鸭肝是一种营养丰富的食品，富含蛋白质、脂肪、维生素和矿物质，不仅是一种优质的蛋白资源，同时还含有大量的超氧化物歧化酶，具有优良的抗氧化、抗炎以及抗衰老等作用[1]。我国鸭肝内脏资源丰富，但其利用率很低，大部分被丢弃，只有少部分被制成动物饲料或肥料使用，造成资源的极大浪费[2]。因此，促进鸭源加工副产品的高值化利用，是畜禽业发展亟待解决的关键问题[3]。
酶解法是利用蛋白酶水解蛋白质产生特定多肽片段的方法，广泛应用于生物活性肽的制备工艺中[4]。唐素婷等[5]以鸭心为原料，中性蛋白酶为水解酶，通过单因素和响应面试验得到最佳酶解条件，在最优条件下酶解液的水解度可达17.49%，DPPH·清除率达58.96%。Yu 等[6]采用响应面法优化超声辅助酶法制备猪肝工艺，在最佳条件下猪肝酶解物的水解度、DPPH·清除率和亚铁离子螯合能力分别为24.12%、79% 和98.18%。随着人们生活水平的提高和科学技术的进步，通过酶解动物内脏来生产具备多种生理功能的生物活性肽，已经变成了一种能显著提升副产品附加价值的技术手段[7]，部分研究者对鸭肝中的活性物质进行了制备纯化。Sun 等[8]采用反相高效液相色谱法分离纯化得到两种新型鸭肝蛋白肽：DTYIRQPW和WDDMEKIWHH，并确定这两种肽具有保护HepG2细胞免受氧化损伤的能力。张来弟等[9]从鸭肝中筛选得到3 种具有抗炎功效的新肽，其中，肽段VIESPPEI在质量浓度为100 μg/mL 时，对肿瘤坏死因子-α 释放的抑制率达42.48%。但目前国内外对酶解法制备鸭肝抗氧化肽的研究报道较少，关于鸭肝酶解物对机体抗氧化作用的分子机制研究更是鲜有报道。
本研究以新鲜鸭肝为原料，以石油醚-乙醇混合溶液为脱脂液，采用超声辅助脱脂后，使用酶解法提取鸭肝多肽。从碱性蛋白酶、风味蛋白酶等8 种蛋白酶中筛选出风味蛋白酶为最佳水解酶。以DPPH·清除率和水解度为指标，通过单因素试验和响应面试验优化鸭肝肽的提取工艺，得到具有抗氧化特性的鸭肝肽酶解液，以期为鸭肝的综合利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鸭肝：河北乐寿鸭有限责任业公司。无水乙醇（分析纯）：天津欧博凯化工有限公司；石油醚（分析纯）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、酸性蛋白酶（2×106 U/g）、中性蛋白酶（5×105 U/g）、碱性蛋白酶（2×106 U/g）、菠萝蛋白酶（6×105 U/g）、胰蛋白酶（2.5×105 U/g）、胃蛋白酶（1×106 U/g）（均为分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；木瓜蛋白酶（2.4×106 U/g），（分析纯）：北京百灵威科技有限公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠（均为分析纯）：天津欧博凯化工有限公司；甲醛（分析纯）：天津市永大化学试剂公司；风味蛋白酶（1.5×104 U/g，分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司。
1.2 试验仪器
高速万能粉碎机（TAISITE）：天津市泰斯特仪器有限公司；水浴恒温振荡器（SHZ-B）：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；高性能均质机（T25 digital）：德国IKA 公司；高速冷冻离心机（3-18K）：德国SIGMA 公司；酶标仪（Plus384）：美谷分子仪器有限公司；紫外分光光度计（Evolution 220）：美国Thermo 公司。
1.3 试验方法
1.3.1 鸭肝脱脂前处理
剔除鸭内脏上可见的血管、胆管等结缔组织及脂肪，使被提取物充分释放出来。将内脏剁碎，高性能均质机10 000 r/min 匀浆3 次，每次20 s，间隔10 s[10]。
将体积比为1∶1 的无水乙醇和石油醚混合均匀，制成脱脂液，取内脏匀浆与脱脂液按体积比1∶3 均匀混合，超声处理30 min，常温反应一段时间后，8 000 r/min离心10 min[11]，将沉淀置于通风处直至其干燥且有机溶剂气味消失。分装于清洁的真空包装袋中，在-20 ℃条件下进行储存备用。
