我国是全球第一大鸡蛋生产国和消费国[1]。然而，蛋鸡的集约化养殖过程中对抗生素的依赖性极大地增加了鸡蛋中高残留物的风险。环丙沙星（ciprofloxacin，CIP）属于氟喹诺酮类抗生素，其结构简单、抗菌谱广、抗菌活性强、价格低廉，在家禽养殖业中被广泛用于治疗和预防细菌感染等疾病[2-3]。但是由于不合理的使用和较差的降解性，导致CIP 极易残留在可食用动物体内并通过多种途径进入人体。这可能会导致机体产生抗生素耐药性，引起肌腱损伤、肝毒性、中枢神经系统不良反应和胃肠道功能紊乱等疾病[2，4-5]。目前，许多国家已经禁止在家禽养殖业中使用部分抗生素并严格规定抗生素的残留限量。GB 31650—2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》规定了食品中CIP 的最大残留限量，并明确在家禽产蛋期禁用[6]。因此，建立准确、灵敏的CIP 残留检测方法，对于保障鸡蛋质量安全，促进我国禽蛋产业的健康发展具有重要意义。
当前开发的检测CIP 残留的分析方法主要包括高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法[7]、液相色谱-质谱（liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS）法[8]、毛细管电泳法[9]、酶联免疫分析（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法[10]、电化学法[11-13]等。这些方法存在样品前处理步骤繁琐、仪器昂贵，或者对抗体高度依赖、检测成本较高等问题。重现性和稳定性不佳等问题也限制了电化学检测法的广泛应用。荧光检测技术作为一种新兴的快检技术，具有操作简便、响应迅速、灵敏度高、特异性强等优点[14-15]，在实现鸡蛋中CIP 残留检测方面具有良好的应用前景。近几年，虽然国内外关于CIP 荧光检测的研究已经取得一定进展[16-18]，但大多是基于单一信号检测的荧光探针，检测结果易受探针浓度、激发波长和环境因素干扰[19]，使其对待测物的检测准确度下降。引入参考信号，不仅可以通过自校准提高灵敏度和精度，而且便于目视监测。然而，目前使用双信号荧光探针检测CIP 的报道较少。
综上，本研究以茜素和六水合三氯化铝为原料，构建一种基于Al3+触发的茜素聚集诱导发光效应的新型荧光探针，并利用Al3+和CIP 之间的配位，可用于鸡蛋中CIP 残留的比率荧光快速检测。该探针的构建以期为鸡蛋质量安全监控提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
六水合三氯化铝（AlCl3·6H2O）、环丙沙星、氯霉素（chloramphenicol，CHL）、罗红霉素（roxithromycin，ROX）、氨苄青霉素钠（ampicillin sodium，AMP）、盐酸林可霉素（lincomycin hydrochloride，LIN）、链霉素（streptomycin，STR）、阿奇霉素（azithromycin，AZI）、硫酸卡那霉素（kanamycin sulfate，KAN）、硫酸庆大霉素（gentamicin sulfate，GEN）、呋喃西林（furacillin，FRZ）、硫酸钠、亚硫酸钠、氯化镁、氯化锌、葡萄糖、L-组氨酸（L-histidine，L-His）、乙腈：麦克林生物试剂有限公司；茜素：西陇科技有限公司；4-羟乙基哌嗪乙磺酸（4-hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid，HEPES）、二甲基亚砜：阿拉丁化学试剂有限公司。以上试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
FL6500 荧光分光光度计：美国珀金埃尔默仪器有限公司；ML-3002T/02 精密型电子天平（精度0.000 1 g：梅特勒-托利多国际有限公司；ZSU3100Zeta 电位仪：英国马尔文帕纳科仪器有限公司；DF-101S 恒温水浴锅：巩义市予华仪器有限责任公司；KQ-250DE 超声波多频清洗机：昆山超声仪器有限公司；JW-3021HR 高速冷冻离心机：达美柯国际有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 茜素-Al3+荧光探针的构建
将茜素溶液（500 μL，0.5 mg/mL）和AlCl3 溶液（600 μL，4.0 mmol/L）充分混合并在室温下静置5 min。随后，将1 500 μL 的HEPES 缓冲液（0.01 mol/L，pH5.0）加入到上述溶液中，获得茜素-Al3+荧光探针。
1.3.2 比率荧光探针检测条件优化
