近年来，全球肥胖率急剧上升。据统计，每年约有340 万成年人死于肥胖所引起的并发症[1]，肥胖症已经被世界卫生组织认定为全球最大的慢性疾病[2-3]。过度摄入高脂肪食物是导致肥胖的主要因素[4]。膳食脂肪主要由混合甘油三酯组成，被人体摄入后由胰脂肪酶水解为甘油和脂肪酸，然后被肠细胞吸收并重新合成混合甘油三酯，作为主要的能量来源储存在脂肪细胞中[5]。因此，通过抑制胰脂肪酶活性来预防或治疗肥胖已成为近年来药理学干预的核心策略[6]。奥利司他是我国唯一批准的胰脂肪酶活性抑制剂药物，虽然存在一定的减肥效果，但长期服用会引发人体一系列严重的不良反应，如胃肠道损伤、肾脏毒性反应、肝损伤、大便失禁和肠胃胀气等[7]。天然产物较化学合成药物具有副作用小和生物相容性好的特点，已成为新药开发的主要来源之一[8]。因此从天然产物中探索更安全、有效的胰脂肪酶活性抑制剂已成为治疗肥胖的重要途径。
红茶是世界上生产和消费最多的茶叶，茶多酚作为其主要的功能成分，能够降低血清甘油三酯含量并调节脂质代谢[9]。近年来红茶减肥降脂的功效受到越来越多研究者的关注[10-11]。然而对于一些天然产物的生物活性化学物质及其健康相关益处的体外研究，大多忽略了其在通过消化道时发生的物理、化学和生化变化[12]。此外，茶多酚中的茶黄素是红茶的特征性成分，其中茶黄素-3，3′-双没食子酸酯（theaflavin-3，3′-digallate，TFDG）的生物活性最强且对胰脂肪酶活性有显著的抑制作用[13-14]。但TFDG 与胰脂肪酶之间的具体作用机制研究仍相对空缺。因此，本文对红茶经体外模拟消化后总酚的生物可及性和生物活性进行探究，并通过荧光光谱试验探讨TFDG 对胰脂肪酶活性的抑制作用机理，以期为开发天然的抗肥胖药物和功能性食品提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
红茶：天健国药堂大药房旗舰店；奶油：市售；胰脂肪酶（酶活650 U/mg）、磷酸氢二钠：上海安谱实验科技股份有限公司；TFDG：天津索罗门生物科技有限公司；4-甲基伞形酮油酸酯、奥利司他、猪胆盐（生物试剂）、胃蛋白酶（酶活3 000 U/mg）：上海麦克林生化科技有限公司；氢氧化钠、盐酸、氯化钠：天津市江天化工技术有限公司；没食子酸标准品（纯度99%）、碳酸钠：上海阿拉丁生化科技有限公司；福林酚试剂（生物试剂）：天津顺鑫顺发科技有限公司。以上化学试剂除特别注明外均为分析纯。
1.2 仪器与设备
多功能酶标仪（Synergy HTX）：美国伯腾仪器有限公司；荧光分光光度计（F-7100）：日本日立公司；半微量分析天平（ABL）：艾德姆衡器有限公司；pH 计（PB-10）：德国赛多利斯股份公司；水浴锅（RE-201D）：天津科诺仪器设备有限公司；自动电位滴定仪（T50）：瑞士梅特勒-托利多公司；恒温摇床（HNY-2102C）：天津欧诺仪器股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 体外模拟消化
由于茶饮能够直接饮用，在口腔中停留的时间可以忽略不计，所以本试验没有进行口腔唾液模拟步骤。模拟胃肠消化步骤参考Kamal 等[15]的方法并稍作修改，将10 mL 红茶冲泡液[红茶与水料液比1∶10（g/mL）]加入10 mL 含有3 mg/mL 胃蛋白酶和9 mg/mL NaCl 的模拟胃液中，用盐酸调节pH 值至2.0。将上述混合液在37 ℃下摇晃孵化2 h。随后将胃消化样液与含有10 mg/mL 猪胆盐和30 mg/mL 胰脂肪酶的模拟肠液等体积混合，在37 ℃水浴锅中搅拌3 h 模拟肠道消化条件，随后置于沸水中10 min 以终止反应，静置后收集上清液。
1.3.2 酚类物质的生物可及性