1.3.2 最适蛋白酶筛选
选用8 种蛋白酶进行筛选试验，在蛋白酶的最适条件下对样品进行酶解，各酶的最适条件见表1。称取一定质量的样品按1∶10（g/mL）加入配制好的缓冲液中，蛋白酶酶活设置为2 000 U/g，缓冲液pH 值和反应温度为蛋白酶各自的最适反应条件，使用恒温水浴振荡2 h，沸水浴煮沸15 min 灭酶，然后以8 000 r/min的速度离心10 min，收集上层清液[12]。采用DPPH·清除率和蛋白水解度这两个指标来评估酶解效果，从中筛选出最佳的蛋白酶。
表1 蛋白酶最佳水解条件
Table 1 Optimum hydrolysis conditions of protease
种类酸性蛋白酶中性蛋白酶碱性蛋白酶风味蛋白酶菠萝蛋白酶木瓜蛋白酶胰蛋白酶胃蛋白酶最适pH 值4.0 7.0 10.0 7.0 6.0 6.0 8.0 2.2最适温度/℃50 50 50 50 50 50 50 37
表2 Plackett-Burman 试验因素水平
Table 2 Factors and levels of Plackett-Burman test
A 酶解pH 值5.0 7.0 B 酶解时间/h 3 5 C 酶用量/（U/g）3 000 5 000 D 料液比/（g/mL）1∶5 1∶15 E 酶解温度/℃40 60
1.3.3 酶解工艺的单因素优化试验
1.3.3.1 料液比对抗氧化性和水解度的影响
鸭肝和0.2 mol/L、pH7.0 的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）料液比设置为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）。然后调整pH 值至7.0，设定酶解温度为50 ℃，酶用量为2 000 U/g，设定酶解时间为3 h。当反应完成后，灭酶，8 000 r/min 离心10 min 取得上层的清液，并对酶解液的DPPH·清除率和水解度进行测定。
1.3.3.2 酶解温度对抗氧化性和水解度的影响
鸭肝和PBS 缓冲液料液比设置为1∶10（g/mL），pH 值为7.0，酶用量为2 000 U/g，酶解时间设定为3 h，酶解所需温度分别为25、30、40、50、60 ℃。反应结束后，灭酶，8 000 r/min 离心10 min 取上清液，测定酶解液的DPPH·清除率及水解度。
1.3.3.3 酶解时间对抗氧化性和水解度的影响
将鸭肝和PBS 缓冲液料液比设置为1∶10（g/mL）。酶解的温度应为50 ℃，pH 值为7.0，酶用量为2 000 U/g，酶解的时间分别设定为1、2、3、4、5 h。当反应完成后，灭酶，8 000 r/min 离心10 min 取上清液，并测定酶解液的DPPH·清除率和水解度。
1.3.3.4 酶解pH 值对抗氧化性和水解度的影响
鸭肝和PBS 缓冲液料液比设置为1∶10（g/mL），酶解温度为50 ℃，酶解时间为4 h，，酶用量为2 000 U/g，酶解pH 值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。反应结束后，灭酶，8 000 r/min 离心10 min 取上清液，测定酶解液的DPPH·清除率及水解度。
1.3.3.5 酶用量对抗氧化性和水解度的影响
鸭肝和PBS 缓冲液料液比设置为1∶10（g/mL），酶解温度为50 ℃，酶解时间为4 h，pH 值为6.0，酶用量分别为2 000、3 000、4 000、5 000、6 000 U/g，反应结束后，灭酶，8 000 r/min 离心取上清液，测定酶解液的DPPH·清除率及水解度。
1.3.4 酶解工艺的响应面优化
1.3.4.1 Plackett-Burman 试验
基于单因素试验结果，以料液比、酶解温度、酶解时间、酶解pH 值、酶用量为影响因素，DPPH·清除率为评价指标，进行五因素三水平的Plackett-Burman 的筛选试验。试验因素水平见表4。
1.3.4.2 Box-Behnken 试验
基于Plackett-Burman 试验结果，选定酶解pH 值、酶解时间、酶用量3 个显著因素为影响因素，采用DPPH·清除率和水解度作为响应变量，构建二次回归方程，以拟合自变量与DPPH·清除率和水解度之间的函数关系，进行鸭肝多肽酶解工艺的优化，试验设计见表3。
