基于非靶向代谢组学分析不同发酵方式马铃薯泡菜代谢物

陈冬菊1,刘琨毅1,2*,何二平3,杨双鹤1,杜欢1,杨艳丽4,吴荣书1,董霞1*

(1.云南农业大学 食品科学技术学院,云南 昆明 650201;2.宜宾职业技术学院五粮液技术与食品工程学院,四川 宜宾 644100;3.澄江老仓醋食品科技有限公司,云南 玉溪 652500;4.云南农业大学 植物保护学院,云南 昆明 650201)

摘 要:以马铃薯为原料,采用四菌组合的泡菜益生菌菌粉接种发酵马铃薯泡菜,自然发酵马铃薯泡菜作对照,并利用超高效液相色谱-串联质谱技术对马铃薯泡菜进行非靶向代谢组学研究。以差异倍数≥2 或≤0.5 且P<0.05 作为筛选标准进行差异代谢物筛选,结果表明,新鲜原料(XX)和接种发酵5 d(JZD5)、XX 和自然发酵5 d(ZRD5)、ZRD5 和JZD5 分别筛选到511、525、105 种差异代谢物。XX 和JZD5 以及ZRD5 的主要差异代谢为D-鸟氨酸、L-鸟氨酸、4-羧苯基甘氨、甘氨酰-苯丙氨酸、L-酪氨酸-L-丝氨酸、三羰基丙酸、2-氨基-4-氧戊酸等生物活性物质以及小肽,马铃薯泡菜的营养价值得到提高,同时还赋予其独特的风味。ZRD5 和JZDR5 中的主要差异代谢化合物有6-氨基己酸、DL-亮氨酸、茶氨酸、异柠檬酸等,这些差异代谢化合物赋予马铃薯生物活性成分和滋味成分,JZD5 中还含有相对含量较高的糖醇类、有机酸类化合物,形成其优于自然发酵马铃薯泡菜的滋味品质。此外,ABC 转运蛋白、乙醛酸和二羧酸代谢、嘌呤代谢、辅因子的生物合成等相关代谢途径在马铃薯发酵泡菜品质形成过程中发挥重要作用。

关键词:马铃薯;代谢组学;代谢通路;发酵方式;乳酸发酵

马铃薯是茄科属植物,也是我国的粮食兼蔬菜作物,含有丰富的碳水化合物、膳食纤维等营养成分[1]。近年来,随着一系列关于马铃薯政策的提出,增加马铃薯深加工产品,提高马铃薯附加值成为一大趋势[2],针对其开发更多类型的食品具有重要意义[3]。泡菜是一种传统的发酵食品,因其独特的风味和口感,深受大多数人的喜爱[4]。目前的研究显示,人们多用白菜、萝卜、芹菜、金针菇、卷心菜、秋葵等蔬菜来制作泡菜,以马铃薯为原料来制作泡菜的研究较少,仅见梁娜等[5]、王迎[6]以马铃薯为原料通过乳酸菌发酵得到感官品质优良的马铃薯方便食品以及马铃薯咸菜。

泡菜所采用的原料、发酵方式、发酵环境等会使泡菜产生不同的风味[7]。目前,泡菜加工主要有自然发酵和接种发酵两种方式,传统的自然发酵周期长、发酵条件难控制、产品品质不稳定、产品易存在安全性隐患,接种发酵能缩短发酵周期、降低生产成本、提高产品品质及适于工业化大规模生产[8]。Zhang 等[9]研究了短乳杆菌对萝卜泡菜发酵的影响,发现与自然发酵相比,接种短乳杆菌PL6-1 发酵萝卜泡菜可以提高甘露醇、乳酸和乙酸的最终代谢产物水平,也可以提高1,8-桉叶素、1-己醇、己酸、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚和丁香酚的水平,使萝卜泡菜具有花香、甜味和酸味。Kim等[10]采用乳酸乳球菌和柠檬明串珠菌混合发酵剂制作泡菜,与自然发酵泡菜相比,影响泡菜风味的甘露醇和氨基酸含量显著增加。因此,接种发酵可作为一种改进泡菜生产工艺的方法。

发酵是一个复杂的过程,可通过发酵赋予食品特殊的风味和营养,同时发酵食品具有复杂的化学成分,而这些化学成分对发酵食品的品质形成具有重要作用[11]。因此,通过代谢组学的手段监测发酵食品中的小分子代谢物对于揭示其品质特性具有重要作用[12]。马敬宜等[13]通过非靶向代谢组学技术研究了信阳红茶发酵过程中风味代谢物的动态变化,其中,儿茶素类、氨基酸、黄酮类、酚酸、酯类、醛类、醇类等的快速转化是红茶滋味和香气形成的主要因素。Xiao 等[14]利用转录组学和代谢组学揭示了四川泡菜风味形成与微生物基因表达的关系,该研究表明硫化合物、谷氨酸、天冬氨酸、乳酸、乙酸和苹果酸对四川泡菜的酸味、鲜味有重要影响。因此,本研究利用马铃薯为原料来制作泡菜,采用超高效液相色谱-串联质谱(ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)非靶向代谢组学技术对接种益生菌发酵和自然发酵马铃薯泡菜发酵前后的差异代谢化合物进行对比,同时用京都基因与基因组百科全书数据库(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEEG)进行代谢通路富集分析,以期为马铃薯泡菜的开发和应用研究提供理论参考,同时在一定程度上提高马铃薯的利用率、提高马铃薯的附加值、丰富泡菜的种类。

