农产品是食品加工原料的重要来源之一，农产品质量与安全直接关系到食品质量与安全。我国是一个农业大国，每年仅大宗作物的废弃物就达到6.5 亿t，伴随人们对农产品以及对畜禽养殖的肉蛋奶质量与数量要求的提高，导致农业及养殖业废弃物的积累量也不断上升，特别是随着美丽中国、健康中国建设的深入发展，对农业废弃物进行以生物有机肥为主要内容的资源化综合利用成为公众和专业人士关注的热点和共识。一直以来，农业的可持续发展仍旧依靠施用化肥来提高土壤肥力，我国每年工业氮肥产量达到约5 000万t，但其当季利用率仅为30.35%，每年氮量损失相当于1 900 t 左右的尿素[1]。氨气挥发是氮素损失的主要途径之一，占氮素损失总量的44%～99%[2-5]。
鸡粪发酵产生的臭味物质主要是氨气[6]。目前，国内外畜禽粪便除臭治理技术主要包括化学法、生物法、物理法或组合法。物理、化学法由于成本太高、除臭功能单一以及有造成二次污染的风险等弊端难以大规模应用，而生物法除臭效率高、无二次污染、所需设备简单，已发展成为治理恶臭的重要技术手段。
自然界中存在多种微生物具有除臭固氮功能，利用微生物菌剂处理是实现农业有机固废物资源化、无害化的一种手段[7]。于洪久等[8]、胡明勇等[9]、蒲一涛等[10]、张生伟等[11]研究表明，通过在堆肥中添加微生物制剂，不仅可以缩短堆肥周期，还可以减少18%～51%的氮素损失，有效减少恶臭气体产生，从而降低生产成本以及污染物的排放[12]。但微生物菌剂脱臭效果参差不齐，Al-Kanani 等[13]研究指出，粪便恶臭组成成分复杂，接种微生物菌剂后，很难达到预期的效果；Zhu 等[14]研究指出，使接入的微生物成为粪便中的优势菌群是微生物菌剂发挥作用的关键。因此，如何分离到除臭效果良好的菌株且接种后能适应新环境成为关键。
本研究从鲜鸡粪及周边土壤样品中取样，经过反复筛选，得到一株具有除臭固氮功能的菌株，对其进行增殖培养条件优化、提高其固氮能力、初步探索菌株除臭固氮机理等研究，以期为农业有机固废物的高效利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
筛菌环境样品：鲜鸡粪及周边土样，采集天津市某食用菌公司园区的鲜鸡粪约20 g，装入无菌取样袋中，标记待用；使用五点采样法，采集天津市某食用菌公司园区堆放鸡粪附近土样约20 g，用小铲子除掉表层土，取10～15 cm 深层土壤，装入无菌取样袋中，标记待用。
麦麸、豆粕：商丘马培中食品有限公司；食用菌菌糠、糠醛渣：天津市某食用菌公司。
1.1.2 试剂
可溶性淀粉、琼脂、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、次氯酸钠、亚硝基铁氰化钠、七水合硫酸亚铁、七水合硫酸镁：北京索莱宝科技有限公司；牛肉膏、苯酚、硝酸钾、酵母浸粉、蛋白胨：天津化学试剂一厂；氯化钠、胰蛋白胨、葡萄糖、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸铵、氯化钾、碳酸钙、氢氧化钠、碳酸氢钠、氯化钙、硫酸锌：天津市北方天医化学试剂公司；甘油：天津康科德科技有限公司；三氯乙酸：天津三江赛瑞达商贸有限公司；硫酸、盐酸：天津市江天试剂有限公司；细菌DNA 提取试剂盒：赛默飞世尔科技公司。以上化学试剂均为分析纯。
1.1.3 培养基
LB 培养基：蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，氯化钠10 g/L，自来水1 000 mL。
富集培养基：硫酸铵2 g/L，氯化钠0.3 g/L，七水合硫酸亚铁0.03 g/L，磷酸氢二钾1 g/L，七水合硫酸镁0.03 g/L，氯化钙7.5 g/L，蒸馏水1 000 mL。
阿须贝氏无氮培养基：磷酸二氢钾0.2 g/L，氯化钠0.2 g/L，七水合硫酸镁0.2 g/L，碳酸钙5 g/L，硫酸钙0.1 g/L，甘露醇10 g/L，琼脂20 g/L，蒸馏水1 000 mL。
氨气选择培养基：蔗糖50 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，七水合硫酸镁0.5 g/L，七水合硫酸亚铁0.1 g/L，氯化钠2.0 g/L，氨水10 mL/L，1% 硫酸锌5 mL/L，蒸馏水1 000 mL。
发酵培养基：糠醛渣10 g/L，磷酸氢二钾1 g/L，七水合硫酸镁5 g/L，七水合硫酸亚铁0.05 g/L，硫酸镁0.02 g/L，酵母浸出液0.2 g/L，鲜鸡粪（干重）20 g/L，自来水1 000 mL。