表3 Box-Behnken 试验因素水平
Table 3 Factors and levels of Box-Behnken test
A 酶解pH 值5.0 6.0 7.0 B 酶解时间/h 3 4 5 C 酶用量/（U/g）3 000 4 000 5 000
1.3.4.3 Box-Behnken 试验分析
采用Design-Expert 11.1.2.0 软件对单因素试验结果回归分析，得到DPPH·清除率和水解度对酶用量、酶解pH 值、酶解时间3 个因素的回归模型，研究不同因素对鸭肝蛋白酶解工艺的影响，并绘制影响因素的响应面图及等高线图。
1.3.5 DPPH·清除能力的测定
参照文献[13]进行试验并进行适当改进。准确配制500 μg/mL 的DPPH-乙醇溶液，取1.0 mL 的酶解液和3.0 mL 的DPPH-乙醇溶液混合均匀，然后在室温下避光反应30 min，离心取其上清液，测定517 nm 下的吸光度，重复测定3 次取平均值。DPPH·清除率（X，%）计算公式如下。
式中：A1 为样品的吸光度；A2 为无水乙醇代替DPPH-乙醇溶液作为对照组测定的吸光度；A0 为蒸馏水代替多肽溶液作空白组测定的吸光度。
1.3.6 水解度的测定
采用甲醛滴定法测蛋白质水解度，参照李皖光等[14]的方法并进行适当调整。取8 mL 的酶解液，加入60 mL 的蒸馏水，确保充分混合均匀。使用0.5 mol/L的标准NaOH 溶液来调整酶解液至pH8.2，然后加入10 mL 的中性甲醛溶液。最后使用0.5 mol/L 的标准NaOH 溶液进行标定，记录在pH 值为9.2 时消耗的标准NaOH 溶液的体积V1（mL），空白组消耗体积记为V0（mL），重复测定3 次取平均值。水解度（S，%）计算公式如下。
式中：C 为NaOH 标准溶液的浓度，mol/L；V 为酶解液的总体积，mL；m 为酶解底物的质量，g；N 为酶解底物的总氮含量，g/100 g；0.014 为氮的含克当量。
1.4 数据处理
所有试验至少重复3 次，使用Origin 2022 和SPSS 22.0 软件对收集到的数据进行统计分析，并采用平均值±标准差表示。经过单因素方差分析和配对t检验的综合分析，P＜0.05 表示存在统计学上的显著差异。
2 结果与分析
2.1 鸭肝水解蛋白酶的筛选
酶解法是一种常用的多肽制备方法。由于不同蛋白酶在切割位置上存在差异，这导致酶解后的产物在理化性质和生物活性上也表现出不同[15]。本文选用8 种蛋白酶对鸭肝进行酶解，测定酶的种类对鸭肝酶解产物DPPH·清除率和水解度的影响，结果如图1 所示。
图1 蛋白酶种类对鸭肝酶解产物DPPH·清除率和水解度的影响
Fig.1 Effects of protease types on DPPH·scavenging and degree of hydrolysis of duck liver hydrolysates
小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
由图1 可知，风味蛋白酶的综合酶解能力最佳，DPPH·清除率为77.98%，水解度为12.17%。因此，选择风味蛋白酶进行后续的酶解工艺条件优化。Fu 等[16]研究表明，风味蛋白酶是内肽酶和外肽酶的混合物，与其他常见的蛋白酶相比，可实现蛋白质更高程度的水解。
2.2 酶解工艺的单因素试验结果
2.2.1 料液比对抗氧化性和水解度的影响结果
料液比对鸭肝酶解产物DPPH·清除率和水解度的影响见图2。
图2 料液比对鸭肝酶解产物DPPH·清除率和水解度的影响
Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on DPPH·scavenging and degree of hydrolysis of duck liver hydrolysates
同一指标小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
从图2 可以看出，鸭肝和PBS 缓冲液的料液比在1∶5～1∶15（g/mL）范围内，随着溶剂体积的增大，DPPH·清除率呈现出先增大后减小的趋势。当溶剂体积较小时，溶液中的分子扩散不仅慢且分布不均，所以导致酶解液的DPPH·清除率和水解度都较低，但溶剂体积较大时，酶浓度被稀释，酶分子与原料蛋白的结合也会受到影响，导致水解度呈现出下降的趋势。因此，最终选择料液比1∶10（g/mL）作为最优条件。
