随着社会经济日益发展和人均消费水平的提升，羊肉的消费量逐渐增大[1]。锡林郭勒羊肉作为一种深受消费者欢迎的牲畜肉类，因其鲜味多汁、无膻味、肉质紧凑等特点而闻名于全国[2]。内蒙古自治区地方标准DB15/T 976—2019《锡林郭勒羊肉》对其品种来源有明确要求，主要来自本地品种乌珠穆沁羊和苏尼特羊。其中苏尼特羊是锡林郭勒盟北部苏尼特草原上经过长期选育逐渐形成的一个优良类型[3]，是我国少有的绵羊品种资源。苏尼特羊只有苏尼特地区以及周边一些生态条件完全一致的少部分地区生存[4]。乌珠穆沁羊也是驰名的地方优良品种，它是内蒙古自治区唯一绵羊保护品种，在中东国家享有盛名[5]。然而，锡林郭勒羊肉面临着和国家其他区域公用品牌一样的困局，品牌溢价造成来源于其他品种的羊肉仿冒锡林郭勒羊肉[6-7]。锡林郭勒盟成为全国牧区首个实现政策性肉羊保险全覆盖的地区[8]，同时被授予全国首个“草原生态羊都”称号[9]，市场亟需基于品种特征基因的锡林郭勒羊肉真实性检测分析方法，为规范羊肉市场提供科学依据。
苏尼特羊属于季节性发情，它的一胎只能产一个羊羔[10]。乌珠穆沁羊的特点也是繁殖力低[11]。小尾寒羊和湖羊都具有常年发情、性早熟和多羔特性[12]。以苏尼特羊和乌珠穆沁羊为代表的锡林郭勒绵羊产羔数少[13]，而全国普及率高的小尾寒羊产羔数多，这些都与FecB 基因密切相关[14]。刘秋月等[15]通过基因分型，建立了TaqMan 探针和SNaPshot 两种高通量FecB 突变分型方法。团队前期筛选到珠穆沁羊和苏尼特羊的FecB 基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）[16]位点（A），小尾寒羊和湖羊的对应基因位点（G），并建立了TaqMan 实时聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术识别FecB 等位基因的方法[17]。
目前，矿物质元素谱[18]和矿物元素指纹[19]这两种方法需要测定羊肉中的常量元素和微量元素，通过统计分析元素含量来进行绵羊产地溯源，缺点是测定成本高、耗费时间长。分子方法包括限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）[20]和微卫星[21]等方法，RFLP 方法限制性也很大，只能检测部分不同序列位点，DNA 链的二级结构还容易造成人工假象、测序结果偏差大、结果混乱等。微卫星方法也存在量化方法不统一、结果容易受到数据统计分析方法影响等不足。本研究所用SNP 技术具有易于快速、规模化筛查、便于基因分型和通量大等特点，旨在通过FecB 基因的SNP 等位基因位点，利用基因分型技术结合实时荧光PCR 进行绵羊分子鉴定。首先通过乌珠穆沁羊、苏尼特羊和小尾寒羊的基因分型分析，设定本地绵羊的等位基因比率A 和G 的判定标准，建立锡林郭勒羊肉真实性判定模型，以此分析锡林郭勒绵羊的真实性，以期填补实时荧光FecB 基因分型和等位基因比率A 和G 相结合来判定羊肉真实性的方法空白，为锡林郭勒羊肉的真实性分析提供依据。
1 材料和方法
1.1 材料采集
乌珠穆沁羊血液样品采集于锡林郭勒盟赛畜大会和东乌珠穆沁旗乌珠穆沁羊保种场（400 只），苏尼特羊血液样品采集于锡林郭勒盟赛畜大会和苏尼特右旗苏尼特羊保种场（400 只），小尾寒羊血液样品采集于山东菏泽小尾寒羊保种场和锡林浩特市毛登小尾寒羊保种场（84 只）。羊肉样品采集于锡林浩特市冷库（20 批，共480 个样品），羊耳朵样品采集于锡林浩特市屠宰场（11 批，共1 050 个样品）。
1.2 试剂与仪器
TransStart Probe qPCR SuperMix：北京全式金生物技术有限公司；十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）：上海国药集团化学试剂有限公司；光学黏附膜：杭州Axygen 公司；血液基因组DNA 快速抽提试剂盒：北京天根生化科技有限公司；实时荧光定量PCR 引物和探针合成：北京睿博兴科公司。引物和探针序列见表1。
表1 引物和探针序列
Table 1 Primers and probe sequences
注：FAMa 为6-羧基荧光素；MGBb 为小凹槽结合基团[22]；HEXc 为六氯-6-羧荧光素[23]。