物料浸提液：堆肥混合物5 g，置于50 mL 蒸馏水中，充分搅拌后，以4 000 r/min 离心6 min，取上清液。
堆肥混合物：糠醛渣5.3 g，豆渣14.7 g，碳酸氢钠0.3 g，pH7.5。
硝化培养基：葡萄糖5 g/L，硝酸钾0.722 g/L，氯化钠1 g/L，七水合硫酸亚铁0.5 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，七水合硫酸镁0.25 g/L，蒸馏水1 000 mL。
无机盐培养基：磷酸二氢钾1.0 g/L，氯化钠0.5 g/L，硫酸镁0.5 g/L，氯化钙0.1 g/L，硫酸亚铁0.01 g/L，氯化钴0.01 g/L，蒸馏水1 000 mL。
增殖基础培养基：牛肉膏5 g/L，葡萄糖6 g/L，氯化钠5 g/L，氯化钙3.3 g/L，自来水1 000 mL。
以上培养基灭菌条件为121 ℃，20 min，除特别标注外，pH 自然。固体培养基加2%～3%琼脂。
1.2 仪器与设备
超净工作台（SW-CJ-1FD）：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；立式蒸汽压力锅（LS-B500L）：上海华线医用核子仪器有限公司；恒温培养箱（KCL2000）：广东省医疗器械厂；酸度计（Seven Easy 基础型）：梅特勒托利多仪器（上海）有限公司；台式高速冷冻离心机（AllegraX-30）：美国BECKMAN 公司；紫外可见分光光度计（Agilent8453）：安捷伦科技有限公司；基因扩增仪（RePure-D）：杭州柏恒科技有限公司；回旋式恒温调速摇床（HYG-Ⅲ）：上海欣蕊自动化设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 除臭固氮菌株的分离
称取10 g 鲜鸡粪及周边土样，放入装有100 mL无菌水的锥形瓶中，在150 r/min、30 ℃的条件下，振荡培养1 h。取样品悬液，以1%的接种量接种到富集培养基中，相同条件下，摇床培养，明显浑浊后，再按上述方法接种于新鲜培养液中，重复上述操作，相同条件下连续培养4～5 代，完成驯化。
取适量最后一次培养菌液，以10 倍的梯度用生理盐水逐级稀释，从10-4～10-6 稀释倍数的菌液中吸取50 μL，涂布在阿须贝氏无氮固体培养基上，每个稀释度涂3 个平板。将涂布后的平板放在30 ℃的恒温培养箱中，倒置培养1～2 d，用接种环从平板上挑取D/d（D 为菌株产生的透明圈直径，d 为菌株菌落直径）相对较大的单菌落接种到相同的平板上，采用平板划线法，在同样的条件下纯化培养4～5 次，镜检检查纯度。对菌落形态不同的菌株进行命名编号以及将纯化好的菌株甘油冷冻保藏。
1.3.2 菌株初筛
取50 mL 氨气选择培养基，装入三角瓶中，灭菌后，注入50 μL 过膜氨水，菌株活化培养后，按3% 接种量接种至三角瓶，振荡培养3 d，观察菌液变化。若菌液浑浊，则表明该菌株具有利用NH3 的能力，反之则不能。
1.3.3 菌株复筛
活化初筛菌株，按2% 的接种量接种到装有物料浸提液的发酵培养基中，三角瓶中装有含10 mL NH3吸收液的无菌离心管。150 r/min，30 ℃振荡培养72 h，对照组加入等量的无菌水，测定NH3 释放量；将种子液按2%的接种量接种于灭菌后的阿须贝氏无氮培养基中，150 r/min，30 ℃振荡培养72 h，测定发酵液中的总氮含量。每个处理设3 个重复。
1.3.4 菌落形态观察、生理生化及分子鉴定
菌落形态观察：将筛选得到的菌株接种到牛肉膏蛋白胨固体平板上，30 ℃培养24 h，观察其菌落形态。
个体形态观察：革兰氏染色后在光学显微镜下观察菌株个体形态。
生理生化鉴定：试验方法参考《常见细菌系统鉴定手册》。
分子鉴定：参照细菌DNA 提取试剂盒的使用说明书进行细菌DNA 的提取。将提取的DNA 作为模板，采用细菌通用引物扩增细菌的16S rDNA 序列。上游引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和下游引物1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性45 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸60 s，进行30 个循环，72 ℃延伸5 min。反应结束后用1% 琼脂糖凝胶对PCR 产物进行电泳检测。经跑胶鉴定，条带大小在1 500 bp 左右的PCR 产物可以判断为细菌的保守性片段，将PCR 扩增后的产物送至生物公司测序。