2.2.2 酶解温度对抗氧化性和水解度的影响结果
温度被认为是影响酶解反应的关键变量之一，过低或过高的温度都会对酶解反应产生影响，温度在一定范围内升高时，蛋白酶活力增强，反应速率加快，但温度过高会导致酶的活力受到抑制作用，反应速率减缓[17]。酶解温度对鸭肝酶解产物DPPH·清除率和水解度的影响见图3。
图3 酶解温度对鸭肝酶解产物DPPH·清除率和水解度的影响
Fig.3 Effect of enzymatic temperature on DPPH·scavenging and degree of hydrolysis of duck liver hydrolysates
同一指标小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
如图3 所示，在50 ℃时，反应体系的温度达到风味蛋白酶的最佳温度，其DPPH·清除率和水解度均达到最高，故选择50 ℃作为酶解的最适温度。
2.2.3 酶解时间对抗氧化性和水解度的影响结果
酶解时间对鸭肝酶解产物DPPH·清除率和水解度的影响见图4。
图4 酶解时间对鸭肝酶解产物DPPH·清除率和水解度的影响
Fig.4 Effect of enzymatic time on DPPH·scavenging and degree of hydrolysis of duck liver hydrolysates
同一指标小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
从图4 可知，随着酶解时间的延长，DPPH·的清除率和水解度都呈现出上升的趋势，并在4 h 后达到峰值。但当酶解时间超过4 h 后，DPPH·的清除率开始下降，而水解度则达到了一个平衡状态。这可能是因为在反应的初始阶段，底物的质量浓度相对较高，这导致蛋白酶与底物蛋白有足够的结合位点，从而暴露出更多有利于蛋白酶进行酶切的位点。随着时间的延长，具有抗氧化能力的多肽会被蛋白酶作用，分解成游离氨基酸，从而降低其抗氧化能力[18]。因此选择4 h为最佳酶解时间。
2.2.4 酶解pH 值对抗氧化性和水解度的影响结果
pH 值是影响酶促反应的因素之一，蛋白酶作为生物活性物质，只有在适当的酶解pH 值下，才能有效地断开肽键，并释放出具备抗氧化特性的小分子肽段[19]。酶解pH 值对鸭肝酶解产物DPPH·清除率和水解度的影响见图5。
图5 酶解pH 对鸭肝酶解产物DPPH·清除率和水解度的影响
Fig.5 Effect of enzymatic pH on DPPH·scavenging and degree of hydrolysis of duck liver hydrolysates
同一指标小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
如图5 所示，当pH 值为6.0 时，鸭肝酶解产物的DPPH·清除率和水解度均达到最大，随着pH 值的升高，水解效果开始下降。这是由于风味蛋白酶在弱酸性条件下的酶活力较强，催化能力强，加快反应速率，而在弱碱条件下酶活性中心的构象被影响，减慢了反应速率[20]。因此，选择pH6.0 为酶解pH 值。
2.2.5 酶用量对抗氧化性和水解度的影响结果
酶用量对鸭肝酶解产物DPPH·清除率和水解度的影响见图6。
图6 酶用量对鸭肝酶解产物DPPH·清除率和水解度的影响
Fig.6 Effect of enzyme addition on DPPH·scavenging and degree of hydrolysis of duck liver hydrolysates
同一指标小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
由图6 可知，在酶用量在2 000～4 000 U/g 范围内，随着酶用量增加，DPPH·清除率和水解度呈现出上升趋势。随着酶浓度的增加，蛋白酶与更多的底物分子结合，释放出更多的抗氧化肽，增强抗氧化活性。当酶的使用量达到4 000 U/g 时，达到峰值。随后，随着酶用量逐渐增多，DPPH·的清除效率和水解能力都开始逐渐减少。这可能是因为底物中的蛋白结合部位被逐步占据，导致了竞争性的抑制，使得中间的复合物达到了饱和状态[18，21]。或者由于当酶剂量增加到一定程度时，过度水解可能会降低蛋白酶和底物分子之间的接触概率，最终降低水解产物的抗氧化活性。因此，选择酶用量为4 000 U/g 为宜。
