用亚硫酸氢钠、苯甲酸钠等化学防腐剂来达到食品保鲜的效果，但是这些化学添加剂存在安全隐患，不恰当使用会对人体产生慢性毒性效应。相对来讲，GOD 作为生物防腐剂、保鲜剂更为安全无毒，食品保鲜是GOD 在食品工业中最重要的应用之一。GOD 达到保鲜目的主要是基于其抑菌机理，包括以下3 个方面：1）GOD 能够消耗氧气，抑制好氧菌的生长，另外还可以保护食物中的还原性物质不被氧化破坏；2）GOD 与葡萄糖反应过程中产生的H2O2 具有较强的氧化性，能够抑制食品中的微生物污染；3）反应过程中产生的葡萄糖酸能够降低食物中的pH 值，从而抑制微生物滋生。经研究证实，GOD 对常见的致病菌：大肠杆菌、沙门氏菌、腐败菌假单胞菌和醋酸菌等具有明显的抑制效果[23]。此外，GOD 常用于水产品低温保鲜技术中。Xu 等[24]通过使用来源于Bacillus sp.CAMT22370 的新型GOD（12.5 U/mL）在4 ℃下处理鲜虾，显著提高了冷藏虾的品质和新鲜度。除了鲜虾制品外，GOD 在鱼类保鲜中的应用也有部分报道。Yuan 等[25]将来自青霉菌的GOD 基因在毕赤酵母中进行异源表达后筛选出的耐低温GOD 对鱼类携带的食源性致病菌（单核细胞增生李斯特菌和副溶血性弧菌）具有良好的抗菌作用，适用于水产品低温保鲜。在未来的研究中，开发低温催化能力强的GOD 酶制剂对于低温保鲜行业具有重要应用价值。
3.2.3 在烘焙行业中的应用
GOD 作为面粉改良剂，是一种绿色替代品，可以避免增筋剂对人体的不良作用[26]，通过将其添加到面包中，可以起到增强面筋品质和面包口感的效果。主要原理是GOD 产生的H2O2 对面筋蛋白中的巯基具有氧化作用，形成白蛋白与球蛋白交联，导致非二硫键和二硫键的形成。无麸质产品是使用非小麦面粉制作的，具有较低血糖指数，适用于对麸质过敏以及高血糖人群。GOD 对无麸质面包的烘焙质量显示出不同的影响。大米粉经过GOD 处理后能够通过促进蛋白质交联增加面包比体积和质地特性[27]。Sarabhai 等[28]发现添加GOD 显著增加小米粉面包的比体积和面包屑弹性，而面包屑硬度和内聚力降低。Ge 等[19]从耐寒真菌Cladosporium.neopsychrotolerans SL16 中鉴定出一种耐低温的GOD，用于烘焙过程中增加面包体积，且该GOD 在0 ℃和碱性条件下同样具有很高的活性。
3.2.4 在酿酒行业中的应用
在酿酒工艺中加入GOD 酶制剂不仅能够去除多余的氧气和葡萄糖保持风味和颜色，还可以用来调节酒精含量。糖是酿酒酵母发酵产生酒精的主要底物，减少发酵过程中的葡萄糖用量可以降低酒精含量[29]。与过氧化氢酶结合使用，能够将葡萄糖快速转化为不可发酵的葡萄糖酸[30]。研究人员开发出了一种GOD酶制剂，可以在pH 值3.5～5.5 范围内工作，并将总体酒精降低到1.0%～1.3%，在这个过程中乙酸水平有所降低[31]。Valencia 等[32]证实了GOD/CAT 系统可以获得较低的酒精度。但以上两项研究发现GOD/CAT 处理后的葡萄酒颜色和风味发生了变化，这可能是由于酶处理期间通氧气的问题，GOD 反应过程需要依赖氧气，氧气不足或者通气时间过长都会对GOD 的氧化反应产生影响[33]。因此，开发耐酸、抗氧化能力强且催化效率较高的GOD 酶制剂更适用于酿酒工业。
3.3 葡萄糖氧化酶在医学领域中的应用