采用单因素试验法，对可能影响探针荧光信号强度的因素（缓冲液pH 值、孵育时间、Al3+浓度和孵育温度）进行优化。在360 nm 的激发波长下，测定其荧光强度，激发波长和发射波长的狭缝均为10 nm。用1 mol/L 的NaOH 和HCl 分别配制pH 值为3～11 的HEPES 缓冲液（0.01 mol/L），在相同条件下测试加入不同pH 值的HEPES 缓冲液时茜素-Al3+荧光探针的荧光信号强度，确定探针所使用缓冲液的最佳pH 值；用荧光分光光度计对茜素-Al3+荧光探针进行荧光强度动态监测，确定其最佳孵育时间；依次配制0～11 mmol/L的AlCl3 溶液，用荧光分光光度计测试不同浓度的Al3+存在条件下探针的荧光信号强度，确定最佳Al3+浓度；将茜素-Al3+荧光探针置于金属浴中，分别调节温度为4、25、37、45、60、70 ℃，孵育15 min 后测试探针的荧光强度，确定探针的最佳孵育温度。
1.3.3 茜素-Al3+探针的分析性能评估
1.3.3.1 灵敏度分析
在最佳检测条件下，向探针溶液中加入500 μL 不同浓度的CIP 溶液（0、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、7.0、10.0、13.0、15.0 μmol/L）。在360 nm 的激发波长下，测定其荧光强度，激发波长和发射波长的狭缝均为5 nm。以436 nm（CIP 的特征峰）和650 nm（探针的特征峰）的荧光强度比值为纵坐标，CIP 浓度为横坐标作标准曲线。根据3σ/s 原则计算得到检测限，分析探针对CIP 检测的灵敏度。所有试验设置3 个平行，取平均值。
1.3.3.2 选择性分析
在最佳检测条件下，将食品中常见的干扰物质（500 μL，50 μmol/L）如生物大分子（葡萄糖、组氨酸）、阴离子（SO32-、SO42-）、阳离子（Mg2+、Zn2+）和其他常用抗生素（氯霉素、罗红霉素、氨苄西林、林可霉素、链霉素、阿奇霉素、卡那霉素、庆大霉素、呋喃西林）添加到探针溶液中并测定其荧光强度，以分析探针对CIP 的选择性。
1.3.3.3 抗干扰性分析
在最佳检测条件下，向探针溶液中分别加入250 μL 的CIP 溶液（5 μmol/L）和250 μL 的干扰物质溶液（50 μmol/L），如生物大分子（葡萄糖、组氨酸）、阴离子（SO32-、SO42-）、阳离子（Mg2+、Zn2+）和其他常用抗生素（氯霉素、罗红霉素、氨苄西林、林可霉素、链霉素、阿奇霉素、卡那霉素、庆大霉素、呋喃西林）测定其荧光强度，分析探针对CIP 检测的抗干扰性。
1.3.4 实际样品中CIP 的测定
称取1.0 g 鸡蛋样品并涡旋混合均匀。随后添加2 mL 的CIP 溶液（0、0.5、1.5、2.5 μmol/L），再加入5 mL的乙腈溶液（乙腈∶水=9∶1，体积比）。涡旋混合均匀后，超声处理10 min，4 ℃离心10 min（12 000 r/min），收集上清液。重复上述操作3 次，收集上清液备用。向探针溶液中加入500 μL 上述提取液（CIP 浓度分别为0、0.5、1.5、2.5 μmol/L），60 ℃下孵育15 min 后在360 nm 的激发波长下测定其荧光强度。试验设置3 个平行，取平均值。
将所得的荧光信号比值代入1.3.3.1 灵敏度分析中建立的标准曲线公式，计算CIP 含量。再根据实际添加量计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），计算公式如下。
R = S/Y
式中：R 为相对标准偏差；S 为标准偏差；Y 为计算结果的平均值。
1.4 数据分析
所有试验均设置3 个平行，试验结果用平均值±标准差表示。试验所得数据利用Origin 2023 软件进行分析作图。
2 结果与分析
2.1 茜素-Al3+荧光探针的构建及检测原理
Al3+对茜素荧光发射强度的影响和CIP 对茜素-Al3+探针荧光发射强度的影响见图1。
图1 Al3+对茜素荧光发射强度的影响和CIP 对茜素-Al3+探针荧光发射强度的影响
Fig.1 Effect of Al3+on fluorescence emission intensity of alizarin and effect of CIP on fluorescence emission intensity of alizarin-Al3+probe
由图1 可知，茜素溶液在360 nm 的激发波长下在650 nm 处表现出微弱的荧光信号。随着Al3+的加入，茜素溶液在650 nm 处的荧光信号明显增强，紫外灯下也展现出明显的红色荧光。这可能由于Al3+通过与茜素表面的—OH 基团配位而诱导茜素聚集产生聚集诱导效应，从而产生较强的荧光[20]。茜素和Al3+配位原理图见图2。