总酚含量采用福林酚法[16]测定。将20 μL 的样液（未消化、胃消化、胃肠消化）与100 μL 的福林酚试剂混合3 min。然后加入80 μL 的7 mmol/L 碳酸钠溶液避光孵育2 h，于750 nm 处测定吸光度。配制0.1～0.5 mg/mL 的没食子酸标准溶液，与上述样品处理测定方法一致。绘制的没食子酸标准曲线用来计算不同样品的总酚含量[结果以没食子酸当量（gallic acid equivalent，GAE）表示]，并代入以下公式计算生物可及性。
式中：BA 为酚类物质的生物可及性，%；BF 为消化后样品的总酚含量，mg GAE/L；TC 为消化前样品的总酚含量，mg GAE/L。
1.3.3 胰脂肪酶活性抑制试验
胰脂肪酶活性抑制试验参考Qiu 等[17]的方法进行。将4-甲基伞形酮油酸酯和胰脂肪酶溶于30 mmol/L pH7.6 的磷酸氢二钠缓冲溶液中。在100 μL 的0.1 mmol/L 的4-甲基伞形酮油酸酯溶液中加入50 μL的样液和50 μL 的10 mg/mL 胰脂肪酶溶液，于室温反应10 min，在100 ℃下终止发应。于激发波长360 nm、发射波长460 nm 下测定产物的吸光度，胰脂肪酶活性抑制率计算公式如下。
式中：I 为胰脂肪酶活性抑制率，%；x 为添加样液所释放的产物的吸光度；B 为未添加样液所释放的产物的吸光度。
1.3.4 游离脂肪酸释放率的测定
脂质的体外模拟消化参考Balkrishna 等[18]的方法进行，在1.3.1 步骤基础上稍作修改。在消化体系中加入5 mL 红茶和5 mL 奶油作为试验组，将红茶换为等量的水和20 mg/mL 奥利司他溶液分别作为阴性和阳性对照组。采用自动电位滴定仪记录在2 h 内维持体系pH 值为7.0 所需的0.2 mol/L NaOH 的体积，游离脂肪酸的释放率通过下列公式计算。
式中：F 为游离脂肪酸的释放率，%；VNaOH 为中和脂肪酸消耗的NaOH 溶液的体积，L；mNaOH 为NaOH 溶液的摩尔浓度，mol/L；Wlipid 为反应初始脂质总质量，g；Mlipid 为脂质的平均分子量，g/mol（奶油为802 g/mol）。
1.3.5 TFDG 与胰脂肪酶的荧光光谱试验
在2 mL 的5 mg/mL 胰脂肪酶溶液中分别加入200 μL 的不同浓度的TFDG 溶液，于298 K 和310 K[开氏度（K）=摄氏度（℃）+273.15]下进行荧光猝灭反应。在荧光分光光度计激发波长280 nm、发射波长290～500 nm、狭缝宽度5 nm 下进行测定。通过下列Stern-Volmer 方程的计算来判断TFDG 对胰脂肪酶的猝灭类型。
式中：F 和F0 分别为加入和不加入TFDG 时胰脂肪酶的最大荧光强度；[Q]为TFDG 的浓度，mol/L；τ0 为无抑制剂下荧光分子的平均寿命（生物大分子的荧光平均寿命约为10-8 s）；Kq 为双分子碰撞过程猝灭常数，L/（mol·s）；Ksv 为动态猝灭常数，L/mol。
将所获得不同温度下的F 和F0 代入以下公式，以lg[Q]为横坐标，lg[（F0-F）/F]为纵坐标作图，计算TFDG与胰脂肪酶的结合常数（Ka）和结合位点数（n），其计算公式如下。
将上式所得数据代入以下热力学公式，进行自由能变（ΔG）、焓变（ΔH）和熵变（ΔS）分析，从而得出TFDG 与胰脂肪酶的相互作用类型。
式中：R 为气体常数，8.314 J/（mol·K）；Ka1 和Ka2 为298 K 和310 K 下的结合常数，L/mol。
在同步荧光测量中，记录0.01 mg/mL 胰脂肪酶在298 K 下添加不同浓度抑制剂的光谱。激发和发射波长之间的间隔（Δλ）设置为15 nm 和60 nm，分别监测酪氨酸和色氨酸残基的荧光强度。
1.4 数据分析
每组样品均进行3 组平行试验，使用Origin 2019和SPSS 25 对数据进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 模拟胃肠道消化对红茶总酚含量及生物可及性的影响