1 材料和方法

1.1 材料

马铃薯(合作88)、独头蒜、生姜:市售;泡菜益生菌粉(植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、戊糖片球菌,净含量100 g):镇江市天益生物科技有限公司;白砂糖:昆明松冠食品有限公司;泡菜盐:四川省盐业总公司;红星二锅头(清香型白酒52%vol):北京红星股份有限公司;750 mL 泡菜坛:安徽省凤阳县前力玻璃制品有限公司。

1.2 试剂

乙睛、甲醇:德国merck 公司;甲酸:美国Aladdin公司。以上试剂均为色谱纯。

1.3 主要仪器与设备

SHP 生化培养箱:北京中兴伟业仪器有限公司;AR224CN 电子天平:上海昕圣电子科技有限公司;Triple-TOF 5600 质谱仪:上海爱博才思分析仪器贸易有限公司;1290 Infinity LC 超高效液相色谱仪:美国安捷伦科技有限公司;ACQUITY UPLC BEH Amide 色谱柱(1.8 μm,2.1 mm×100 mm):美国沃特世公司。

1.4 方法

1.4.1 马铃薯泡菜发酵工艺

1.4.1.1 马铃薯样品预处理

玻璃坛的规格为750 mL,每坛装入马铃薯350 g、水400 mL,辅料添加量分别为盐16 g、糖20 g、姜10 g、大蒜10 g、52%vol 白酒4 mL,泡菜益生菌粉添加量为水体积的0.02%(质量分数)。

1.4.1.2 马铃薯泡菜发酵流程

马铃薯泡菜发酵流程:新鲜马铃薯→去皮、切分(长50 mm、宽10 mm、高10 mm)→冲洗干净马铃薯表面的淀粉(用经过煮沸并冷却至室温的纯净水)→护色(3% 食盐水中预盐渍30 min)→冲洗干净马铃薯块表面的食盐→浸渍(3%食盐水、加入生姜5%、大蒜5%、52%vol 白酒3%、泡菜益生菌粉1%)→发酵→真空包装→灭菌→成品。

操作要点:选用无病虫害的新鲜马铃薯为泡制原料,清洗干净,去皮切分成长50 mm、宽10 mm、高10 mm 的马铃薯条,冲洗干净马铃薯表面的淀粉,用食盐水护色。马铃薯切块时尽可能确保其大小均一,装坛用的玻璃瓶应提前沸水浸泡10 min 消毒杀菌后倒置晾干,装坛时防止生水进入坛内,并加入足量浸没马铃薯的3%食盐水与生姜5%(以马铃薯质量的百分比计,下同)、大蒜5%、52%vol 白酒3%、泡菜益生菌粉0.1%,装坛完成后密封发酵,保证玻璃坛内厌氧环境,发酵完成后真空包装并灭菌即为成品。

1.4.1.3 自然发酵

自然发酵同1.4.1.2 菌剂发酵工艺,不加泡菜益生菌粉进行发酵,发酵温度均为30 ℃,发酵时间共5 d。

1.4.1.4 试验设计

采用自然发酵和接种发酵两种发酵方式制作乳酸发酵马铃薯泡菜,发酵温度均为30 ℃,发酵时间共5 d,在发酵0、5 d 时取样并搅碎后用液氮速冻置于-80 ℃冰箱中保存用于代谢物的提取。发酵第0 天时的样品为新鲜样品标记为XX(XX1、XX2);自然发酵5 d 时取的样品标记为ZRD5(ZRD51、ZRD52);接种发酵5 d 时取的样品标记为JZD5(JZD51、JZD52)。每个样品设置3 个平行,每个平行样品做2 个重复,故每个样品共有6 个检测结果。

1.4.2 样品提取

取-80 ℃冰冻样本于冰上解冻(后续所有操作均在冰上进行),称量(20±1)mg 样本到对应编号离心管中;加入70% 甲醇水提取液400 μL,涡旋3 min;在4 ℃条件下,12 000 r/min 离心3 min,移取上清液200 μL 至对应进样瓶内衬管中,用于上机分析。

1.4.3 UPLC-MS/MS 分析

数据采集仪器系统主要包括超高效液相色谱-串联质谱系统。色谱条件与质谱条件参照马敬宜等[13]分析红茶采用的非靶向代谢组学技术。

1.4.4 定性定量分析

在UPLC-MS/MS 平台进行非靶向检测,基于迈维代谢数据库(metware data base,MWDB)鉴定代谢物的多离子对及保留时间(retention time,RT)等信息,结合迈维自建靶标数据库,进行多反应监测模式分析完成精确定量,以此得到代谢物的定性和定量结果。