图2 茜素和Al3+配位原理图
Fig.2 Schematic diagram of coordination between alizarin and Al3+
CIP 溶液在436 nm 处表现出本征荧光，当其被添加到茜素-Al3+探针溶液中时，Al3+显著增强CIP 的荧光信号。源自于茜素的650 nm 荧光发射峰基本保持不变，这为比率荧光检测CIP 提供了可能。图3 为茜素溶液在添加Al3+溶液前后的水动力直径分布图。
图3 Al3+溶液添加前后茜素溶液的水动力直径分布图
Fig.3 Hydrodynamic diameter distribution of alizarin solution before and after Al3+solution addition
由图3 可知，Al3+的引入诱导茜素溶液发生聚集，使其平均直径从25.95 nm 变为48.99 nm。因此，可以向茜素溶液中添加Al3+构建荧光探针，通过计算436 nm 和650 nm 处的荧光信号比值，对CIP 进行检测。
Fu 等[21]研究表明，Al3+通过与CIP 中的羧基和吡啶酮络合，抑制CIP 分子的激发态分子内质子转移（excited state intramolecular proton transfer，ESIPT），从而增强CIP 的荧光信号。可以推断，基于茜素-Al3+探针对CIP 的响应机制可能是由于Al3+结合茜素后进一步与CIP 形成复合物，抑制了CIP 的ESIPT，导致荧光信号的增强。Al3+与CIP 的结合模型见图4。
图4 Al3+与CIP 的结合模型
Fig.4 Binding models of Al3+to CIP
图5 展示了茜素-Al3+荧光探针溶液在添加CIP 前后的水动力学直径。
图5 CIP 溶液添加前后茜素+Al3+溶液的水动力直径分布图
Fig.5 Hydrodynamic diameter distribution of alizarin+Al3+solution before and after CIP solution addition
由图5 可知，CIP 的加入使茜素-Al3+荧光探针的平均直径从48.99 nm 增加到88.26 nm，表明CIP 可以通过静电相互作用与茜素-Al3+探针结合。
2.2 茜素-Al3+探针检测条件优化
2.2.1 缓冲液pH 值
pH 值是影响探针荧光强度和稳定性的重要因素。pH 值对茜素-Al3+探针在650 nm 处的荧光强度的影响见图6。
图6 缓冲液pH 值对茜素-Al3+探针荧光强度的影响
Fig.6 Effect of pH value of buffer on the fluorescence intensity of alizarin-Al3+probe
由图6 可知，当缓冲液为酸性（pH＜5）时，探针在650 nm 处的荧光信号强度呈上升趋势。在pH5 时，茜素-Al3+探针的荧光强度达到最大值。而pH 值超过5 时，探针的荧光强度随缓冲液pH 值增大而逐渐降低，且当pH 值为11 时探针的红色荧光几乎消失。因此选择pH5 为探针体系的最佳缓冲液pH 值。
2.2.2 孵育时间
孵育时间对茜素-Al3+探针荧光强度的影响见图7。
图7 孵育时间对茜素-Al3+探针荧光强度的影响
Fig.7 Effect of incubation time on the fluorescence intensity of alizarin-Al3+probe
由图7 可知，随着反应时间的延长，探针的荧光强度不断上升，并在15 min 时达到顶点。当反应时间超过15 min 后，探针的荧光强度基本保持不变，说明Al3+与茜素反应达到动态平衡。因此，将茜素-Al3+探针的最佳反应时间设置为15 min。
2.2.3 Al3+浓度
Al3+浓度对探针荧光信号的影响如图8 所示。
图8 Al3+浓度对茜素-Al3+探针荧光强度的影响
Fig.8 Effect of Al3+concentration on the fluorescence intensity of alizarin-Al3+probe
由图8 可知，探针的荧光强度随着Al3+浓度增大而不断增强。当Al3+浓度为4 mmol/L 时，探针的荧光信号达到最大值且趋于稳定。这是因为茜素与Al3+配位达到动态平衡，无法再继续增强茜素的荧光。因此探针中Al3+最佳浓度设定为4 mmol/L。
2.2.4 孵育温度
温度对茜素-Al3+探针荧光强度的影响见图9。
图9 孵育温度对茜素-Al3+探针荧光强度的影响
Fig.9 Effect of incubation temperature on the fluorescence intensity of alizarin-Al3+probe