1.3.5 指标测定
采用靛酚蓝分光光度法[15]测定氨气含量；采用2 mol/L KCl 浸提靛酚蓝比色法[16]测定铵态氮含量；采用磺酸水杨酸法[17]测定硝态氮含量；采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法[18]测定总氮含量；采用格里斯试剂染色法测定亚硝酸盐还原酶活性；采用苯酸钠-次氯酸钠比色法测定脲酶活性[19]；采用对氨基苯磺酸-α-萘胺比色法[20]测定硝酸还原酶活性。
1.3.6 增殖培养基优化及效果验证
通过单因素试验确定合适的碳源（蔗糖、果糖、乳糖、可溶性淀粉、葡萄糖、甘油）、氮源（蛋白胨、硝酸钾、硫酸铵、尿素、氯化铵、牛肉膏）、金属盐（硫酸镁、硫酸铜、硫酸亚铁、氯化钙），再通过正交试验确定碳源、氮源、金属盐添加量。
根据单因素试验结果，选择可溶性淀粉浓度（A）、牛肉膏浓度（B）、硫酸镁浓度（C）作为研究对象，设计三因素三水平正交试验，因素水平设计见表1。
表1 三因素三水平正交试验
Table 1 Three-factor and three-level orthogonal test
水平因素A 可溶性淀粉浓度/（g/L）1 2 3 8 6 10 B 牛肉膏浓度/（g/L）20 18 22 C 硫酸镁浓度/（g/L）4.0 3.2 4.8
通过比较JFN-1 菌株在增殖基础培养基和优化培养基中的生长曲线，得出菌株在各培养基中对数生长期的时间节点、菌体密度及总氮增量，评价优化后的培养基效果。
1.3.7 菌株除臭固氮机理
将菌悬液以2% 的接种量接种至硝化培养基中，在30 ℃，150 r/min 条件下，振荡培养72 h，每隔24 h取样，按照1.3.5 的方法测定铵态氮含量、硝态氮含量、总氮含量及硝酸还原酶活性、亚硝酸还原酶活性以及脲酶活性。
1.3.8 多元辅料固态发酵基质的筛选
选取麦麸、菌糠渣、糠醛渣、豆粕、硫酸铵5 种多元辅料，粉碎后以碳氮比为25∶1 设计基质配比，配制出9 种不同混料组合发酵基质，结果见表2。将辅料装于250 mL 组培瓶中，添加无机盐培养基，调节含水量至40%～50%，121 ℃灭菌20 min。将JFN-1 活化并培养至对数期，以6%接种量接种至发酵基质上，37 ℃静态培养，1 d 翻拌一次，防止结块。发酵7 d 后，测定总氮含量及硝酸还原酶活性、亚硝酸还原酶活性、脲酶活性。
表2 固态发酵基质配制方案
Table 2 Solid-state fermentation substrate preparation scheme
组合号菌糠∶麸皮∶豆粕∶硫酸铵∶糠醛渣（质量比）1 2 3 4 5 6 7 8 9 5∶15∶3∶0.100∶2 5∶10∶1∶0.054∶2 10∶20∶1∶0.132∶2 10∶15∶2∶0.087∶2 15∶10∶2∶0.116∶2 15∶15∶1∶0.165∶2 15∶20∶3∶0.120∶2 5∶20∶2∶0.145∶2 10∶10∶3∶0.125∶2
1.4 数据处理与分析
菌株测序结果在NCBI 中通过blast 进行同源序列比对，再通过Mega 7.0 软件构建系统发育树；试验结果采用IBM SPSS Statistics 25 软件进行显著性分析，以P＜0.05 为显著性检验标准；采用Origin 2022 进行绘图。
2 结果与分析
2.1 除臭固氮菌株的分离筛选
通过富集驯化、平板纯化分离得到10 株细菌，利用氨气鉴别培养基定性初筛得到8 株菌，对初筛得到的8 株菌进行定量复筛，测定各菌株在含鲜鸡粪的物料浸提液中的氨气释放量，结果见表3。
表3 除臭固氮菌复筛结果
Table 3 Re-screening results of deodorizing and nitrogen-fixing bacteria
注：CK 组表示加等体积无菌水；氨气释放量指稀硫酸吸收液中氨气含量。
菌株号CK a-b1 a-b2 a-b3 JFN-1氨气释放量/μg 3.47 1.75 2.98 2.08 0.87菌株号NH-1 NH-2 NH-3 NH-4氨气释放量/μg 2.29 2.66 1.80 6.33
由表3 可知，除NH-4 菌株氨气释放量高于CK组，其余菌株均能在一定程度内抑制氨气的释放，因此排除NH-4。其中JFN-1 菌株氨气释放量明显下降，相比CK 组，减少了74.93%，说明JFN-1 菌株能有效减少氨气释放；其次是菌株a-b1，氨气释放量减少了49.57%。推测NH-4 菌株氨气释放量增加的原因可能是NH-4 菌株产生氨气或其他含氮类气体，从而使吸收液中氨气含量增加。因此，选择JFN-1 菌株作为除臭固氮试验菌株。