1.5 数据处理

对提取得到的数据进行多维统计分析,用R 软件对鉴定的代谢产物进行主成分分析(principal component analysis,PCA),利用单维统计P 值及变异倍数(fold change,FC)分析筛选差异代谢物[15]。检索迈维代谢物标准品数据库及Metlin、人类代谢组数据库(human metabolome database,HMDB)、京都基因与基因组百科通路(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)等公共数据库后,对代谢物结构进行鉴定。以FC≥2 或≤0.5 和单变量分析的P<0.05 为标准来筛选具有显著差异的代谢物[16],通过KEGG 网站进行相关通路分析。

2 结果与分析

2.1 代谢产物的主成分分析

新鲜马铃薯、发酵后的马铃薯泡菜以及质控样品(QC)的主成分分析结果见图1。

图1 各组样品质谱数据的PCA 得分图
Fig.1 PCA plot of mass spectrometry data of samples in each group

由图1 可知,第一主成分的贡献率是52.87%,第二主成分的贡献率是15.33%,累计贡献率68.20%,表明总贡献率包含了新鲜马铃薯以及不同发酵方式马铃薯泡菜样品中的大部分代谢物信息,能反映不同马铃薯样品组间的代谢物差异,说明所建立的PCA 模型是可靠的。

2.2 发酵马铃薯样品代谢产物的火山图分析

发酵马铃薯样品代谢产物的火山图如图2 所示。

图2 差异代谢物的火山图
Fig.2 Volcano plot of differential metabolites

A.ZRD5 对照JZD5;B.XX 对照JZD5;C.XX 对照ZRD5。

由图2A 可知,在ZRD5 和JZD5 组中共筛选出105 种显著差异代谢物,有23 种显著差异代谢物上调,其中氨基酸及其代谢物9 种、碳水化合物及其代谢物9 种、有机酸及其衍生物5 种;有82 种显著差异代谢物下调,其中有氨基酸及其代谢物40 种、有机酸及其衍生物7 种、苯及其衍生物6 种、核苷酸及其代谢物4 种等。由图2B 可知,在XX 组和JZD5 组中共筛选出511 种显著差异代谢物,有379 种差异代谢物上调,其中有氨基酸及其代谢物144 种、有机酸及其衍生物51 种、苯及其衍生物48 种、脂肪酰类29 种、杂环化合物29 种等;有132 种显著差异代谢物下调,其中有氨基酸及其代谢物41 种、有机酸及其衍生物22 种、核苷酸及其代谢物18 种、碳水化合物及其代谢物18 种等。由图2C 可知,在XX 组和ZRD5 组中共筛选出525 种显著差异代谢物,有389 种差异代谢物上调,其中有氨基酸及其代谢物147 种、有机酸及其衍生物48 种、苯及其衍生物45 种、杂环化合物26 种等;有136 种差异代谢物下调,其中有氨基酸及其代谢物42 种、有机酸及其衍生物24 种、碳水化合物及其代谢物18 种、核苷酸及其代谢物18 种等。

综上,氨基酸及其代谢物、有机酸及其衍生物、苯及其衍生物是XX 与JZD5 组、XX 与ZRD5 组的主要显著差异代谢物,同时也是ZRD5 与JZD5 组主要显著差异代谢物。马铃薯经过自然发酵和接种发酵后其上调化合物数量为下调化合物数量的2~3 倍,说明新鲜马铃薯经过自然,接种发酵后其显著差异代谢化合物上、下调数量变化趋势基本一致。与JZD5 组相比ZRD5 下调显著差异代谢物个数约是上调显著差异代谢物个数的2 倍。

2.3 差异代谢物分析

在以FC≥2 或≤0.5 和P<0.05 作为筛选标准进行差异代谢物筛选的基础上,以上调差异倍数最大的前25 个显著差异代谢化合物和下调差异倍数最小的前25 个显著差异代谢化合物来进行分析,得到聚类热图,如图3 所示。