在医药行业中，GOD 通常会被制成试纸和试剂盒等，用来测定血清或尿液中血糖含量以预防和控制糖尿病[34]。由GOD 制成的生物传感器不仅可以用于指尖取血的血糖测量仪，还可以基于荧光信号用于体内葡萄糖的连续监测[35]。GOD 活性高度依赖氧气，耗氧量的不同可能会导致葡萄糖测定不准确。Arango 等[36]利用荧光定量（polymerase chain reaction，PCR）和序列饱和技术，通过随机突变，设计出了对氧依赖性较低的GOD 变异体。Chai 等[37]开发了一种葡萄糖响应性胰岛素输送系统，葡萄糖氧化酶固定化藻酸盐纳米颗粒与单独装备胰岛素的纳米颗粒相比，表现出更高的葡萄糖敏感性和更快的葡萄糖响应性胰岛素释放。
由于GOD 的催化过程以葡萄糖为底物且需要消耗葡萄糖，在癌症治疗方面具有潜在的应用价值。通过消耗葡萄糖和氧气，增加肿瘤微环境的缺氧和酸度水平，减少可用代谢能量来源从而抑制癌细胞增殖[38]。Shao 等[39]将氯喹和GOD 分别被装入腔中并修饰到聚多巴胺纳米核和中空介孔二氧化硅纳米壳表面，其中GOD 介导的肿瘤饥饿策略将直接抑制热激蛋白（heat shock protein，HSP）HSP70 和HSP90 的表达，从而增强PDA 纳米核诱导的低温光热疗法，而释放的氯喹通过抑制自噬弥补了光热疗法和饥饿激活自噬对低温光热疗法和饥饿效率的损失，实现了增强治疗效果。
目前在口腔疾病的预防中，GOD 也发挥着明显作用，一方面添加到牙膏或者漱口水中可以去除口腔中的葡萄糖从而防止链球菌的滋生，避免产生龋齿；另一方面也可以除去牙菌斑，增白牙齿[40]。
GOD 在低浓度下连续生成H2O2 的能力在伤口愈合方面同样引起了广泛关注。蜂蜜中所含有的GOD能够将花蜜中的部分葡萄糖转化为H2O2，赋予了蜂蜜一定的抗菌活性，可用于治疗急、慢性伤口和烧伤等。临床上模拟蜂蜜的抗菌机制，将GOD 固定在水凝胶等载体中实现逐步释放H2O2 的目的，用于伤口治疗[38]。纳米酶可同时表现出双酶或多酶模拟活性，是一种有前景的伤口抗菌技术。Zhang 等[41]将GOD 组装到掺杂有单原子Fe 和细菌纤维素包裹的聚丙烯复合材料的空心介孔碳纳米球上，开发了一种新型伤口敷料，该敷料具有较强的抗菌性，生物相容性和透气性等。
3.4 葡萄糖氧化酶在生物传感器领域中的应用
生物传感器在测定葡萄糖方面具有应用潜力。在生物技术领域，葡萄糖生物传感器可以检测环境或者发酵过程以确定合适的节点。GOD 的固定化是开发具有长期使用寿命的高度稳定的葡萄糖生物传感器的关键因素，将GOD 整合到生物传感器中方法包括吸收、共价附着、交联和微胶囊化等[42]。碳纳米管能够促进生物分子的电子转移，在构建葡萄糖传感器领域受到了广泛关注[43]。Wang 等[44]研究了使用多壁碳纳米管优化和表征GOD 共价固定化，最大限度地提高GOD 的负载，从而延长电力或传感信号的寿命。另外，作为生物燃料电池的阳极，可以利用葡萄糖实现能量的转化[45]，并利用氧化还原反应形成电流回路，从而提高电能的转化效率，有利于GOD 在电化学方面的应用。
4 葡萄糖氧化酶的异源表达与生产
GOD 起初作为规模化生产的菌种来源主要是天然菌株青霉和曲霉等，但是它们存在表达量较低、生产成本较高、淀粉酶和过氧化氢酶等杂蛋白多且纯化较为复杂等问题。伴随生物技术和工程前沿研究的不断发展，研究者成功实现了不同来源的GOD 在不同种宿主菌的异源表达。
