陕西大荔冬枣果实近圆形，果肉细嫩，味道甘甜，营养丰富[1]。但由于此种冬枣皮薄并且果汁营养丰富汁多，是霉菌良好的天然培养基，故易腐烂变质[2-3]，影响其食用价值和商业价值，因此需要一种安全有效的保鲜技术，解决运输贮藏过程中的腐烂变质问题。链格孢霉菌（Alternaria species）是在冬枣贮藏后期主要的致病菌，可导致冬枣黑斑病[4]。膜醭毕赤酵母（Pichia membranaefaciens）是近年来被发现的具有生防抑菌活性的拮抗菌之一，对多种植物病原菌链格孢霉菌具有高效抑菌作用，可安全使用，具有良好的商业前景[5-6]，但与其他拮抗菌一样，膜醭毕赤酵母的生防效力受到营养条件和应用环境等因素的限制，极大妨碍了其在果蔬保鲜领域的应用。Guo 等[7]研究发现，膜醭毕赤酵母对链格孢霉菌有明显的抑制作用，在固体培养基上，浓度为108 cells/mL 的酵母细胞对链格孢霉菌菌丝生长抑制率为89.7%。
明胶是一种来源于动物骨骼、皮肤和筋腱中胶原的水解蛋白，具有生物相容性好、无毒、无害、可降解的优点，并且具有很好的成膜性[8]。文泉[9]对牛皮明胶流变特性进行分析，浓度在10%～15% 时的明胶溶液的黏度适中，在固体表面流动性和黏附量适宜，在果实表面黏附性相对较好，涂膜效果相对较佳。海藻糖是一种潜在的压力保护剂，可调节酵母对各种环境压力的反应，如外源海藻糖添加对乙醇胁迫的Wickerhamomyces anomalus 酵母细胞存活具有保护作用[10]。
由于明胶具有黏附性和生物相容性，海藻糖存在可以保护酵母细胞。因此，本研究以前期筛选保藏的一株膜醭毕赤酵母KD-316-3 为对象，添加海藻糖和生物明胶为糖基膜液，制备了一种复合保鲜液，用以增加拮抗菌应用时的果实附着性，同时保护膜醭毕赤酵母细胞对环境压力的适应性，在使用时探究其在离体条件下对链格孢霉菌的抑菌活性，初步探究复合保鲜液的抑菌机理和对陕西大荔冬枣生理品质、氧化酶系的影响，确定保鲜效果，对新型生物保鲜剂的开发和利用提供一定的借鉴和参考。
1 材料与方法
1.1 供试菌和试剂
膜醭毕赤酵母菌KD-316-3（P.membranaefaciens KD-316-3）、链格孢霉菌（Alternaria spp.）保藏于天津科技大学农产品物流保鲜与加工研究室，马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基培养，使用前活化。
葡萄糖、丙三醇、磷酸氢二钠、次氯酸钠（分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；琼脂粉（生物级别）：北京索莱宝科技有限公司：海藻糖（食品级）：德州汇洋生物科技有限公司；明胶（用于微生物学）、磷酸（分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；戊二醛、邻苯二酚（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；乙醇（分析纯）：天津市江天化工技术股份有限公司；磷酸二氢钠（分析纯）：天津市光复科技发展有限公司；三氯乙酸（分析纯）：天津市福晨化学试剂厂；2-硫代巴比妥酸（生化试剂）、考马斯亮蓝G-250：国药集团化学试剂有限公司；石英砂、过氧化氢（分析纯）：天津市赢达稀贵化学试剂厂；牛血清白蛋白（生化试剂）：上海蓝季科技发展有限公司；柠檬酸（分析纯）：上海麦克林生化科技股份有限公司；愈创木酚（分析纯）：天津市津科精细化工研究所。
1.2 仪器与设备
TGL-16M 台式高速冷冻离心机：长沙湘仪仪器有限公司；SU1510 扫描电子显微镜：日本HITACHI 公司；TU-1810 紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；FE30 电导率仪：美国梅特勒-托利多仪器有限公司；N50 TOUCH 超微量紫外分光光度计：德国Implen 公司。
1.3 方法
1.3.1 菌悬液和膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液的制备
将活化好的膜醭毕赤酵母KD-316-3 液体培养24 h，6 000 r/min 离心10 min，收集酵母菌菌泥，并以无菌水洗涤3 次，制成酵母菌悬液，调整至所需浓度待用。
配制膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液，按其中浓度为2% 的海藻糖溶液添加量为35%，明胶浓度为8%，60 ℃加热20 min，再加入丙三醇，质量分数为1.3%，最后加入酵母菌悬液调整至复合保鲜液含菌终浓度为108 CFU/mL，待用。
1.3.2 膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液对链格孢霉菌菌丝生长的影响
采用平板对峙法观察菌丝生长[11]，分别设置108 CFU/mL 酵母菌悬液，复合保鲜液和等体积无菌水对照组。十字交叉法测量并记录[12]，按下式计算第7天的拮抗效率（J，%）。
式中：R 为病原真菌单独培养的菌落半径，mm；r为对峙培养的趋向半径，mm。
1.3.3 链格孢霉菌的菌丝扫描电镜观察
采用插片法取链格孢霉菌的菌丝体进行观察[13]。将盖玻片分别置于复合保鲜液中和等体积无菌水的马铃薯葡萄糖（potato dextrose broth，PDB）液体培养基中，24 h 后取出，在光学显微镜下观察菌丝体形态，并用戊二醛固定，乙醇梯度稀释，喷金，扫描电镜观察并拍照。