图3 差异代谢物聚类热图
Fig.3 Heatmap of differential metabolites

A.ZRD5 对照JZD5;B.XX 对照JZD5;C.XX 对照ZRD5。

由图3A 知,ZRD5 对照JZD5 组中的差异代谢化合物主要是氨基酸及其代谢物、碳水化合物及其代谢物、有机酸及其衍生物等。ZRD5 中相对含量较高的物质包括赖氨酸-亮氨酸、异亮氨酸-赖氨酸、L-精氨酸、茶氨酸等。JZD5 中相对含量较高的物质包括L-天冬氨酰-L-脯氨酰-L-谷氨酸、L-精氨酸、(R)-2-羟基丁酸、异柠檬酸等。ZRD5 对照JZD5 组中,有19 种氨基酸及其衍生物,酪氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸、谷氨酰苯-丙氨酸-丙氨酸、L-天冬氨酰-L-脯氨酰-L-谷氨酸、6-氨基己酸、DL-亮氨酸、L-精氨酸-L-天冬氨酸等6 种物质是JZD5中特有的物质。结果表明,JZD5 中的氨基酸及其代谢物的种类和含量比ZRD5 更丰富,这可能是接种发酵马铃薯泡菜中接种了植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌等乳酸菌,这些乳酸菌产生胞外蛋白酶可以更多分解马铃薯中的蛋白质转化成小肽和氨基酸[17]。在9 种碳水化合及其代谢物中,上调的7 个糖类化合物分别为D-甘露醇、己六醇、D-山梨糖醇、L-艾杜糖醇、1,5-酐-D-山梨糖醇、L-鼠李糖。除L-鼠李糖为糖类,其余均为糖醇类化合物,糖醇具有甜度低与改善食品质构的特点[18]。接种发酵马铃薯泡菜中接种的植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌是兼性异型乳酸菌,异型乳酸菌通过利用体内的甘露醇脱氢酶,在还原型辅酶Ⅰ的参与下,直接将果糖还原为甘露醇。因此,与自然发酵马铃薯泡菜相比,接种发酵马铃薯泡菜D-甘露醇相对含量显著升高。D-甘露醇类似于蔗糖略带点甜味,D-山梨糖醇具有清凉的甜味,可作为甜味剂,有增进食欲的作用[19]。鼠李糖(Lrhamnose)属于单糖类,结晶L-鼠李糖有甜味,其甜度阈值仅约有蔗糖的三分之一[20]。由此可知,糖醇的存在赋予了接种发酵马铃薯泡菜更甜更适宜的口感。有机酸类物质是影响泡菜风味和口感的重要组成部分,泡菜中的有机酸主要是通过蔬菜本身和发酵过程中乳酸菌的作用产生的,在发酵过程中可以抑制杂菌生长繁殖[21]。在5 个有机酸及其衍生物中,JZD5 中(R)-2-羟基丁酸、异柠檬酸、中康酸等相对含量较高且上调,异柠檬酸是JZD5 中独有的有机酸。因此,JZD5 比ZRD5 中含有相对含量更高和种类更丰富的有机酸及其衍生物。

由图3B 知,XX 对照JZD5 中的主要差异代谢物为氨基酸及其代谢物、有机酸及其衍生物和核苷酸及其代谢物。XX 中相对含量较高的化合物主要有尿囊酸、L-精氨酸、L-苏式-3-甲基天冬氨酸、L-谷氨酸、柠檬酸、苹果酸等。JZD5 中相对含量较高的化合物主要有L-谷氨酸、L-鸟氨酸、D-鸟氨酸等。XX 对照JZD5 组差异倍数较大的化合物主要有L-鸟氨酸、D-鸟氨酸、4-羧苯基甘氨酸、甘氨酰-苯丙氨酸等。其中L-鸟氨酸是一种非蛋白氨基酸,可以替代增甜剂作食品添加剂来改善食品风味[22]。与XX 相比,JZD5 中产生了4-羧苯基甘氨酸、甘氨酰-苯丙氨酸、丝氨酸-L-脯氨酸等小肽,小肽可以改善食品营养以及风味成分[23]。尿囊酸在经过接种发酵后其相对含量显著降低,可能是因为在发酵过程中微生物产生尿囊酸酰胺水解酶,从而催化尿囊酸分解使其含量降低[24]。N-乙酰-L-谷氨酰胺经过接种发酵后其相对含量为零,可能是因为N-乙酰-L-谷氨酰胺易溶于水,在发酵过程中马铃薯中的N-乙酰-L-谷氨酰胺全部溶解于水中。在差异代谢化合物中,有核苷酸及其代谢物9 种,下调的有8 种,上调的有1 种,2′-脱氧肌苷-5′-单磷酸、鸟苷在JZD5 中相对含量较高。在食品方面呈味核苷酸中肌苷酸、鸟苷酸、胞苷酸、尿苷酸和黄苷酸等被称为“超级味精”[25],在本研究中这些呈味核苷酸检出极少,且下调的个数较多,由此推测核苷酸及其代谢物对发酵马铃薯泡菜滋味的形成贡献较少。

由图3C 知,XX 对照ZRD5 中的主要差异代谢物为氨基酸、有机酸、核苷酸等。XX 中相对含量较高的化合物主要有L-丝氨酸、L-谷氨酸、尿囊酸、柠檬酸、苹果酸、鸟苷、2′-脱氧肌苷-5′-单磷酸、1,5-戊二胺等,ZRD5中相对含量较高的化合物主要有D-鸟氨酸、L-酪氨酸-L-丝氨酸、L-鸟氨酸、甘氨酰-苯丙氨酸、L-谷氨酸等。XX 与ZRD5 中差异倍数较大的化合物主要有D-鸟氨酸、L-酪氨酸-L-丝氨酸、L-鸟氨酸、甘氨酰-苯丙氨酸、4-羧苯基甘氨酸等。在差异代谢化合物中,有机酸及其衍生物7 种,上调的2 种,下调的有5 种。上调的2 种是三羰基丙酸、3-(3,4-二羟基)-4,5-二羟基苯甲酸,均为ZRD5 中特有,且相对含量较高。下调的5 种分别是阿魏酸、L-酒石酸、D-(+)-苹果酸、柠檬酸、苹果酸。因此,新鲜马铃薯经过发酵后其原有的一些有机酸相对含量减少,同时经过发酵也产生了一些新的相对含量较高的有机酸类物质,这与郝懿[26]研究新鲜香椿与自然发酵香椿泡菜中有机酸的相对含量变化规律结果类似。