2.2 菌落形态、生理生化及分子生物学鉴定
JFN-1 菌落形态如图1 所示，生理生化鉴定结果见表4，16S rDNA 进化树见图2。
图1 菌株JFN-1 菌落形态和个体形态（90×10）
Fig.1 Colonial and individual morphology of JFN-1 strain（90×10）
左图为平板菌落形态，右图为革兰氏染色细胞形态。
图2 菌株JFN-1 的16S rDNA 序列系统发育树
Fig.2 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequence of JFN-1 strain
表4 菌株JFN-1 生理生化鉴定结果
Table 4 Physiological and biochemical identification results of JFN-1 strain
注：-表示阴性，+表示阳性。
生理生化指标革兰氏染色好氧性芽孢试验细胞过氧化氢酶氧化酶葡萄糖甘露糖麦芽糖淀粉水解结果---++----
如图1 所示，菌落形态表现为偏黄色透明，中心白色，表面光滑，圆球形。JFN-1 为革兰氏阴性杆菌。
由图2 可知，JFN-1 属于Empedobacter falsenii，与Empedobacter falsenii strain HKG395 最为接近，相似性在99.58%。
综上所述，通过形态学特征、生理生化试验和16S rDNA 序列分析鉴定，JFN-1 为假肠杆菌（Empedobacter falseni）。
2.3 菌株增殖培养基优化
2.3.1 碳源种类及浓度优化
为优化JFN-1 菌株对不同碳源的利用能力，本试验选用6 种不同碳源，确定最适碳源后，选取4～14 g/L 碳源初始浓度，观察其对JFN-1 的增殖影响，结果见图3。
图3 不同碳源及浓度对JFN-1 菌体增殖的影响
Fig.3 Effects of different carbon sources and concentration on proliferation of JFN-1 bacteria
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图3 可知，6 种碳源中可溶性淀粉最适合JFN-1的生长。菌体浓度随可溶性淀粉浓度的增大而增大，但可溶性淀粉浓度超过菌株的最适生长浓度后，会抑制JFN-1 菌体增殖。当可溶性淀粉浓度为6 g/L，OD600为2.013；浓度为8 g/L，OD600为2.328；而浓度为10 g/L，OD600 明显下降，为1.938。因此，选择可溶性淀粉的最佳浓度为8 g/L。
2.3.2 氮源种类及浓度优化
为优化JFN-1 菌株对不同氮源的利用能力，选用6 种不同氮源，并在确定最适氮源后，选取12～24 g/L 氮源初始浓度，观察其对JFN-1 增殖的影响，结果见图4。
图4 不同氮源及其浓度对JFN-1 菌体增殖的影响
Fig.4 Effects of different nitrogen sources and concentration on proliferation of JFN-1 bacteria
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图4 可知，JFN-1 对蛋白胨和牛肉膏的利用效果较好，OD600 分别为1.088、1.628。当牛肉膏浓度为20 g/L 时，可获得最高的菌体量，相比浓度12 g/L，OD600 提高了46.05%，所以选择20 g/L 的牛肉膏作为最佳氮源。
2.3.3 金属盐种类及浓度优化
为优化JFN-1 菌株对不同金属盐的利用能力，选用4 种不同金属盐，并在确定最适金属盐后，选取0.8～6.4 g/L 金属盐浓度，观察其对JFN-1 增殖的影响，结果见图5。
图5 不同金属盐及其浓度对JFN-1 菌体增殖的影响
Fig.5 Effects of different metal salts and concentration on proliferation of JFN-1 bacteria
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图5 可知，JFN-1 对硫酸镁和氯化钙的利用效果较好，当硫酸镁浓度为4.0 g/L 时，可获得最高的菌体量，OD600 为1.234，浓度为3.2 g/L，OD600 为0.912，浓度为4.8 g/L 时，OD600 为1.156。所以选择4 g/L 的硫酸镁作为最佳金属盐。