2.3 酶解工艺的响应面优化
2.3.1 Plackett-Burman 设计与结果
Plackett-Burman 试验主要目的是基于单因素试验高低水平，依据Plackett-Burman 试验结果分析的因素主间效应、显著水平以及实际情况，筛选出对试验结果产生影响的最佳因素[22]。鸭肝酶解工艺Plackett-Burman 试验设计与结果分析见表4 和表5。
表4 Plackett-Burman 试验设计与结果
Table 4 Design and result of Plackett-Burman test
组别B 酶解时间/h 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 酶解pH 值7.0 7.0 7.0 7.0 7.0 7.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5 5 5 3 3 3 3 5 5 3 3 5 C 酶用量/（U/g）3 000 3 000 5 000 5 000 5 000 3 000 3 000 3 000 5 000 3 000 5 000 5 000 D 料液比/（g/mL）1∶15 1∶5 1∶15 1∶5 1∶5 1∶15 1∶5 1∶5 1∶5 1∶15 1∶15 1∶15 E 酶解温度/℃40 60 40 40 60 60 40 40 60 60 40 60 DPPH·清除率/%66.016±0.055 61.992±0.020 79.856±0.152 85.346±0.328 85.851±0.100 84.090±0.093 93.532±0.055 84.645±0.001 92.170±0.043 89.690±0.162 98.787±0.057 90.080±0.095
表5 Plackett-Burman 试验DPPH·清除率方差分析
Table 5 Analysis of variance of DPPH·scavenging in Plackett-Burman test
注：*表示影响显著（P＜0.05），**表示影响极显著（P＜0.01）。
来源模型自由度A B C D E残差均方233.75 612.61 325.94 226.55 2.08 1.56 17.68 F 值13.22 34.65 18.44 12.82 0.12 0.088 P 值0.003 4 0.001 1 0.005 1 0.011 6 0.743 1 0.776 8显著性*******总差平方和1 168.74 612.61 325.94 226.55 2.08 1.56 106.07 1 274.81 5 1 1 1 1 1 6 11
由表5 可知，回归模型P＜0.01，说明该模型极显著。酶解pH 值（A）、酶解时间（B）、酶用量（C）、料液比（D）、酶解温度（E）5 个因素中，A、B 和C3 个因素影响显著，D、E 两因素影响不显著。根据F 值大小，可以判断5 个因素影响的主次顺序为酶解pH 值＞酶解时间＞酶用量＞料液比＞酶解温度。R²=0.916 8，这表明回归方程的拟合程度很高，该模型是可靠的，可以用于分析和预测。
Fang 等[23]酶解鱿鱼肌肉蛋白发现，酶解温度和酶解时间显著影响其水解产物的DPPH·清除率。Yu 等[24]指出，酶解pH 值和酶解温度会显著影响花生水解物的自由基清除活性。以上结果与本文的研究结果一致。
2.3.2 Box-Behnken 试验设计结果
鸭肝蛋白酶解工艺响应面设计与结果分析如表6所示。
表6 响应面试验设计与结果
Table 6 Design and result of response surface methodology