2.4 差异代谢物富集通路分析

差异代谢物KEGG 富集图如4 所示。

由图4 可知,通过KEGG 数据库对ZRD5 和JZD5所有显著差异的代谢物进行通路富集分析。可获得69 种差异代谢通路,其中排在前20 的代谢通路(图4A),差异代谢物富集最多的前5 条通路分别是代谢途径主要包括1-甲基组氨酸、2,5-二羟基苯甲醛等41 种差异显著代谢物;ABC 转运蛋白主要包括D-甘露醇、D-山梨糖醇、DL-亮氨酸等8 种差异显著代谢物;酪氨酸代谢主要包括2,5-二羟基苯甲醛、多巴醌、肾上腺素等6 种差异显著代谢物;氨基糖和核苷酸糖代谢主要包括鸟苷酸-4-keto-6-脱氧甘露糖、N,N′-二乙酰基壳二糖等3 种差异显著代谢物;乙醛酸和二羧酸代谢主要包括异柠檬酸、L-酒石酸、中康酸3 种差异显著代谢物。

图4 差异代谢物KEGG 富集图
Fig.4 KEGG enrichment diagram of differential metabolites

A.ZRD5 对照JZD5;B.XX 对照JZD5;C.XX 对照ZRD5。

在XX 和JZD5 中所有显著差异的代谢物进行通路富集分析。可获得167 种差异代谢通路,其中排在前20 的代谢通路(图4B),差异代谢物富集最多的前5 条通路分别是辅因子的生物合成主要包括(±)-高柠檬酸、甲酰四氢叶酸等49 种差异显著代谢物;ABC 转运蛋白主要包括牛磺酸、4-氨基-5-羟基甲基-2-甲基嘧啶、腺苷等40 种差异显著代谢物;核苷酸代谢主要包括5′-单磷酸-2′-脱氧腺苷、2′-脱氧胞苷-5′-单磷酸等24 种差异显著代谢物;D-氨基酸代谢主要包括1,5-戊二胺、2-氨基-4-氧戊酸、5-氧化脯氨酸等23 种差异显著代谢物;嘌呤代谢主要包括5′-单磷酸-2′-脱氧腺苷、2′-脱氧肌苷-5′-单磷酸等23 种差异显著代谢物。

在XX 和ZRD5 中所有显著差异的代谢物进行通路富集分析。可获得167 种差异代谢通路,其中排在前20 的代谢通路(图4C),差异代谢物富集最多的前5 条通路分别是代谢途径主要包括2-氨基-2-脱氧异分支酸、(2S)-2-氨基-4-脱氧分支酸酯等217 种差异显著代谢物;辅因子的生物合成主要包括(±)-高柠檬酸、甲酰四氢叶酸等47 种差异显著代谢物。癌症的中心碳代谢主要包括柠檬酸、D-葡萄糖、D-葡萄糖-6-磷酸等23 种差异显著代谢物;D-氨基酸代谢主要包括1,5-戊二胺、2-氨基-4-氧戊酸、L-丙氨酸等23 种差异显著代谢物;嘌呤代谢主要包括5′-单磷酸-2′-脱氧腺苷、2′-脱氧肌苷-5′-单磷酸等23 种差异显著代谢物。

ZRD5 对照JZD5 组中的代谢途径富集到的代谢物最多,同时也是显著差异代谢通路。ABC 转运蛋白通路富集到D-甘露醇、D-山梨糖醇、L-亮氨酸等物质,为马铃薯泡菜营养成分与风味物质的合成发挥了重要作用[15]。氨基糖和核苷酸糖代谢、乙醛酸和二羧酸代谢通路富集到的D-甘露醇、D-山梨糖醇、异柠檬酸、L-酒石酸等对马铃薯泡菜的风味形成具有贡献。

XX 对照JZD5、XX 对照ZRD5 两组的代谢通路大致相似,有辅因子的生物合成中,D-氨基酸代谢、嘌呤代谢3 条共有的通路。辅因子是可与蛋白质结合使其发挥正常催化功能所必需的一类化合物,它的生成对体内代谢反应具有重要作用[27]。嘌呤代谢提供了大量重要生物合成所需的能量和辅助因子,也可作为癌细胞增殖的能量和底物[28]。D-氨基酸代谢通路富集到的L-丙氨酸具有独特的改善食品风味的作用,能够利用自身的碱性以及甜味来降低酸度[29]。XX 对照ZRD5 中富集代谢物最多的是代谢途径,在自然发酵马铃薯泡菜中活跃。XX 对照JZD5 中核苷酸代谢对人的营养至关重要,有研究表明摄入核苷酸有益于肝脏健康、肠道发育、成熟与修复,保持肾、脾脏、脑等其他组织器官的健康等[30]