2.3.4 碳、氮源与金属盐的正交试验
正交试验设计和结果见表5。
表5 JFN-1 菌株增殖培养基优化正交试验结果
Table 5 Orthogonal test results of proliferation medium optimization of JFN-1 strain
试验号1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1 A3 2 1 3 3 2 2 1 1 B3 1 3 1 2 3 2 2 1 C1 3 3 2 3 2 1 2 1 OD600 3.36 3.45 3.83 3.66 2.58 2.13 3.37 3.36 4.10 K2 K3 R 11.29 8.95 9.61 2.34 11.20 9.31 9.33 1.90 10.82 9.15 9.86 1.67
由表5 可知，可溶性淀粉浓度的改变对JFN-1 菌体增殖的影响最大，牛肉膏浓度次之，硫酸镁浓度对JFN-1 菌体增殖的影响最小，得到最佳组合为A1B1C1，即可溶性淀粉浓度8 g/L、牛肉膏浓度20 g/L、硫酸镁浓度4 g/L。正交组合中OD600 最高组即为A1B1C1，OD600为4.10。故选择最佳组合为可溶性淀粉浓度8 g/L、牛肉膏浓度20 g/L、硫酸镁浓度4 g/L。
2.4 菌株生长曲线的绘制
JFN-1 的生长曲线见图6。
图6 JFN-1 菌株优化前、后生长曲线对比
Fig.6 Comparison of growth curves of JFN-1 strain before and after optimization
由图6 可知，JFN-1 在优化培养基中，0～8 h 为生长延滞期，8～20 h 为生长对数期，20 h 以后为稳定期，20 h 时发酵液的OD600 为3.14。相比较基础培养基，优化后OD600 提高了12.91 倍。
2.5 菌株除臭固氮机理
2.5.1 氮素循环各指标变化
为探讨JFN-1 菌株的除臭固氮机理，本试验研究了JFN-1 液态发酵72 h 过程中氮素相关指标及相关酶学特性，结果见图7。
图7 JFN-1 菌株液态发酵72 h 各指标变化
Fig.7 Changes of indicators of JFN-1 strain after 72 h liquid fermentation
如图7 所示，随着发酵时间的延长，发酵培养基中铵态氮含量呈下降趋势。发酵初期铵态氮含量为13.335 mg/kg，发酵结束时铵态氮含量为10.819 mg/kg，下降了18.87%；硝态氮含量呈现上下波动，整体上升的趋势。初期时硝态氮含量为55.248 mg/kg，结束时硝态氮含量为58.280 mg/kg，硝态氮含量增加了5.49%；总氮含量呈现先增后减再增的波动趋势，由发酵初期的683.48 mg/kg 增加到753.649 mg/kg，增加了10.26%。在整个发酵过程中，脲酶活性整体呈现先上升后下降的趋势，发酵结束时脲酶活性为103.604 U，相比较发酵初期的122.004 U，酶活性下降了15.08%；硝酸还原酶活性的变化趋势与脲酶活性基本一致，表现为：先上升后下降。在发酵24 h 时酶活性最高，达到85.810 U，相比发酵初期，酶活性增加了133.898%，随后缓慢下降，发酵结束时酶活性基本与发酵初期一致；亚硝酸还原酶活性整体表现为下降趋势，由发酵初期的55.931 U 下降到36.873 U，酶活性下降了34.07%。
2.5.2 相关性分析
氮素损失主要是由有机氮矿化、氨挥发以及硝态氮的反硝化作用导致的，各指标相关性分析见表6。
表6 液态发酵72 h 各指标的相关性分析
Table 6 Correlation analysis of indicators in 72 h liquid fermentation
注：**表示在0.01 级别（双尾）相关性显著（＜0.3，弱相关；0.4～0.5，中等相关；＞0.6，强相关）。
项目硝态氮含量总氮含量硝酸还原酶活性亚硝酸还原酶活性脲酶活性铵态氮含量-0.794**-0.384 0.1 0.977**0.475硝态氮含量1 0.312 0.05-0.851**-0.492总氮含量硝酸还原酶活性亚硝酸还原酶活性1 0.431-0.463 0.097 1 0.072 0.359 1 0.477