1.3.4 膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液对菌丝细胞膜和细胞内容物的影响
按照刘芳等[14]、钱沈安等[15]的方法，将3 片直径为9 mm 的链格孢霉菌菌饼接种于PDB 液体培养基中，25 ℃摇床培养48 h 后，6 000 r/min 离心15 min，以无菌水冲洗3 次后收集菌丝体。
称取0.4 g 菌丝，加入复合保鲜液，设置复合保鲜液不加菌丝体和等体积无菌水的对照，以电导率仪测定菌丝细胞质泄漏[16]。采用考马斯亮蓝G-250 法测定胞内可溶性蛋白，于波长595 nm 处测定其吸光度[17]。用超微量紫外分光光度计测定上清液在OD260 下核酸含量[18]，各处理重复3 次。
1.3.5 膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液处理对枣果失重率的影响
选取成熟程度、大小均匀一致且无明显损伤的冬枣果实，在0.1%次氯酸钠溶液中表面消毒60 s 后，以自来水冲洗，在室温下风干后置于泡沫箱中，分别进行以下处理：1）均匀喷洒配制好的含菌复合保鲜液；2）喷蒸馏水为对照。泡沫箱覆盖塑料薄膜维持相对湿度在95%左右，室温条件下贮藏。每天随机取出5 个果实称量质量，计算果实失重率（S，%）。
式中：m1 为贮藏前质量，g；m2 为贮藏后质量，g。
1.3.6 膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液处理对接种枣果病斑扩展的影响
参考王笑笑等[19]的方法并加以修改。每个伤口注射复合保鲜液30 μL，等量无菌蒸馏水作为对照，风干2 h。接种后每天测定冬枣的病斑直径。每个处理设置3 个重复。
1.3.7 膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液处理对接种枣果氧化酶系及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的影响
称取1.2 g 枣果伤口周围的新鲜组织在研钵中，加入10 mL 磷酸盐缓冲液（pH7.8、50 mmol/L），研磨成匀浆后，在4 ℃10 000 r/min 下离心15 min，收集上清液，待测。
MDA 含量测定参考Xia 等[20]以硫代巴比妥酸法测定，多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性参考Yang 等[21]的方法进行测定，过氧化物酶（peroxidase，POD）活性使用愈创木酚测定法进行测定。每样测定3 次，试验重复3 次。
1.4 数据处理
用Excel 2016 进行计算3 次重复试验的平均值和标准差，数据结果用平均值±标准差表示；用SPSS Statistic 26 进行差异显著性检验，显著水平为P＜0.05；用Origin 2022 进行图形绘制。
2 结果与分析
2.1 膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液处理对链格孢霉菌菌丝生长的测定
不同处理与链格孢霉菌对峙培养效果如图1 所示。酵母菌悬液处理组和复合保鲜液处理组的抑菌拮抗效率如表1 所示。
表1 平板对峙试验抑菌结果
Table 1 Antifungal results by dual culture
注：由于拮抗效率为相对计算值，故空白组无具体数据，用“-”表示；相同小写字母表示差异不显著，P＞0.05。
病原菌拮抗效率空白组-膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液/%26.48±4.90a 链格孢霉菌膜醭毕赤酵母KD-316-3 菌悬液/%25.54±6.27a
图1 不同处理与链格孢霉菌对峙培养
Fig.1 Dual culture of Alternaria species with different treatments
a.空白组；b.酵母菌悬液处理组；c.复合保鲜液处理组。
由图1、表1 可知，酵母菌悬液处理组和复合保鲜液处理组对链格孢霉菌均有一定的拮抗效果，酵母菌悬液处理组和复合保鲜液处理组的拮抗效率分别为（25.54±6.27）%、（26.48±4.90）%，而酵母菌悬液处理组和复合保鲜液处理组的差异不显著（P＞0.05）。Zhang等[22]试验结果表明，外源海藻糖抑制酿酒酵母葡萄糖转运效率并降低细胞内葡萄糖含量，损害能量代谢并降低三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的产生，最后抑制酵母细胞生长和代谢，延迟细胞周期。海藻糖和生物明胶的加入一方面可以保护酵母细胞免受环境压力，另一方面利用其黏附性便于实际操作，故选用膜醭毕赤酵母KD-316-3 的复合保鲜液替代单一酵母菌悬液，应用于后续保鲜试验研究中。
2.2 膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液对链格孢霉菌菌丝形态的影响
利用扫描电镜观察膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液对链格孢霉菌菌丝微观形态的影响，结果如图2 所示。