3 结论

运用UPLC-MS/MS 对XX、ZRD5、JZD5 代谢产物进行检测,在XX 和ZRD5、XX 和JZD5、ZRD5 和JZD5 组之间分别筛选出525、511、105 种差异代谢物,筛选和鉴定结果表明,这些化合物属于氨基酸及其代谢物、有机酸及其衍生物、苯及其衍生物、杂环化合物、核苷酸及其代谢物、碳水化合物及其代谢物等。新鲜马铃薯经过发酵后产生了D-鸟氨酸、L-鸟氨酸等生物活性物质,同时也产生了4-羧苯基甘氨酸、甘氨酰-苯丙氨酸、丝氨酸-L-脯氨酸、酪氨酸-L-丝氨酸、天冬酰胺-赖氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸等小肽,提高了马铃薯的营养价值,同时也新产生了三羰基丙酸、2-氨基-4-氧戊酸、(R)-2-羟基丁酸等,对马铃薯泡菜滋味的形成作出贡献。

本研究以四菌(植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、戊糖片球菌)组合的泡菜益生菌菌粉接种发酵马铃薯制作泡菜,与自然发酵马铃薯泡菜相比,接种发酵新增了酪氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸、谷氨酰苯-丙氨酸-丙氨酸、L-天冬氨酰-L-脯氨酰-L-谷氨酸、6-氨基己酸、DL-亮氨酸、L-精氨酸-L-天冬氨酸等氨基酸及其衍生物,并使D-甘露醇、己六醇、D-山梨糖醇、L-艾杜糖醇、1,5-酐-D-山梨糖醇、L-鼠李糖、(R)-2-羟基丁酸、异柠檬酸、中康酸等代谢产物的相对含量显著升高。其中,酪氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸、谷氨酰苯-丙氨酸-丙氨酸、L-天冬氨酰-L-脯氨酰-L-谷氨酸、L-精氨酸-L-天冬氨酸为小肽,D-甘露醇、D-山梨糖醇、L-鼠李糖、异柠檬酸等使得马铃薯泡菜具有甜味和酸味。

综上,接种发酵马铃薯泡菜中氨基酸的种类及含量比自然发酵马铃薯泡菜丰富,与自然发酵马铃薯泡菜相比,接种发酵马铃薯泡菜中也含有相对含量较高的糖醇类化合物和有机酸及其衍生物,为接种马铃薯泡菜甜味和酸味口感作出贡献,故接种发酵马铃薯泡菜的营养价值和风味优于自然发酵马铃薯泡菜。KEGG 结果表明,ABC-转运蛋白、乙醛酸和二羧酸代谢、嘌呤代谢、辅因子的生物合成等相关代谢途径在马铃薯发酵泡菜品质形成过程中发挥了重要作用和生物学功能。本研究得到一种优于自然发酵且切实可行的马铃薯泡菜加工工艺,为马铃薯泡菜食品的应用以及开发马铃薯相关发酵食品提供参考。

参考文献:

[1] WICHROWSKA D, ROLBIECKI R, ROLBIECKI S, et al.Effect of drip fertigation with nitrogen application on bioactive compounds and the nutritional value of potato tubers before and after their longterm storage[J].Agriculture,2021,11(11):1076.

[2] 李子涵,杨晓晶.世界及中国马铃薯产业发展分析[J].中国食物与营养,2016,22(5):5-9.LI Zihan,YANG Xiaojing.Analysis on potato industry of world and China[J].Food and Nutrition in China,2016,22(5):5-9.

[3] 徐宁, 张洪亮, 张荣华, 等.中国马铃薯种植业现状与展望[J].中国马铃薯,2021,35(1):81-96.XU Ning, ZHANG Hongliang, ZHANG Ronghua, et al.Current situation and prospect of potato planting in China[J].Chinese Potato Journal,2021,35(1):81-96.

[4] CHA J,KIM Y B,PARK S E,et al.Does kimchi deserve the status of a probiotic food?[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition,2023:1-14.

[5] 梁娜,赖健.工艺条件对发酵方便马铃薯品质的影响[J].食品科技,2009,34(3):42-45.LIANG Na, LAI Jian.Study of fermented instant potato[J].Food Science and Technology,2009,34(3):42-45.

[6] 王迎.菜用马铃薯咸菜的加工工艺及其品质控制研究[D].广州:仲恺农业工程学院,2013.WANG Ying.Study on the processing and quality control in vegetable-potatos[D].Guangzhou: Zhongkai University of Agriculture and Engineering,2013.

[7] 叶美作,陈功,梁勇,等.不同蔬菜原料泡菜发酵过程中品质变化研究[J].四川农业科技,2022(5):66-70.YE Meizuo, CHEN Gong, LIANG Yong, et al.Study on quality changes of pickles with different vegetable materials during fermentation[J].Sichuan Agricultural Science and Technology, 2022(5):66-70.