天然产物经提取所获得的化合物含量通常被用于估计在日常饮食中可被人体利用的量，但没有考虑到其在胃肠道消化过程中发生的变化[19]。因此，测量天然产物的生物可及性，即经生物系统消化后可被利用的营养素的量是至关重要的[20]。本研究考察了红茶经模拟胃肠道消化步骤后总酚的含量变化及生物可及性，结果如表1 所示。
表1 红茶在模拟胃肠道消化前后的总酚含量和生物可及性
Table 1 Total phenolic content and bioaccessibility of black tea before and after the simulated gastrointestinal digestion
注：同列不同字母表示差异显著，P＜0.05。
样品未消化胃消化胃肠消化总酚含量/（mg GAE/L）574.02±4.89a 345.99±2.31b 183.96±0.58c生物可及性/%60.27 32.04
由表1 可知，经胃消化后红茶中的总酚含量从（574.02±4.89）mg GAE/L 下降至（345.99±2.31）mg GAE/L，经过肠继续消化后下降至183.96±0.58 mg GAE/L，最终消化结束后总酚的生物可及性保持在32.04%。Qin 等[21]研究发现绿茶经模拟胃肠消化后总酚含量也存在明显降低的情况，与本试验结果一致。已有多项研究表明，影响酚类化合物在体外胃肠道消化过程中含量的主要因素包括各消化阶段的pH 值变化以及样品中消化酶与代谢物之间可能存在的相互作用[22-23]。所以本研究中红茶总酚含量在模拟胃肠消化过程中下降，可能是由于每个消化阶段的pH 值的变化导致了酚类物质的脱质子化、降解和部分水解，从而发生了生物转化[24]。此外，酚类化合物作为次生代谢物，通常会与蛋白质、碳水化合物等一些大分子结合形成共聚物，或者被这些大分子阻断，从而使酚类物质含量减少，降低其生物可及性[25]。
2.2 红茶经模拟胃肠道消化对胰脂肪酶活性的抑制作用
抑制胰脂肪酶活性是治疗肥胖的有效方法，本研究探究了模拟胃肠消化前后红茶对胰脂肪酶活性的抑制情况，结果如图1 所示。
图1 红茶在模拟胃肠道消化前后对胰脂肪酶活性的抑制作用
Fig.1 Inhibitory effect of black tea on pancreatic lipase activity before and after the simulated gastrointestinal digestion
不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图1 可知，在消化过程中红茶对胰脂肪酶活性的抑制作用显著增强（P＜0.05），经胃肠道完全消化结束后对胰脂肪酶活性的抑制率达到68.92%，相比于未消化和胃消化阶段的红茶分别增加了26.97% 和17.09%。消化过程使酶抑制活性逐渐增强的原因可能为以下两种：1）一些酚类化合物可能在消化过程中被分解，从而产生新的增强胰脂肪酶活性抑制作用的成分。已有研究指出消化过程中某些酚类物质的分解导致酚基较短的物质含量增加，从而增强了其生物活性[24]。2）消化过程改变了酚类化合物的组成和含量，从而改变其在胰脂肪酶活性抑制中的相互作用。已有研究发现酚类化合物在一定浓度下对胰脂肪酶活性有协同抑制作用[26]。
2.3 红茶对脂质消化的影响
饮食中脂肪的过量摄入会导致脂肪酸在肝脏和脂肪细胞中过度积累，从而引发肥胖。胃肠通道是膳食脂肪水解为游离脂肪酸和甘油分子的主要部位。本研究在体外模拟消化体系中加入高脂天然食品奶油作为高脂模型，探究了红茶对膳食脂肪分解的抑制作用，结果如图2 所示。
图2 奶油消化物中游离脂肪酸的释放率
Fig.2 Release rate of free fatty acids in cream digestae