图2 膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液对链格孢霉菌菌丝的作用
Fig.2 Effect of composite preservation liquid containing Pichia membranifaciens KD-316-3 on mycelium of Alternaria species
a.空白组；b.复合保鲜液处理组。
由图2 可知，空白组的菌丝平滑饱满、表面规则且具备正常的菌丝生理结构，而经过膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液处理后，菌丝呈不规则收缩，菌丝表面有明显褶皱、凹陷和干瘪现象。上述结果说明，膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液处理使链格孢霉菌菌丝形态结构发生不可逆的变形和破坏，无法维持正常的生理功能而死亡。
2.3 膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液处理后链格孢霉菌细胞膜通透性的测定
细胞膜对维持细胞的微环境和正常的代谢起着重要的作用，当细胞膜遭到破坏时，膜透性增大，导致细胞内的电解质外渗，形成电导率[23]，膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液对链格孢霉菌细胞膜通透性的影响如图3 所示。
图3 膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液对链格孢霉菌细胞膜通透性的影响
Fig.3 Effect of composite preservation liquid containing Pichia membranifaciens KD-316-3 on cell membrane permeability of Alternaria species
同一时间不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
由图3 可知，在膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液处理后的0～24 h 内，菌丝的胞外电导率呈现上升趋势，随着处理时间的延长，电导率大幅度增加，24 h 是0 h 时的2.08 倍，而加等体积无菌水处理后的菌丝胞外的电导率值也呈现上升趋势，但趋势远不如复合保鲜液处理组明显，24 h 时较0 h 上升26.00%，0～24 h内增加幅度仅为复合保鲜液处理组的24.12%。复合保鲜液空白组为不添加菌丝的对照，电导率值几乎不变，表明海藻糖基保鲜液对膜醭毕赤酵母KD-316-3 菌体的细胞膜通透性影响不大，添加膜醭毕赤酵母KD-316-3 后，经过复合保鲜液处理的链格孢霉菌内K+和Ca+释放更显著（P＜0.05）。上述结果表明膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液处理能够明显提高链格孢霉菌体内相应离子的泄露程度，进一步验证扫描电镜观察的结果，表明复合保鲜液处理破坏了病原菌体细胞膜的结构，从而造成胞内离子的外泄。
2.4 膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液处理后链格孢霉菌胞内可溶性蛋白含量的测定
可溶性蛋白是渗透调节物质，在病原菌受到胁迫的情况下，电解质外泄，同时菌丝体细胞内的可溶性蛋白也向外渗出[24]。膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液对链格孢霉菌菌丝体可溶性蛋白含量的影响如图4 所示。
图4 膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液对链格孢霉菌菌丝体可溶性蛋白含量的影响
Fig.4 Effect of composite preservation liquid containing Pichia membranifaciens KD-316-3 on soluble protein content in mycelium of Alternaria species
同一时间不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
由图4 可知，采用复合保鲜液处理的链格孢霉菌菌丝体可溶性蛋白含量随着处理时间延长呈现降低的趋势，说明复合保鲜液影响可溶性蛋白的合成或是破坏细胞膜结构，从而造成可溶性蛋白大量泄漏流失[25]。此外，当链格孢霉菌在被膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液处理后，菌丝体胞内蛋白质含量也表现出与电导率相似的时间依赖性变化趋势，即胞内蛋白质含量也随处理时间的延长而呈现先下降再上升再下降的变化趋势。可溶性蛋白含量在4 h 时下降至4.58 μg/mL，可能是因为复合保鲜液减缓链格孢霉菌蛋白质的合成速率，微生物的生命活动不断消耗培养液中的蛋白质，部分有效抑菌成分遭到破坏，难以抑制链格孢霉菌的生长及蛋白质合成；在处理4～6 h 时短暂上升后恢复，在6～24 h 再次呈下降趋势，24 h 时下降至3.46 μg/mL，可能是拮抗菌生长代谢又产生有效抑菌成分后，继续减缓链格孢霉菌蛋白质合成速率[25]。上述结果表明复合保鲜液处理明显提高了菌体内可溶性蛋白质的泄露程度，进一步验证了扫描电镜观察、菌丝体胞外电导率测定的结果，表明复合保鲜液处理破坏了菌丝体细胞膜，从而造成胞内离子和蛋白成分外泄。