由表6 可知，硝态氮和铵态氮可以相互转化，两者的变化量在发酵过程中表现为显著负相关（P＜0.01）；减少铵态氮向氨气的转化，促进铵态氮向硝态氮的转化，都有利于氮素的固定；总氮含量与铵态氮含量呈弱负相关，与硝态氮含量呈弱正相关，验证了可以通过减少铵态氮含量，增加硝态氮含量来达到固氮的目的。硝态氮在亚硝酸还原酶和硝酸还原酶作用下可以与亚硝态氮相互转化，硝酸还原酶活性的提高，有利于氮素含量的增加[21-22]。通过表6 得出，硝酸还原酶活性与铵态氮含量、硝态氮含量都呈弱正相关，与总氮含量呈中等程度正相关；硝态氮在亚硝酸还原酶作用下转化为氮气，亚硝态氮在亚硝酸还原酶的作用下转化为铵态氮，从而造成氮素流失[23]。而亚硝酸还原酶活性与铵态氮含量呈显著正相关（P＜0.01），与硝态氮含量呈显著负相关（P＜0.01），与总氮含量呈中等负相关，验证了上述氮素流失途径；尿素可在脲酶作用下转化为氨气，造成氮素的流失[24]，由表6 可知，脲酶活性与硝态氮含量呈中等负相关，与铵态氮呈中等正相关。
综上所述，可以通过提高硝态氮、减少铵态氮含量或减少氮类物质分解为铵态氮后以氨气等气态挥发损失，来控制臭味的产生，从而保留更多的氮养分；可以通过提高硝酸还原酶活性、抑制脲酶活性、适当控制亚硝酸还原酶活性的手段来间接提高氮素含量。
2.6 菌剂多元辅料固态发酵基质的筛选
为优化JFN-1 菌株对不同农业有机固废物的利用，试验设计9 组固态发酵基质，接种JFN-1 种子液，发酵7 d 后，观察其对JFN-1 固氮能力及其酶活的影响，结果如表7、图8 所示。
图8 最优配比对发酵过程中各酶活性的影响
Fig.8 Effect of optimal ratio on enzyme activities during fermentation
表7 不同发酵基质对堆体总氮的影响
Table 7 Effects of different fermentation substrates on total nitrogen in bacteria
组别J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8 J9发酵初期/（μg/kg）366.93 261.75 165.00 427.59 248.36 117.87 183.68 122.22 187.03发酵结束/（μg/kg）209.66 297.17 166.21 113.18 235.10 349.39 372.96 209.26 280.30总氮增量/%-42.86 13.53 7.33-73.53-5.34 196.42 103.04 71.21 49.87
由表7 知，J6 组对JFN-1 菌的固氮能力影响最明显，总氮量提高了196.42%，J7 组其次，提高了103.04%。其余试验组固氮能力提高效果不明显，J1、J4、J5 组发酵结束氮含量低于发酵初期，推测在发酵过程中损失了部分氮素。所以最后选择的固态发酵基质为菌糠15 g、麸皮15 g、豆粕1 g、糠醛渣2 g、硫酸铵0.165 g。
由图8 可知，硝酸还原酶活性较低，在发酵过程中，呈现上下波动趋势，但保持在一定范围内；脲酶活性先逐渐上升到一定值，然后迅速下降，而亚硝酸还原酶活性在整个发酵过程中呈现逐步上升的趋势，验证了JFN-1 的除臭固氮机理可能是在酶的作用下，通过硝态氮和铵态氮氮素形态的转化，提高硝态氮，减少铵态氮含量，从而达到固氮的目的。
3 结论
本文从鲜鸡粪及周边土壤中分离得到一株具有除臭固氮功能的菌株JFN-1，通过形态观察、生理生化试验、16S rDNA 序列分析鉴定，确定其为假肠杆菌（Empedobacter falsenii）。通过液体发酵方法，研究了该菌株增殖过程中氮素相关指标和酶活性变化，初步探究假肠杆菌的固氮机制为：在硝酸还原酶和亚硝酸还原酶作用下，提高硝态氮，减少铵态氮含量以及减少氮类物质分解来达到除臭固氮的目的。通过单因素和正交优化试验获得JFN-1 增殖培养最优培养基：可溶性淀粉8 g/L、牛肉膏20 g/L、硫酸镁4 g/L、氯化钠5 g/L。在接种量2%，转速150 r/min，30 ℃条件下培养20 h，相比基础培养基，发酵液OD600 提高12.91 倍，总氮量提高2.14 倍。通过固态发酵优化获得JFN-1 最佳固态发酵基质：菌糠15 g、麸皮15 g、豆粕1 g、糠醛渣2 g、硫酸铵0.165 g，总氮量提高196.42%。