名称上游引物下游引物探针-A探针-G序列（5′-3′）CCAGCTGGTTCCGAG CTTATACTCACCCAAGATGTTTTCATG FAMa-AAATATATCAGACGGTGTTG-MGBb HEXc-AAATATATCGGACGGTGTT-MGBb片段大小/bp 73退火温度/℃60
高速冷冻离心机（Eppendorf 5418R Centrifuge）：德国艾本德股份公司；核酸蛋白测定仪（Nanodrop 2000c）：美国Thermo Fisher Scientific 公司；实时荧光定量PCR 仪（ABI 7300plus 型）：美国Applied Biosystems 公司。
1.3 方法
1.3.1 DNA 提取
取1.1 准备好的样品，血液根据血液基因组DNA快速抽提试剂盒的说明书提取，肉和羊耳朵使用CTAB 法[24]提取DNA，采用核酸蛋白测定仪在260 nm（A260）和280 nm（A280）吸光度下测定样品中提取的DNA 的纯度和浓度，将浓度高的DNA 稀释浓度低于120 ng/μL。
1.3.2 反应体系与反应条件
反应体系（总体积6 μL）：TransStart Probe qPCR SuperMix 3 μL，上下游引物各0.3 μL，探针-A 0.15 μL，探针-G 0.15 μL，模板DNA 1 μL，补水至20 μL。
反应条件：95 ℃，10 min，1 个循环；95 ℃，30 s，60 ℃，1 min，40 个循环。在每次循环退火时收集荧光信号。
1.3.3 FecB 基因分型
将6-羧基荧光素（6-carboxy-fluorescein，FAM）标记的探针-A 与基因位点（A）配对，六氯-6-羧荧光素（hexacholoro-6-corboxy-fluorescein，HEX）标记的探针-G与基因位点（G）配对，利用TaqMan 实时荧光PCR 检测基因位点（A）的纯合子、基因位点（G）的纯合子和基因位点（A/G）的杂合子的绵羊各10 只，根据扩增曲线检测结果判定FecB 基因分型AA、AG 和GG[11]。
1.3.4 锡林郭勒羊肉真实性判定模型
锡林郭勒羊一般以乌珠穆沁羊和苏尼特羊为代表，而其它羊以分布广泛的高繁小尾寒羊为代表，将提取好的400 只乌珠穆沁羊血DNA、400 只苏尼特羊血DNA和84 只小尾寒羊羊血DNA 分别进行实时荧光PCR检测，实时荧光PCR 在光学96 孔反应板（200 μL）上进行，采用ABI 7300plus 实时荧光PCR 系统（Applied Biosystems），用光学黏附膜密封。统计3 种绵羊等位基因AA、AG 和GG 的个数，并计算基因位点（A）和（G）的比率，建立真实性判断模型。
1.3.5 冷库羊肉检测
通过实时荧光PCR 检测提取好的20 批冷库羊肉样品DNA，统计等位基因AA、AG 和GG 的个数，并计算基因位点（A）和（G）的比率，分析每批羊肉的真实性。
1.3.6 屠宰场羊耳朵检测
通过实时荧光PCR 检测提取好的11 批冷库羊耳朵样品DNA，统计等位基因AA、AG 和GG 的个数，并计算基因位点（A）和（G）的比率，分析每批羊耳朵的真实性。
1.4 数据处理
利用实时荧光定量PCR 仪自带分析软件，对结果进行扩增曲线和循环阈（cycle threshold，Ct）进行分析，根据得到的基因型计数换算获得两个等位基因位点的比率。
2 结果与分析
2.1 提取DNA 样品结果
血液样品DNA 提取采用血液基因组DNA 快速抽提试剂盒，肉和耳朵样品DNA 提取采用CTAB 方法。样品DNA 浓度和纯度见表2。
表2 样品DNA 浓度和纯度
Table 2 Concentration and purity of sample DNA
名称乌珠穆沁羊血液苏尼特羊血液小尾寒羊血液冷库采集羊肉屠宰场羊耳朵浓度范围/（ng/μL）23.4～112.7 22.3～117.7 21.5～117.6 15.0～119.2 19.0～116.1纯度范围1.62～1.90 1.63～1.99 1.64～1.92 1.62～2.01 1.63～1.89
样品DNA 浓度低于120 ng/μL 有利于提高试验操作的效率和减少样品的损失。由表2 可知，纯度在1.62～2.01 之间，说明样本DNA 都能适用于实时荧光PCR 扩增[14]。
2.2 FecB 基因分型结果
FecB 基因分型结果如图1 所示。
图1 TaqMan 实时荧光PCR 鉴定FecB 位点
Fig.1 TaqMan real-time fluorescence PCR to identify FecB locus