4.1 葡萄糖氧化酶的异源表达系统
大肠杆菌表达系统往往被用来作为原核细胞表达蛋白质的首要选择[46]。这是因为大肠杆菌生长较快且对培养基的要求不高。大肠杆菌表达系统的机理研究较为成熟，外源DNA 可以通过简单快速的转化方法引入[46]。但是在先前的研究中，来源于尼崎青霉的GOD在大肠杆菌Escherichia coli 中的表达效果并不理想，重组蛋白中有50% 以上显示没有酶活性[6]，同时其表达的多为胞内蛋白，需要进行细胞破碎、离心等大量的前期处理操作，因此在应用方面有一定的局限性。为改善大肠杆菌中靶基因的表达，目前已经提出了几种方法，包括载体、培养条件和基因序列的变化以及分子伴侣的共表达等[47]，但这些方法尚未在GOD 的异源表达中应用。
20 世纪末，研究者尝试将GOD 在真核表达系统中表达并取得了明显成效，尤其是在酵母表达体系中。由于其转录后加工修饰功能，酵母表达体系适用于功能性外源蛋白的稳定表达。目前，不同来源的GOD 已经在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）中成功进行表达。Whittington等[48]从黑曲霉中克隆出GOD 基因，并分别进行3 种宿主的同源和异源表达，结果显示在重组酿酒酵母菌株的酶活最高，达到21.1 U/mL。然而，酿酒酵母表达的GOD 容易发生过度糖基化，可能会影响酶的催化活性[49]。相比较而言，毕赤酵母的内源分泌蛋白有限，有利于重组蛋白的纯化，且在连续和大规模发酵过程中保持重组基因的遗传稳定性，所以毕赤酵母表达体系是工业生产GOD 的近乎完美选择[18]。近年来，在毕赤酵母中异源表达GOD 的研究已较为成熟并且实现了高表达。Crognale 等[50]将来源于青霉菌P.variabile P16 的GOD 在P.pastoris X33 进行异源表达和高密度发酵后，酶活产量提升至原菌株的4 倍。Gao 等[3]通过突变和发酵罐的优化等将酶活提升至615 U/mL，远远高于之前的148 U/mL。顾磊[51]在野生黑曲霉菌株中克隆得到GOD，进一步在重组P.pastoris GS115 表达的发酵酶活为原菌株的25 倍。随着基因工程技术的进步，通过异源表达对GOD 的改造以及酶活提升具有广阔的前景。
目前研究人员还通过多种方法对GOD 异源表达体系进行了优化，比如增加基因拷贝数、优化密码子以及插入强启动子和信号肽等[47]。Yu 等[52]利用整合不同拷贝数GOD 基因的毕赤酵母菌株，研究了不同蛋白质反应调节因子同源物的过表达对宿主细胞分泌能力、生理和总酶产量的影响，最终使GOD 的产量达到2 125.3 U/mL。Gao 等[3]对GOD 基因密码子进行优化，调整胞嘧啶和鸟嘌呤的含量，最终使GOD 的产量占到总分泌蛋白的80%。Park 等[53]将4 种不同的启动子插入到酿酒酵母中表达GOD，结果发现由醇脱氢酶II（alcohol dehydrogenase II，ADH2）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GPD）启动子组成的酵母杂交ADH2-GPD 启动子是最佳启动子。信号肽是重组蛋白生产和分泌的重要因子[54]，Darvishi 等[55]通过计算机模拟和体内实验，发现来自黑曲霉GOD 的信号肽是提高解脂耶罗维亚酵母胞外GOD 表达和生产的最佳选择。