[1] 康健.畜禽粪便堆肥过程中物质转化和微生物种群演变规律及酶活性机理研究[D].兰州:兰州理工大学,2019.KANG Jian.Substances transformation and microbial populations evolution during the composting of cattle manure, and mechanistic insights into enzymatic activity[D].Lanzhou: Lanzhou University of Technology,2019.
[2] WALTERS W W,CHAI J J,HASTINGS M G.Theoretical phase resolved ammonia-ammonium nitrogen equilibrium isotope exchange fractionations: Applications for tracking atmospheric ammonia gasto-particle conversion[J].ACS Earth and Space Chemistry, 2019, 3(1):79-89.
[3] ZHAO Y, LI W G, CHEN L, et al.Isolation and application of a thermotolerant nitrifying bacterium Gordonia paraffinivorans N52 in sewage sludge composting for reducing nitrogen loss[J].Bioresource Technology,2022,363:127959.
[4] WANG H H, SHAO T Y, ZHOU Y J, et al.The effect of biochar prepared at different pyrolysis temperatures on microbially driven conversion and retention of nitrogen during composting[J].Heliyon,2023,9(3):e13698.
[5] 袁玉玲,王立刚,李虎,等.猪粪固体自然堆放方式下含氮气体排放规律及其影响因素研究[J].农业环境科学学报, 2014, 33(7):1422-1428.YUAN Yuling, WANG Ligang, LI Hu, et al.Nitrogenous gas emissions from solid swine manure under natural composting conditions[J].Journal of Agro-Environment Science,2014,33(7):1422-1428.
[6] LIU L, ZHANG X Y, XU W, et al.Ammonia volatilization as the major nitrogen loss pathway in dryland agro-ecosystems[J].Environmental Pollution,2020,265(Pt A):114862.
[7] 胡佳频.吉首钾长石矿区土壤中固氮细菌的选育[D].吉首:吉首大学,2016.HU Jiapin.Breeding nitrogen-fixing bacteria from the potassium mine of Jishou[D].Jishou:Jishou University,2016.
[8] 于洪久,边道林,李玉梅,等.堆肥发酵过程中防除臭气技术的研究[J].现代化农业,2009(11):12-14.YU Hongjiu, BIAN Daolin, LI Yumei, et al.Study on odor prevention and removal technology in composting fermentation process[J].Modernizing Agriculture,2009(11):12-14.
[9] 胡明勇,刘强,陈雄鹰,等.两种钙化合物在猪粪-稻草堆肥中除臭及保氮效果研究[J].湖南农业科学,2009(7):51-54.HU Mingyong, LIU Qiang, CHEN Xiongying, et al.Study on deodorization and nitrogen conservation effects of two calcium compounds in pig manure-straw compost[J].Hunan Agricultural Sciences,2009(7):51-54.