试验号B 酶解时间/h 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 A 酶解pH 值5.0 7.0 5.0 7.0 5.0 7.0 5.0 7.0 6.0 6.0 6.0 6.0 6.0 6.0 6.0 6.0 6.0 3 3 5 5 4 4 4 4 3 5 3 5 4 4 4 4 4 C 酶用量/（U/g）4 000 4 000 4 000 4 000 3 000 3 000 5 000 5 000 3 000 3 000 5 000 5 000 4 000 4 000 4 000 4 000 4 000 DPPH·清除率/%85.26±0.19 89.67±0.02 86.43±0.01 83.94±0.07 85.71±0.01 89.59±0.09 90.63±0.02 83.83±0.05 84.57±0.08 86.78±0.01 89.59±0.01 83.01±0.05 93.99±0.09 92.11±0.02 90.41±0.02 93.25±0.01 91.94±0.04水解度/%10.95±0.01 12.17±0.05 10.14±0.02 14.76±0.01 9.49±0.01 13.30±0.01 10.46±0.01 15.25±0.01 11.35±0.01 14.35±0.01 14.11±0.02 13.71±0.01 16.22±0.02 17.36±0.01 14.19±0.03 16.95±0.01 15.08±0.02
2.3.3 回归模型建立与方差分析
DPPH·清除率回归方程方差分析见表7。
表7 DPPH·清除率回归方程方差分析
Table 7 Analysis of variance of regression equation for DPPH·clearance
注：*表示影响显著（P＜0.05），**表示影响极显著（P＜0.01）。
来源模型自由度显著性**A B C AB AC BC A²B²C²残差失拟项纯误差总差平方和191.4 0.12 9.97 0.021 11.90 28.52 19.32 21.91 58.70 28.88 10.97 3.48 7.49 202.37 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 16均方21.27 0.12 9.97 0.021 11.90 28.52 19.32 21.91 58.70 28.88 1.57 1.16 1.87 F 值13.57 0.080 6.36 0.013 7.60 18.20 12.33 13.99 37.47 18.43 P 值0.001 2 0.785 8 0.039 7 0.911 1 0.028 2 0.003 7 0.009 8 0.007 3 0.000 5 0.003 6************0.62 0.638 4
基于表7 中响应面试验设计数据，得到DPPH·清除率（Y1）与酶解pH 值（A）、酶解时间（B）、酶用量（C）的二次多项回归方程如下。
Y1=92.34-0.12A-1.12B+0.051C-1.73AB-2.67AC-2.20BC-2.28A2-3.73B2-2.62C2。
由表7 可知，回归模型P＜0.01，说明该模型极显著；一次项中，B 因素影响显著，A、C 因素不显著，说明单因素中酶解时间对DPPH·清除率的影响显著。基于F 值可以确定影响水解度的3 个主要因素的重要性排序为酶解时间＞酶解pH 值＞酶用量；各交互项影响显著（P＜0.05）；失拟项P=0.638 4＞0.05，失拟项不显著，R²=0.945 8，说明回归方程拟合度好，该模型是可靠的，可以用于分析和预测[25]。
水解度回归方程方差分析见表8。
表8 水解度回归方程方差分析
Table 8 Analysis of variance of regression equation for hydrolysis degree
注：*表示影响显著（P＜0.05），**表示影响极显著（P＜0.01）。
来源模型自由度A B C AB显著性****AC BC A²B²C²残差失拟项纯误差总差平方和84.47 26.06 2.40 3.18 2.89 0.24 2.89 28.57 7.67 6.37 8.03 1.12 6.91 92.50 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 16均方9.39 26.06 2.40 3.18 2.89 0.24 2.89 28.57 7.67 6.37 1.15 0.37 1.73 F 值8.18 22.72 2.09 2.77 2.52 0.21 2.52 24.90 6.69 5.55 P 值0.005 6 0.002 0 0.191 5 0.140 1 0.156 5 0.661 2 0.156 5 0.001 6 0.036 1 0.050 6***0.22 0.881 3