[8] 张郁松.纯种发酵红皮萝卜泡菜工艺[J].食品工业,2023,44(2):38-40.ZHANG Yusong.Pickling technology of pure breed fermented radish with red skin[J].The Food Industry,2023,44(2):38-40.

[9] ZHANG X R, LI Y X, ZHAO Y R, et al.Effect of Levilactobacillus brevis as a starter on the flavor quality of radish Paocai[J].Food Research International,2023,168:112780.

[10] KIM M J, LEE H W, LEE M E, et al.Mixed starter of Lactococcus lactis and Leuconostoc citreum for extending kimchi shelf-life[J].Journal of Microbiology,2019,57(6):479-484.

[11] 汪冬冬,唐垚,伍亚龙,等.泡菜细菌多样性和风味成分研究进展[J].食品与发酵工业,2021,47(21):296-302.WANG Dongdong,TANG Yao,WU Yalong,et al.Advances on bacterial diversity and flavor of Paocai[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(21):296-302.

[12] GAO Y X, HOU L Z, GAO J, et al.Metabolomics approaches for the comprehensive evaluation of fermented foods: A review[J].Foods,2021,10(10):2294.

[13] 马敬宜,姚衡斌,周琼琼,等.信阳红茶发酵过程中非挥发性和挥发性代谢物的动态变化[J].现代食品科技, 2023, 39(5): 242-251.MA Jingyi, YAO Hengbin, ZHOU Qiongqiong, et al.Dynamic changes of nonvolatile and volatile metabolites during Xinyang black tea fermentation[J].Modern Food Science and Technology,2023,39(5):242-251.

[14] XIAO M Y,PENG Z,HARDIE W J,et al.Exploring the typical flavours formation by combined with metatranscriptomics and metabolomics during Chinese Sichuan Paocai fermentation[J].LWT-Food Science and Technology,2022,153:112474.

[15] 张雷,张璐璐,孙洪蕊,等.基于非靶向代谢组学的焙焦油莎豆粕精酿啤酒主发酵期代谢物变化研究[J].中国酿造, 2022, 41(5):89-95.ZHANG Lei, ZHANG Lulu, SUN Hongrui, et al.Metabolite changes of craft beer of baked Cyperus esculentus meal during main fermentation based on untargeted metabolomics[J].China Brewing,2022,41(5):89-95.

[16] 张标金,昌晓宇,刘清兰,等.基于广泛非靶向代谢组学解析富硒黄酒发酵过程的差异代谢产物[J].江西农业学报, 2022, 34(4):138-144.ZHANG Biaojin, CHANG Xiaoyu, LIU Qinglan, et al.Analysis of differential metabolites in selenium-enriched yellow rice wine fermentation based on extensive non-targeted metabolome[J].Acta Agriculturae Jiangxi,2022,34(4):138-144.

[17] 尚英,杜晓宏,熊荣园.发酵菌种对薏米乳品质及代谢产物的影响[J].中国酿造,2020,39(4):121-125.SHANG Ying, DU Xiaohong, XIONG Rongyuan.Effects of fermentation strains on the quality and metabolites of fermented coix beverage[J].China Brewing,2020,39(4):121-125.

[18] ZHANG W L,CHEN J J,CHEN Q M,et al.Sugar alcohols derived from lactose: Lactitol, galactitol, and sorbitol[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2020,104(22):9487-9495.

[19] HEGDE V L, VENKATESH Y P.Generation of antibodies specific to D-mannitol, a unique haptenic allergen, using reductively aminated D-mannose-bovine serum albumin conjugate as the immunogen[J].Immunobiology,2007,212(2):119-128.

[20] 陈宏喜.酸酶法生产L-鼠李糖工艺的研究[D].大连:大连工业大学,2018.CHEN Hongxi.Study on the production of L-rhamnose by acid enzyme method[D].Dalian:Dalian Polytechnic University,2018.

[21] UCAR F B, CELIK G, AKPINAR O, et al.Production of citric and isocitric acid by Yarrowia lipolytica strains grown on different carbon sources[J].Turkish Journal of Biochemistry, 2014, 39(3): 285-290.

[22] 万红贵,熊洋,张建,等.L-鸟氨酸产品开发与应用进展[J].中国酿造,2013,32(1):8-12.WAN Honggui, XIONG Yang, ZHANG Jian, et al.Research progress in products exploitation and application of L-ornithine[J].China Brewing,2013,32(1):8-12.

[23] WANG Y Q,NIE S,LI C S,et al.Application of untargeted metabolomics to reveal the taste-related metabolite profiles during mandarin fish(Siniperca chuatsi)fermentation[J].Foods,2022,11(7):944.

[24] DÍAZ-LEAL J L, TORRALBO F, ANTONIO QUILES F, et al.Molecular and functional characterization of allantoate amidohydrolase from Phaseolus vulgaris[J].Physiologia Plantarum, 2014, 152(1):43-58.