a.基因型AA；b.基因型GG；c.基因型AG。
由图1 可知，以相对荧光信号100 000 为阈值，只有荧光FAM 扩增曲线大于阈值为基因型AA；只有荧光HEX 扩增曲线大于阈值为基因型GG；基因型AG、荧光FAM 和荧光HEX 扩增曲线均大于阈值。
2.3 建立锡林郭勒羊肉真实性判定模型
绵羊品种的基因位点比率如表3 所示。
表3 绵羊品种及FecB 基因位点（A）和（G）统计
Table 3 Statistical analysis of sheep breeds and FecB gene loci（A）and（G）
群体组织数量基因型AA 400 398 10 GG AG G乌珠穆沁羊苏尼特羊小尾寒羊血液血液血液400 400 84 0 0 40 0 2 34基因位点比率/%A 100.00 99.75 32.14 0.00 0.25 67.86
由表3 可知，核心保种场400 只乌珠穆沁羊均为基因位点（A）的纯合子，基因位点（A）的比率为100.00%，基因位点（G）的比率为0.00%。核心保种场400 只苏尼特羊存在基因位点（A）的纯合子和基因位点（A/G）的杂合子，基因位点（A）的比率为99.75%，基因位点（G）的比率为0.25%，基因位点（G）比率远低于基因位点（A）。保种场小尾寒羊的84 个样本中，AA基因型有10 个，GG 基因型有40 个，AG 基因型有34 个，其中基因位点A 的比率为32.14%，明显低于前两种羊，基因位点G 的比率为67.86%，明显高于前两种羊。具体的数值判断无法满足于小群体羊群（样本量小于10），设定10 只羊中若只存在1 只基因位点（A/G）的杂合子为锡林郭勒羊可接受范围，即基因位点（G）的比率≤5%。因此，若基因位点（G）的比率大于5%，表示羊群体中含有高繁品种羊，非纯锡林郭勒羊群体，此设定也同样适用于上述核心保种场种质资源。综上所述，以样本量不少于10 为前提，以基因位点（G）的比率大于5%为判定模型，来判断锡林郭勒羊群中是否含有高繁品种羊。
2.4 冷库羊肉检测
20 批冷库采集绵羊肉批次及FecB 基因位点（A）和（G）比率如表4 所示。
表4 冷库采集绵羊肉批次及FecB 基因位点（A）和（G）比率
Table 4 Ratio of FecB loci（A）and（G）in different batches of mutton collected in cold storage
采样批次基因型数量50 20 40 10 20 10 20 20 20 35 15 30 30 25 40 20 15 15 20 25 AA 50 20 35 10 19 10 20 20 20 33 3 29 28 23 40 19 15 15 20 21 GG AG G 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 1 0 0 0 0 2 1 2 1 2 2 0 1 0 0 0 4基因位点比率/%A 100.00 100.00 93.75 100.00 97.50 100.00 100.00 100.00 100.00 97.14 60.00 98.33 96.67 96.00 100.00 97.50 100.00 100.00 100.00 92.00 0.00 0.00 6.25 0.00 2.50 0.00 0.00 0.00 0.00 2.86 40.00 1.67 3.33 4.00 0.00 2.50 0.00 0.00 0.00 8.00
由表4 所知，第1、2、4、6、7、8、9、15、17、18、19 批羊肉样品均为基因位点（A）的纯合子，它们的基因位点（G）的比率都是0.00%，说明这11 批羊肉样品不含有高繁品种羊，可以确定为锡林郭勒羊肉。而第5、10、12、13、14、16 批羊肉样品中既有基因位点（A）的纯合子，还有基因位点（A/G）的杂合子，其基因位点（G）的比率分别为2.50%、2.86%、1.67%、3.33%、4.00% 和2.50%，远小于对应基因位点（A）的比率，且小于锡林郭勒羊判定模型的5%，因此，这6 批羊肉样品也可以判定为锡林郭勒羊肉。由于第3、11 批和第20 批羊肉样品的基因位点（G）的比率为6.25%、40.00% 和8.00%，均符合判定模型基因位点（G）的比率大于5%，说明这4 批羊肉中均含有高繁品种羊肉，非纯种锡林郭勒羊肉。综上所述，20 批冷库羊肉样品中有17 批羊肉为锡林郭勒羊肉，3 批羊肉样品存在高繁品种羊肉。