由表8 可知，水解度（Y2）与酶解pH 值（A）、酶解时间（B）、酶用量（C）的二次多项回归方程如下。
Y2=15.96+1.81A+0.55B+0.63C+0.85AB+0.24AC-0.85BC-2.61A2-1.35B2-1.23C2。
由表8 可知，回归模型P＜0.01，说明该模型极显著；一次项中，A 因素影响显著，B、C 因素不显著，说明单因素中pH 值对水解度的影响显著。基于F 值可以确定影响水解度的3 个因素的重要性排序为酶解pH值（A）＞酶的使用量（C）＞酶解的持续时间（B）；失拟项P=0.881 3＞0.05，不显著，R²=0.913 2，说明回归方程拟合度好，该模型成立，可进行分析和预测。
2.3.4 响应面交互作用分析结果
通过使用Deign-Expert 软件进行处理，获得了以DPPH·清除率和水解度作为评价指标的酶解pH 值（A）、酶解时间（B）和酶用量（C）之间的交互作用响应面和等高线，结果见图7。
图7 酶解pH 值、酶解时间和酶用量的交互作用对鸭肝酶解产物DPPH·清除率影响的响应面和等高线
Fig.7 Response surface and contour map of the interaction of enzymatic pH，enzymatic time and enzyme addition on DPPH·scavenging of duck liver hydrolysates
由图7 可知，各因素间的等高线形状呈椭圆形，这表明酶解时间、酶解pH 值和酶用量之间存在很强的相关性，增加酶用量会提高酶解效果，而且这种提高随着酶解时间的延长而变得更加显著。同样，酶解pH值和酶用量的交互作用以及酶解时间和酶解pH 值的交互作用也对酶解效果有显著影响。因此，在酶解工艺时需要综合考虑因素之间的相互作用，以实现最佳的酶解性能。
由图8 可知，酶用量和酶解时间椭圆坡度较陡，弯曲程度较大，因素之间相关性较强，对模型具有显著影响（P＜0.05）。从图中可知，固定酶解pH 值为中心点水平，当酶解时间较短时，随着酶用量的升高，产物的水解度呈上升趋势，当酶解时间延长时，随着酶用量的增加产物的水解度先上升后下降。固定酶解时间、酶用量为中心点时也能得到相同的结论。
图8 酶解pH、酶解时间和酶用量的交互作用对鸭肝酶解产物水解度影响的响应面和等高线
Fig.8 Response surface and contour plots of the interaction of enzymatic pH，enzymatic time and enzyme addition on hydrolysis degree of duck liver hydrolysates
2.3.5 鸭肝多肽酶解工艺及验证
利用Design-Expert 11.1.2.0 软件，优化得到鸭肝多肽酶解的最佳条件：酶解pH 值6.2、酶解时间3.9 h、酶用量4 100 U/g。在此条件下，鸭肝多肽的DPPH·清除率为92.27%，水解度为16.21%，比优化前DPPH·清除率提高了14.29%，水解度提高了4.04%。
采用最优酶解条件，经过验证试验，获得的鸭肝多肽的DPPH·清除率为93.25%，水解度为15.03%，基本符合预测值，说明优化的风味蛋白酶水解鸭肝制备抗氧化肽的工艺参数准确可靠。
3 结论
本研究以DPPH·清除能力和水解度为考察指标，筛选出鸭肝蛋白酶解最佳用酶为风味蛋白酶。经过单因素和响应面优化试验，确定了鸭肝抗氧化肽的最优酶解工艺参数：料液比1∶10（g/mL）、酶解温度50 ℃、酶解pH6.2、酶解时间3.9 h、酶用量4 100 U/g。在此条件下，鸭肝的抗氧化DPPH·清除率达到了93.25%，水解度为15.03%。本项研究旨在为鸭肝的深度加工和生物活性肽的开发提供科学理论支持，但鸭肝酶解液中的抗氧化活性成分鉴定、抗氧化机制以及体内抗氧化试验仍需进一步探究。
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