4.2 葡萄糖氧化酶的性能改进
GOD 具有良好的杀菌和抑菌活性，在食品、饲料、临床诊断、生物技术等领域应用广泛，尤其是在作为替代抗生素的新型饲料酶制剂和食品低温冷藏保鲜方面。但是，不同领域对GOD 的应用环境不同，因此需要根据GOD 不同的特性需求，采用先进的生物技术对GOD 的特性进行优化。
较低的热稳定性是阻碍GOD 工业应用的主要因素。GOD 作为饲料添加剂在制作过程需要经过造粒工艺，该工艺所需的高温处理对酶的活性会造成很大的影响[56]。因此，提高GOD 的热稳定性能够有效减少酶损失，使其最大限度发挥替代抗生素的功效。任春慧等[56]利用融合双亲短肽技术构建融合酶并在毕赤酵母GS115 中异源表达，得到的融合酶在60 ℃下孵育30 min 后相对酶活为67%，是相同处理条件下初始酶的10.9 倍。Tu 等[8]采用随机和理性相结合的方法，将来源于黑曲霉的GOD 在60 ℃和70 ℃条件下的半衰期分别提高了7.4 倍和4.6 倍。Mu 等[57]采用计算方法提升酶热稳定性的FRESCO 策略获得的突变体表现出较高的热稳定性，在50 ℃时保留60%的初始活性，在60 ℃时保留45% 的剩余活性。在工业生产中，可根据实际需要，设计合成在特定温度范围内保持较高活性的GOD。理想的用于食品保鲜，尤其是水产品保鲜的GOD 应具有耐低温的特性[24]。刘春莹等[58]通过紫外和亚硝酸盐复合诱变菌株8-III-a44 获得了在20 ℃以下仍具有较高活性的GOD。Ge 等[19]从耐寒真菌Cladosporium neopsychrotolerans SL16 中鉴定出一种耐低温的GOD，并通过突变Y169C 和A211C 两个残基后得到的CnGOXA，在0 ℃条件下活性仍能保持70%～75%。葡萄糖氧化酶的应用见图3。
图3 葡萄糖氧化酶的应用
Fig.3 Application of glucose oxidase
5 结论与展望
GOD 在反应过程中能够消耗葡萄糖，去除O2，产酸调节pH 值，产物中还有起杀菌作用的H2O2 等，因此在调味品、饮料和保鲜的食品行业以及饲料、医药等的非食品行业都有广泛的应用。GOD 主要从微生物中分离出来，存在蛋白表达量低和纯化复杂等问题。通过优化宿主细胞和发酵方法对于提高GOD 的产量和降低生产成本意义重大。尽管目前GOD 在许多领域都有广泛的应用，但仍存在一些问题需要进一步探究，例如，不同动物以及动物的不同发育阶段所需的最佳GOD 摄入量可能不同，应避免过量摄入引起的副作用；GOD 作为饲料添加剂所产生的H2O2 具有广谱杀菌性，尚不清楚对肠道有益菌和非致病菌是否会产生不良的干扰；GOD 作为保鲜剂的安全性有待进一步评价，其应用场景是否受限问题有待明确。
在未来的产业化应用中，应根据GOD 不同的特性需求，借助先进的生物技术手段，开发具有针对性的酶制剂。比如开发低温催化能力强的GOD 酶制剂对于低温保鲜行业具有重要应用价值；耐碱性和抗氧化能力强的GOD 是烘焙行业所需的优良特性；提高热稳定性能够避免GOD 在食品和饲料加工过程中失活；耐酸性、耐蛋白酶和对氧依赖性低的GOD 能够避免在消化道中被分解，保证其在肠道中稳定发挥作用。采用先进的生物技术对GOD 的特性进行优化对于扩大GOD的产业化应用范围具有实际指导意义。
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