2.5 屠宰场羊耳朵检测结果
11 批冷库采集绵羊耳朵批次及FecB 基因位点（A）和（G）比率如表5 所示。
表5 屠宰场采集绵羊耳朵批次及FecB 基因位点（A）和（G）比率
Table 5 Ratio of FecB loci（A）and（G）in different sheep ears collected in slaughter house
采样批次基因型数量92 115 148 92 90 51 157 98 101 34 72 AA 92 112 148 79 77 48 157 98 101 33 68 GG AG 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 3 0 12 G0 0 0 0 1 2 0 0 0 0 0 0 11 1.30 0 7.61 8.33 2.94 0 0 0 11 3 0 0 0 1 4等位基因比率/%A 100 98.70 100 92.39 91.67 97.06 100 100 100 98.53 97.22 1.47 2.78
由表5 可知，屠宰场采集的11 批样品中，第4 批和第5 批羊耳朵样品有基因位点（A）的纯合子、基因位点（G）的纯合子和基因位点（A/G）的杂合子，其基因位点（G）的比率为7.61% 和8.33%，符合判定模型，即存在高繁品种羊耳朵。第1、3、7、8、9 批羊耳朵样品的基因位点（G）的比率都是0.00%，即均是基因位点（A）的纯合子，是锡林郭勒羊。第2、6、10 批和第11 批羊耳朵样品有因位点（A）的纯合子和基因位点（A/G）的杂合子，基因位点（G）的比率都小于5%，说明这4 批羊耳朵样品为锡林郭勒羊。综上所述，11 批羊耳朵样品有9 批为锡林郭勒羊耳朵，2 批羊耳朵样品存在高繁品种羊耳朵。
3 结论与讨论
自从FecB 基因问世以来，FecB 基因就作为改良绵羊产羔数被广泛使用，而小尾寒羊由于FecB 基因突变率高于其它羊品种，因此，小尾寒羊常被用于作为母本改善其它品种羊的产羔数。产羔数提升虽然可以增加经济效益，但是对保护绵羊品种资源有不利的影响。锡林郭勒羊肉是国家著名区域公用品牌，具有肉质鲜美、无膻味等优点，是羊肉中的佳品，其价格一般会高于其它羊肉。由于价格的差异，其他品种的绵羊会混入本地市场，以谋取利益。本地市场混杂着多种绵羊肉，很难从肉质上判断本地羊肉。本地屠宰场待宰杀的羊群中也会很难判断是否存在其它绵羊品种。鉴于此，市场亟需锡林郭勒羊肉真实性检测分析方法，上述建立的方法可以应对造假掺假问题。首先通过采集锡林郭勒羊核心保种场种质资源，确定锡林郭勒羊大多数都为FecB 基因的SNP 等位基因位点（A）的纯合子，极少数存在基因位点（A/G）的杂合子，这些杂合子是由于骨形态发生蛋白受体1B（bone morphogenetic protein receptor 1B，BMPR1B）基因发生FecB 突变而产生。而采集的小尾寒羊既存在基因位点（A）的纯合子，又存在基因位点（A/G）的杂合子，还有基因位点（G）的纯合子，而且基因位点（A/G）的杂合子和基因位点（G）的纯合子占全部小尾寒羊的多数，是因为小尾寒羊发生这类基因突变较为明显。由此本文建立锡林郭勒羊真实性判断模型，以样本量不小于10 为前提，以基因位点（G）的比率5%为临界，大于5%则判定为羊群中存在高繁品种羊，小于5%则判定不存在高繁品种羊，比率等于5%时，需要对样本进行重新采集并检测，若比例仍等于5%，则判定羊群中存在高繁品种羊。本地冷库采集的20 批羊肉样品，其中有3 批羊肉的基因位点（G）的比率大于5%，说明这3 批羊肉中存在高繁品种羊肉。本地屠宰场采集的11 批羊耳样品中，2 批羊耳样品存在高繁品种羊。上述结果，证明了本地市场中存在高繁品种羊，即其它品种绵羊混入本地市场，此结果也说明上述方法的适用性。
本研究以TaqMan 实时荧光PCR 为检测手段，以绵羊多胎FecB 基因的SNP 等位基因位点（A）和（G）为分析对象，通过对核心保种场种质资源的分析，建立锡林郭勒羊的真实性判定模型，最后通过判定模型分析本地市场羊肉的真实性。分析结果为冷库采集羊肉和屠宰场羊耳朵样品中存在高繁品种，即本地市场确实存在其它肉羊品种的仿冒。因此，所建立的锡林郭勒羊肉真实性分析方法可以对区域公用品牌的保护和锡林郭勒羊的真实性分析提供科学依据。
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