由图9 可知，随着温度的升高，探针的荧光强度不断增强，当温度为60 ℃时探针荧光强度达到最大值。继续提高温度，探针的荧光强度呈下降趋势。而茜素溶液的荧光强度在4～70 ℃范围内比较稳定，均呈现较低水平。因此选择60 ℃为茜素-Al3+探针的最佳孵育温度。
2.3 茜素-Al3+荧光探针检测CIP 的分析性能评估
2.3.1 灵敏度分析
在最佳条件下，探究所建立的荧光探针对于CIP的检测灵敏度。以CIP 浓度与探针荧光信号的比值建立线性关系。茜素-Al3+探针在添加CIP 后的荧光发射图谱以及CIP 浓度与荧光强度比（I436/I650）的线性相关曲线分别如图10 和图11 所示。
图10 茜素-Al3+探针在添加CIP 后的荧光发射图谱
Fig.10 Fluorescence emission map of alizarin-Al3+probe after adding CIP solution
图11 CIP 浓度与荧光强度比（I436/I650）的线性相关曲线
Fig.11 Linear correlation curve between CIP concentration and fluorescence intensity ratio（I436/I650）
由图10、图11 可知，随着CIP 浓度的增加，436 nm 处荧光峰显著上升，而属于茜素的650 nm 处荧光峰基本保持不变。荧光强度比（I436/I650）与CIP 浓度在0.01～10.00 μmol/L 范围内线性相关，回归方程为y=1.760x-0.137（R2=0.991）。根据3σ/s 原则，计算得到检测限为6.9 nmol/L。在365 nm 紫外灯下也可以观察到，随着CIP 浓度的增加，探针溶液的荧光逐渐由红色变为紫色再变为蓝色。因此，该探针可以用于CIP的光谱分析和可视化半定量检测。
2.3.2 选择性和抗干扰性分析
考虑到实际样品的复杂性，本研究分析探针的选择性和抗干扰能力。茜素-Al3+探针的选择性见图12。
图12 茜素-Al3+探针的选择性
Fig.12 Selectivity of alizarin-Al3+probe
由图12 可知，只有CIP 能明显增强探针的荧光信号强度比（I436/I650）。其他干扰物质包括CHL、ROX、AMP、LIN、STR、AZI、KAN、GEN、FRZ、Mg2+、Zn2+、SO32-、SO42-、L-His、Glu，对I436/I650 的影响几乎可以忽略不计。这一结果表明该探针对CIP 具有良好的选择性。进一步探讨了干扰物质与CIP 共存时探针的检测稳定性。
茜素-Al3+探针的抗干扰能力见图13。
图13 茜素-Al3+探针的抗干扰能力
Fig.13 Interference resistance of alizarin-Al3+probe
虚线表示干扰物在引入CIP 前后的差异性标识。
由图13 可知，即使干扰物质以10 倍于CIP 浓度被引入，其对荧光信号的影响也很小。由此可见，所开发的探针具有优异的抗干扰性能，有望应用于实际样品中CIP 残留的分析。
2.4 鸡蛋样品中CIP 残留的检测
以鸡蛋作为实际样品通过加标回收法验证所制备茜素-Al3+荧光探针在CIP 检测中的实际应用潜力。茜素-Al3+探针检测鸡蛋样品中的CIP 残留的具体信息见表1。
表1 鸡蛋样品中CIP 的测定
Table 1 Determination of CIP in egg samples
注：-表示此时加标量为0，回收率无法计算。
加标浓度/（μmol/L）0 0.50 1.50 2.50检测浓度/（μmol/L）0.11 0.52 1.64 2.35平均回收率/%-82.0 102.0 89.6相对标准偏差（n=3）/%0.06 0.13 0.06 0.17
由表1 可知，CIP 在鸡蛋中的回收率为82.00%～102.00%。相对标准偏差（RSD）均小于0.20%。结果表明，所构建的茜素-Al3+探针可用于CIP 的灵敏、准确检测，具有广阔的应用前景。
3 结论
本试验基于聚集诱导发光效应，构建了茜素-Al3+荧光探针用于CIP 的比率荧光可视化快速检测。在最佳检测条件下，茜素-Al3+探针的荧光强度比值与CIP的浓度在0.01～10.00 μmol/L 范围内呈线性相关，检测限为6.9 nmol/L。此外，探针具有较好的选择性和抗干扰能力，几乎不受食品中常见的干扰物质的影响。在实际鸡蛋样品的检测中，回收率为82.00%～102.00%，相对标准偏差小于0.20%。该方法成本低廉、操作简便，准确可靠，且仅需15 min 即可完成检测，具有很好的应用前景。
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