不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图2 可知，经体外模拟胃肠消化后奶油的游离脂肪酸的释放率为41.5%，加入红茶和奥利司他溶液后的游离脂肪酸的释放率分别下降至30.12% 和12.45%。奥利司他作为治疗肥胖药物通过抑制消化体系中胰脂肪酶的活性，阻断了奶油中的甘油三酯的水解，使游离脂肪酸的释放率显著下降（P＜0.05）。红茶在消化过程中也表现出与奥利司他相同的抗肥胖机制，可通过抑制胰脂肪酶的活性来有效减少膳食脂肪的水解，从源头上控制脂肪进入血液，从而降低脂肪的消化和吸收，起到减肥降脂的作用。因此，该结果表明红茶作为一种安全无副作用的天然产物可近一步用于抗肥胖产品的开发。
2.4 TFDG 与胰脂肪酶相互作用的荧光光谱分析
2.4.1 猝灭荧光分析
为了解TFDG 与胰脂肪酶的结合特性，对胰脂肪酶在不同浓度抑制剂存在下进行荧光猝灭试验，结果如图3 所示。
图3 不同浓度TFDG 存在下胰脂肪酶的荧光光谱
Fig.3 Fluorescence spectra of pancreatic lipase in the presence of TFDG at different concentrations
曲线由a～i 分别表示TFDG 浓度为0、1、2、3、4、5、6、7、8 μmol/L。
由图3 可知，在280 nm 的激发波长下，351 nm 处出现了较强的荧光发射峰。随着TFDG 浓度的增加，胰脂肪酶的荧光强度明显下降，当抑制剂浓度增至最大8 μmol/L 时，荧光猝灭比率（1-F/F0）约为41.47%。结果表明TFDG 可以与胰脂肪酶相互作用，抑制其固有荧光。
2.4.2 猝灭机理分析
荧光猝灭类型通常由温度改变而引起的体系变化来确定，对TFDG 与胰脂肪酶的猝灭机理进行分析，结果如图4 所示。
图4 不同温度下荧光猝灭的Stern-Volmer 图
Fig.4 The Stern-Volmer plot for the fluorescence quenching at different temperatures
由图4 可知，在298 K 和310 K 下F0/F 与[Q]呈良好的线性关系，表明猝灭机制是单一的猝灭模式，即静态猝灭或动态猝灭。动态猝灭的Ksv值往往会随着温度的升高而增加，这是由于在猝灭过程中分子的扩散起到了主导作用；而静态猝灭的Ksv 值则会随着温度的升高而减小，这是由于静态猝灭产生了新的物质，稳定性起到了主导作用[27]。利用Stern-Volmer 方程计算出在298 K 和310 K 下的Ksv 值分别为8.150×104 L/mol 和4.962×104 L/mol，随着温度的升高有所下降；在298 K和310 K 下Kq 值分别为7.842×1012 L/（mol·s）和4.903×1012 L/（mol·s），均大于最大扩散碰撞猝灭速率常数[2×1010 L/（mol·s）]。这些结果表明胰脂肪酶的荧光猝灭是由于与TFDG 之间形成基态复合物，即静态猝灭。
2.4.3 结合位点和结合常数计算
对静态猝灭应用变形过的Stern-Volmer 方程，可确定蛋白质与小分子化合物发生相互作用的结合常数和结合位点的数目。以lg[（F0-F）/F]对lg[Q]作图获得如图5 所示的两种温度下的曲线，并计算相关数据，结果如表2 所示。
图5 不同温度下的lg[（F0-F）/F]-lg[Q]曲线
Fig.5 lg[（F0-F）/F]-lg[Q]curve at different temperatures
表2 不同温度下的双对数方程及相关参数
Table 2 Double logarithm equations and related parameters at different temperatures