[10] 蒲一涛,钟毅沪,周万龙.固氮菌和纤维素分解菌的混合培养及其对生活垃圾降解的影响[J].环境科学与技术, 1999, 22(1):15-18.PU Yitao, ZHONG Yihu, ZHOU Wanlong.The mixed culturing of nitrogen-fixation bacteria and cellulose decomposing organism and the effects on the decomposing of the household garbage[J].Environmental Science and Technology,1999,22(1):15-18.
[11] 张生伟,姚拓,黄旺洲,等.猪粪高效除臭微生物菌株筛选及发酵条件优化[J].草业学报,2015,24(11):38-47.ZHANG Shengwei, YAO Tuo, HUANG Wangzhou, et al.Optimization of fermentation conditions of swine manure and screening for efficient microbial deodorant strains[J].Acta Prataculturae Sinica,2015,24(11):38-47.
[12] 张智,乔艳,陈云峰,等.不同菌剂对鸡粪堆肥过程中有害气体排放的影响[J].中国农业科技导报,2021,23(12):145-150.ZHANG Zhi,QIAO Yan,CHEN Yunfeng,et al.Effects of three microbial agents on harmful gas emission during chicken manure composting[J].Journal of Agricultural Science and Technology, 2021,23(12):145-150.
[13] AL-KANANI T,AKOCHI E,MACKENZIE A F,et al.Odor control in liquid hog manure by added amendments and aeration[J].Journal of Environmental Quality,1992,21(4):704-708.
[14] ZHU J, JACOBSON L, SCHMIDT D, et al.Daily variations in odor and gas emissions from animal facilities[J].Applied Engineering in Agriculture,2000,16(2):153-158.
[15] 邹奎.靛酚蓝分光光度法测定室内空气氨含量的影响因素分析[J].福建建设科技,2021(2):41-42,50.ZOU Kui.Analysis of influencing factors for determination of ammonia content in indoor air by indigophenol blue spectrophotometry[J].Fujian Construction Science and Technology, 2021(2): 41-42,50.
[16] 端爱玲,韩张雄,黄艳,等.靛酚蓝比色法测定土壤中铵态氮注意事项[J].当代化工,2021,50(12):2861-2864.DUAN Ailing,HAN Zhangxiong,HUANG Yan,et al.Problems and solutions for determination of ammonium nitrogen in soil by the method of indophenol blue colorimetry[J].Contemporary Chemical Industry,2021,50(12):2861-2864.
[17] 相里炳铨.磺酸水杨酸法测定土壤硝态氮[J].北京农业科学,1993(3):28-30.XIANGLI Bingquan.Determination of soil nitrate nitrogen by sulfonic acid salicylic acid method[J].Beijing Agricultural Sciences,1993(3):28-30.
[18] 赵勇.水质分析总氮测定中空白值偏高的影响因素[J].大众标准化,2022(6):184-186.ZHAO Yong.Influencing factors of high blank value in determination of total nitrogen in water quality analysis[J].Popular Standardization,2022(6):184-186.
[19] 关松荫.土壤酶及其研究法[M].北京:农业出版社,1986.GUAN Songyin.Soil enzyme and its research method[M].Beijing:Agriculture Press,1986.
[20] 徐龙光.黄帝手植柏的组织培养和硝酸还原酶活性测定[D].杨凌:西北农林科技大学,2014.XU Longguang.Tissue cultue of old platucladus Orientalis and determination of nitrate reductsae activity[D].Yangling: Northwest A&F University,2014.
[21] 宋琴, 许雷.异养硝化作用酶学研究进展[J].生物技术通报,2008(5):60-62,66.SONG Qin, XU Lei.Advancement of enzymology of heterotrophic nitrification[J].Biotechnology Bulletin,2008(5):60-62,66.
[22] HUANG X J, LUO Y W, LUO L, et al.The nitrite reductase encoded by nirBDs in Pseudomonas putida Y-9 influences ammonium transformation[J].Frontiers in Microbiology,2022,13:982674.
[23] ALI MOHAMMED K,UMER M I,ALYAZICHI Y M.Biological nitrogen transformation efficiency in removing nitrogen and improving water quality from zakho municipal wastewater in Kurdistan Region/iraq[J].IOP Conference Series: Earth and Environmental Science,2022,1120(1):012036.
[24] LIU J, LI X, XU Y L, et al.Highly efficient reduction of ammonia emissions from livestock waste by the synergy of novel manure acidification and inhibition of ureolytic bacteria[J].Environment International,2023,172:107768.