[25] 曾议霆,吴雪莉,杨春梅,等.基于非靶向代谢组学比较不同发酵方式红茶滋味物质差异[J].食品安全质量检测学报,2022,13(16):5288-5296.ZENG Yiting, WU Xueli, YANG Chunmei, et al.Comparison of taste substances of black tea with different fermentation methods based on non-targeted metabolomics[J].Journal of Food Safety &Quality,2022,13(16):5288-5296.

[26] 郝懿.加盐量对自然发酵香椿泡菜的品质及微生物菌群的影响[D].杨凌:西北农林科技大学,2021.HAO Yi.Effects of salt content on the quality and microbial communities of spontaneous fermented Toona sinensis Paocai[D].Yangling:Northwest A&F University,2021.

[27] 张蓝月,孙万成,罗毅皓.基于非靶向代谢组学分析不同地区羊肉代谢物的差异[J].现代食品科技,2023,39(7):91-101.ZHANG Lanyue, SUN Wangcheng, LUO Yihao.Analysis of metabolite differences of mutton in different regions based on non-targeted metabonomics[J].Modern Food Science and Technology,2023,39(7):91-101.

[28] 张妍,赵昕琪,王天琪,等.非靶向代谢组技术研究饮料发酵前后物质变化[J].食品与发酵工业,2021,47(22):115-120.ZHANG Yan, ZHAO Xinqi, WANG Tianqi, et al.Component changes in corn beverage before and after fermentation analyzed by non-targeted metabolomics technique[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(22):115-120.

[29] LIU X Z, NIU H, LI Q, et al.Metabolic engineering for the production of L-phenylalanine in Escherichia coli[J].Biotech, 2019, 9(3):85.

[30] 梁兴国,李佥,黄丽丽,等.核酸代谢与营养研究及发展趋势[J].中国海洋大学学报(自然科学版),2019,49(10):64-78.LIANG Xingguo, LI Qian, HUANG Lili, et al.Researches on nucleic acid metabolism and nutrition and their development[J].Periodical of Ocean University of China,2019,49(10):64-78.

Untargeted Metabolomics for Metabolites of Potato Pickles Fermented with Different Methods

CHEN Dongju1,LIU Kunyi1,2*,HE Erping3,YANG Shuanghe1,DU Huan1,YANG Yanli4,WU Rongshu1,DONG Xia1*
(1.College of Food Science and Technology,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,Yunnan,China;2.School of Wuliangye Technology and Food Engineering,Yibin Vocational and Technical College,Yibin 644100,Sichuan,China;3.Chengjiang Laocang Vinegar Food Technology Co.,Ltd.,Yuxi 652500,Yunnan,China;4.College of Plant Protection,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,Yunnan,China)

Abstract:Potato pickles were produced by fermentation with a combination of four probiotic strains,and the naturally fermented potato pickles were used as the control group.The untargeted metabolomics based on ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry was employed to analyze the metabolites in potato pickles.Based on the thresholds of fold change≥2 or≤0.5 and P<0.05,511,525,and 105 differentially changed metabolites(DCMs)were identified between fresh raw material(XX)and inoculated fermentation for 5 days(JZD5),between XX and natural fermentation for 5 days(ZRD5),and between ZRD5 and JZD5,respectively.The DCMs between XX and JZD5/ZRD5 were mainly D-ornithine,L-ornithine,4-carboxyphenylglycine,glycyl phenylalanine,L-tyrosine-L-serine,tri-carbonyl propionic acid,2-amino-4-oxvaleric acid,and other bioactive substances and small peptides,which contributed to the nutritional value and unique flavor of potato pickles.The DCMs between ZRD5 and JZDR5 included 6-aminocaproic acid,DL-leucine,theanine,and isocitric acid,which were the main bioactive substances and flavor components of potato pickles.Sugar alcohols and organic acids had high content in JZD5,which endowed the potato pickles with a taste superior to that of naturally fermented potato pickles.In addition,the results showed that the metabolic pathways such as ABC transporters,glyoxylic and dicarboxylic acid metabolism,purine metabolism,and cofactor biosynthesis played important roles in the quality formation of potato pickles during fermentation.

Key words:potato;metabolomics;metabolic pathway;fermentation method;lactic acid fermentation

DOI:10.12161/j.issn.1005-6521.2024.12.018

基金项目:云南省现代农业产业技术体系(2020 年度);宜宾职业技术学院创新团队项目(ybzy21cxtd-03)

作者简介:陈冬菊(1997-),女(汉),硕士,研究方向:农产品加工及贮藏。

*通信作者:刘琨毅(1987-),男(汉),副教授,博士,研究方向:发酵食品;董霞(1965-),女(汉),教授,博士,研究方向:花卉食品、蜂产品。

引文格式:

陈冬菊,刘琨毅,何二平,等.基于非靶向代谢组学分析不同发酵方式马铃薯泡菜代谢物[J].食品研究与开发,2024,45(12):135-143.

CHEN Dongju,LIU Kunyi,HE Erping,et al.Untargeted Metabolomics for Metabolites of Potato Pickles Fermented with Different Methods[J].Food Research and Development,2024,45(12):135-143.

加工编辑:孟琬星

收稿日期:2023-05-04