2.5 膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液处理对链格孢霉菌细胞核酸泄漏的测定
复合保鲜液对链格孢霉菌菌丝体核酸泄漏量的影响见图5。
图5 膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液对链格孢霉菌菌丝体核酸泄漏量的影响
Fig.5 Effect of composite preservation liquid containing Pichia membranifaciens KD-316-3 on leakage of nucleic acid in mycelium of Alternaria species
同一时间不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
由图5 可知，膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液能够诱导链格孢霉菌菌丝体大量核酸渗漏。在0～8 h，复合保鲜液处理后，核酸含量迅速升高，是因为加入复合保鲜液对链格孢霉菌的细胞膜破坏程度加剧，细胞与外界进行物质交换的选择性丧失，导致核酸泄漏，核酸通过细胞膜渗到培养液中致使溶液中核酸含量迅速增加[26]。
2.6 膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液处理对枣果失重率的测定
枣果在贮藏过程中由于呼吸和蒸腾作用会导致水分流失。枣果在贮藏期间的失重率变化见图6。
图6 膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液对枣果失重率的影响
Fig.6 Effect of composite preservation liquid containing Pichia membranifaciens KD-316-3 on rate of weight loss of winter jujube
同一时间不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
由图6 可知，膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液处理组的失重率明显低于空白组，经过复合保鲜液处理后的冬枣失重率的升高较为缓慢。失重是水果在储藏过程中水分散失和营养物质消耗而造成的结果。在贮藏第7 天时，复合保鲜液处理组的失重率仅为（2.26±0.68）%，比空白组降低了55.95%（P＜0.05）。试验结果表明，膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液能够减缓冬枣的失重，附着在果实表面能减少与外界水分交换，有效延缓冬枣果实含水量的降低，抑制果实衰老过程中新陈代谢加快，进而阻碍水分蒸发现象的发生[27]。
2.7 膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液处理对枣果病斑直径的测定
枣果在贮藏期间MDA 含量的变化见图7。
图7 膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液对枣果病斑直径的影响
Fig.7 Effect of composite preservation liquid containing Pichia membranifaciens KD-316-3 on diameter of black spot in winter jujube
A 病斑直径；B 冬枣活体体内试验；同一时间不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
由图7 可知，采用膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液能够显著降低货架期期间冬枣黑斑病的病斑直径，在贮藏第7 天时，复合保鲜液处理组的病斑直径比空白对照组的病斑直径减小21.47%，复合保鲜液处理组病斑扩展率在货架期内一直低于空白组病斑扩展率，复合保鲜液处理组能有效抑制果实病斑的扩大，能提高冬枣果实对链格孢霉菌的抗性，对链格孢霉菌病害的控制效果显著（P＜0.05）。海藻糖基液中的外源海藻糖可以保护酵母细胞免受环境压力，能使膜醭毕赤酵母KD-316-3 更长效地发挥抑菌作用，同时，复合保鲜液作为胶状保鲜剂浸泡、涂抹后可以均匀地附着在果实添加部位的表面，更贴合果皮，起到延缓冬枣黑斑病的保鲜作用。
2.8 膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液处理对枣果MDA 含量的测定
枣果在贮藏期间MDA 含量的变化如图8 所示。
图8 膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液对枣果MDA 含量的影响