温度/K 298 310回归方程y=0.848 3x+3.910 68 y=0.811 1x+3.724 92 R2 n 0.980 8 0.974 9 Ka/（L/mol）8.141 0×103 5.307 9×103 0.848 3 0.811 1
根据图5 的截距和斜率计算得到了结合常数Ka和结合位点数n 的值。TFDG 与胰脂肪酶的结合常数Ka 值在103 L/mol 数量级，表明二者之间具有较强的亲和力。随着温度的升高，TFDG 与胰脂肪酶结合的Ka值下降，说明其形成的复合物在较高温度下的稳定性降低[28]。由表2 可知，n≈1 表明了TFDG 在胰脂肪酶上仅有一个结合的位点。
2.4.4 热力学常数和结合力分析
通常小分子配体与大分子蛋白质之间主要存在氢键、疏水力、静电力和范德华力这4 种相互作用的非共价键[29]。通过热力学公式获得热力学参数的正负值和大小可以判断TFDG 与胰脂肪酶的作用力类型，具体数值见表3。
表3 不同温度下的热力学参数
Table 3 Thermodynamic parameters at different temperatures
温度/K 298 310 ΔH/（kJ/mol）-18.72 ΔS/[J/（mol·K）]12.04 10.09 ΔG/（kJ/mol）-22.31-22.11
由表3 可知，测定结果表明不同温度下ΔG＜0，因此胰脂肪酶与TFDG 的结合过程是自发进行的；ΔH＜0说明二者的结合为放热过程，同时ΔS＞0 表明氢键和疏水作用力是二者相互作用过程的主要驱动力[30]。
2.4.5 同步荧光分析
同步荧光可用来监测酪氨酸和色氨酸的最大发射波长的变化，已经成为研究蛋白质构象变化的有效方法。胰脂肪酶与TFDG 结合的同步荧光光谱如图6 和图7 所示。
图6 不同浓度TFDG 对酪氨酸的同步荧光
Fig.6 Synchronous fluorescence of TFDG on tyrosine at different concentrations
曲线由a～i 分别表示TFDG 浓度为0、1、2、3、4、5、6、7、8 μmol/L。
图7 不同浓度TFDG 对色氨酸的同步荧光
Fig.7 Synchronous fluorescence of TFDG on tryptophan at different concentrations
曲线由a～i 分别表示TFDG 浓度为0、1、2、3、4、5、6、7、8 μmol/L。
由图7 可知，随着TFDG 浓度的增加，胰脂肪酶的酪氨酸和色氨酸残基的荧光强度均逐渐降低，并且酪氨酸残基的荧光猝灭比率大于色氨酸残基，说明结合位点更靠近酪氨酸残基。此外，酪氨酸残基的最大发射波长由282 nm 偏移至286 nm，出现明显的红移；而色氨酸残基的最大发射波长没有明显变化。表明在结合过程中胰脂肪酶的酪氨酸残基周围极性增加，疏水性降低；而色氨酸残基的微环境没有明显变化。
3 结论
本文通过体外模拟消化的方法探究了红茶中酚类物质的生物可及性和抗肥胖特性，并通过荧光光谱法探究了红茶中TFDG 对胰脂肪酶活性的抑制机制。体外模拟消化试验表明红茶中多酚含量受胃肠道消化的影响呈下降趋势，但消化过程可能使红茶多酚的生物活性增加，因此增强了其对胰脂肪酶活性的抑制作用，并且有效降低了膳食脂肪中游离脂肪酸的释放率。荧光光谱结果表明TFDG 能够使胰脂肪酶的荧光基团静态猝灭，并且二者主要通过氢键和疏水作用形成非共价复合物。同步荧光结果显示，随着TFDG 浓度的增加，胰脂肪酶中酪氨酸残基的最大发射波长出现明显的红移，而色氨酸残基的最大发射波长没有明显的变化，由此可见多酚的加入导致胰脂肪酶的构象发生了变化。本试验结果可为进一步开发红茶作为具有减肥潜力的功能性食品以及TFDG 作为减肥药物的先导化合物提供理论参考。
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