Fig.8 Effect of composite preservation liquid containing Pichia membranifaciens KD-316-3 on MDA content of winter jujube
同一时间不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
由图8 可知，在冬枣贮藏的过程中，MDA 含量呈现出逐渐上升的趋势，膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液处理组的MDA 含量显著低于空白对照组（P＜0.05）。贮藏第7 天，空白组的MDA 含量13.00 nmol/g，是复合保鲜液处理组11.19 nmol/g 的1.16 倍。研究结果表明，膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液能减轻冬枣果实细胞膜脂过氧化程度，减少果实MDA 含量，减轻细胞膜脂过氧化产生的损害，从而延缓果实衰老。
2.9 膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液处理对枣果氧化酶系的测定
PPO 酶参与果实细胞次生代谢，将酚类物质转化为对病原真菌具有较强毒性的醌类物质，从而直接杀死病原真菌[28]。膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液对枣果PPO 活性的影响如图9 所示。
图9 膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液对枣果PPO 活性的影响
Fig.9 Effect of composite preservation liquid containing Pichia membranifaciens KD-316-3 on PPO activity of winter jujube
同一时间不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
由图9 可知，空白组果实的PPO 活性在贮藏过程中呈先下降后上升的趋势，复合保鲜液处理后果实PPO 活性上升迅速，在贮藏期间活性呈现先降低后上升的趋势，随后保持较高的活性水平。在贮藏第6 天，复合保鲜液处理组果实PPO 活性是空白组果实的2.53 倍。
果实处于逆境时，会刺激活性氧（reactive oxygen species，ROS）爆发，从而使病原菌更易侵染，而POD作为消除活性氧的关键酶，可以激活宿主防御反应，分解过氧化氢，与维持活性氧平衡及果实抗性密切相关[29]。除此之外，POD 增加后还能自发耦合成单酚自由基并合成木质素聚合体，参与木质素合成，增加木质素含量，可通过加固细胞壁来提高植物抗病能力[30]。膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液对枣果POD 活性的影响如图10 所示。
图10 膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液对枣果POD 活性的影响
Fig.10 Effect of composite preservation liquid containing Pichia membranifaciens KD-316-3 on POD activity of winter jujube
同一时间相同小写字母表示差异不显著，P＞0.05。
由图10 可知，POD 活性在贮藏期均呈现逐渐增加的趋势，但复合保鲜液处理组的POD 活性与空白组差异不显著（P＞0.05），结果表明，复合保鲜液可以提高冬枣POD 的活性，但影响较小。
3 结论
采用膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液为作用于链格孢霉菌，复合保鲜液处理能有效抑制链格孢霉菌菌丝的生长，拮抗效率为（26.48±4.90）%，使菌丝形态改变，出现褶皱甚至破裂，细胞膜通透性增大，从而内容物流出，胞外电导率上升，0～24 h 内上升107.8%，胞内可溶性蛋白含量降低，出现核酸泄漏，有良好的抑菌效果；活体试验结果显示，使用膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液处理冬枣，在相对湿度95% 的室温环境下，能够有效抑制枣果实的腐烂病变，同时失水情况也有所改善，在贮藏第7 天失重率下降55.95%。复合保鲜液处理可有效保护冬枣的膜系统，降低MDA含量，同时对枣果实的氧化酶系活性也有一定影响，POD 和PPO 活性都呈现上升趋势，在贮藏第6 天，复合保鲜液处理组的果实PPO 活性是空白组的2.53 倍，枣果的抗逆性提高，使其在贮藏期间保持较好的品质，有一定的保鲜效果。该试验研究膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液对链格孢霉菌的抑菌作用和对冬枣的保鲜效果，对开发利用新型生物保鲜剂有一定的指导作用，可为进一步研究拮抗酵母及其他生防菌在果蔬及其他食品保鲜方面的应用提供参考。
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