1 环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）相关技术
1.1 常规LAMP 方法
LAMP 方法是Notomi 等[1]开发的一种新型核酸等温扩增方法，其依赖Bst 聚合酶进行自动的成环链置换及DNA 合成，通过设计4～6 条引物，识别靶基因的6～8 个区域，在60～65 ℃反应60 min 即可完成扩增。LAMP 方法反应快速、灵敏度高、特异性强、扩增效率高，在靶DNA 检测中发挥重要作用[2]。LAMP 方法不需要特殊的设备，仅需水浴或金属浴提供恒温条件即可，扩增产物的分析方法简单、快速、可视化，特别适合在基层检验机构、现场检测中应用。随着LAMP 技术的研究，除常规LAMP 技术外，研究人员结合实际需求，开发了多重LAMP 方法、反转录LAMP 方法、实时定量LAMP 方法、免疫磁珠分离-LAMP 方法，这些方法各有优点，也各有不足，几种方法的优缺点见表1。
表1 几种LAMP 方法优点和缺点比较
Table 1 Comparison about the advantages and disadvantages of several LAMP methods
LAMP 方法类型常规LAMP 方法缺点容易造成污染；分析过程中易交叉污染；只能定性结果多重LAMP 方法结果分析较为复杂，实用性不强；相对于常规LAMP 方法，成本高反转录LAMP方法相对于常规LAMP方法，成本高实时定量LAMP方法需要专门的设备免疫磁珠分离-LAMP优点简单、快速、灵敏度高、特异性好、成本低；可用于现场检测；金属浴即可完成反应简单、快速、灵敏度高、特异性好、成本低；可用于现场检测；金属浴即可完成反应；一次反应可得到多个结果以RNA 为模板，反转录生成cDNA，然后进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）；灵敏度高；能区分死菌和活菌对检测过程实时检测，可实现对目标物的定量检测检测时间短，特异性强，检测限低、灵敏度高相对于常规LAMP方法，成本高
1.2 多重LAMP 方法
多重LAMP 方法是在LAMP 扩增体系中加入两组或多组引物，对两个或多个目的基因进行核酸扩增，用以鉴定一种或多种目标菌。与多重PCR 相比，多重LAMP 报道较少，主要由于LAMP 反应所需引物数量较多，即至少4 条引物，通常还需要2 条加速引物，这样单重LAMP 就有6 条引物，而多重LAMP 的引物要数倍于此，引物之间发生非特异性扩增的可能大大增加，使得多重LAMP 体系很难建立。而且，多重LAMP方法需通过限制性内切酶酶切分析、熔解曲线分析等方法来区分哪种靶基因的扩增。Wang 等[3]将限制性内切酶酶切技术与LAMP 方法结合，针对副溶血性弧菌的toxR 基因和创伤弧菌的rpoS 基因设计两套引物，用单管反应同时检测副溶血性弧菌和创伤弧菌，扩增温度为62 ℃，19 min 即可产生阳性结果。Liu 等[4]基于扩增产物不同的熔解温度区分方法，建立了检测沙门氏菌和副溶血性弧菌的多重LAMP 方法，以两种菌的特异性基因为目的基因设计引物，65 ℃扩增60 min后，扩增产物使用熔解曲线分析，实现同一管内同时检测沙门氏菌和副溶血性弧菌。
多重LAMP 扩增产物不能像多重PCR 那样通过电泳或者测序来判别其检测体系中具体存在何种目的DNA。限制性内切酶酶切分析法、熔解曲线分析法可实现多重LAMP 扩增产物的判断，但同时也增加了工作量，使得本来简单易用的LAMP 变得繁琐，这在现场检测或临床诊断中仍需改进。多组引物之间相互干扰、竞争或错配是多重LAMP 方法关注的问题[5]。多重LAMP 反应中使用的引物数量理论上没有限制，但是引物的假扩增会限制特异性反应的建立。报道使用引物最多的是念珠菌属的多重LAMP 方法，使用了21条引物[6]。
1.3 反转录LAMP（reverse transcription LAMP，RTLAMP）方法
RT-LAMP 方法是以RNA 为研究对象，使用反转录酶将RNA 转录成为cDNA，然后以cDNA 为模板进行LAMP 扩增。RT-LAMP 主要针对RNA 病毒，Parida 等[7]基于RT-LAMP 技术建立了西尼罗病毒快速检测方法，是首次关于病毒RT-LAMP 方法的报道。目前，RT-LAMP 方法也用于猪瘟病毒、真鲷虹彩病毒、甘薯卷叶病毒等动植物病毒检测中[8-11]。近年来，RTLAMP 也用于细菌的鉴定，由于细菌中DNA 稳定，在死菌中不易降解，可以长时间存在，传统的以DNA 为检测模板进行LAMP 扩增反应会由于DNA 的存在无法区分死菌和活菌，导致假阳性结果。RNA 为单链结构不稳定，其在死菌细胞内很快被降解，以RNA 为模板进行反转录LAMP 能有效区分死菌和活菌，避免假阳性反应[12]。
1.4 实时定量LAMP（real-time LAMP）方法
实时定量LAMP 方法是常规LAMP 方法的一种替代方法。实时定量LAMP 方法可像定量PCR 实时监测DNA 扩增过程，可在设定的阈值上监测荧光变化。实时定量LAMP 探针设计及反应流程见图1[13]。
图1 实时定量LAMP 探针设计及扩增原理
Fig.1 The principle of real-time LAMP probe design and amplification
由图1 可知，在正向内引物（forward inner primer，FIP）和反向内引物（backward inner primer，BIP）间有一段5'flap 结构（即图中的F1c 区域），因其对每个靶序列都是特异性的，选择此段序列设计探针。设计引物时，FIP 引物的5'端带有荧光淬灭基团，探针连接有与F1c 区域互补的寡核苷酸序列，3'端有荧光报告基团标记。实时定量LAMP 方法在目标基因的F2c 序列区域开始，因为Fd 发光基团与Q-FIP 相连使得荧光淬灭。新链被上游F3 引物合成的链置换代替。BIP 引物与形成新合成的链的B2c 序列退火，释放淬灭基团，产生荧光信号。新合成的链在实时定量LAMP 反应中经历了指数扩增。后续的反应在FIP 引物开始，提高了Fd的释放量，形成了指数级的可检测信号。实时定量LAMP 方法的另一种方法是使用实时浊度仪检测反应体系浊度的变化，利用浊度到达阈值的时间与初始浓度的线性关系实现定量检测。
Mashooq 等[14]基于实时定量LAMP 方法，以invA基因为靶基因，建立了单管实时定量LAMP 方法用以检测沙门氏菌，20 min 即可完成反应，实现了定量检测，灵敏度比实时定量PCR 方法高10 倍。Han 等[15]使用荧光染料和浊度监测两种定量方式，建立了牡蛎样品中创伤弧菌检测的LAMP 方法，两种方法检测灵敏度相当，对纯培养物的灵敏度为1～10 CFU/反应，比PCR 方法高100 倍。进行人工污染样品检测时，不增菌时的检测限为6.4×104 CFU/g，比PCR 方法高1 000 倍。检测纯培养物和对人工污染样品的实时检测时，细胞数量与荧光循环阈值（cycle threshold，CT）或浊度阈值（turbidity threshold，Tt）均具有良好的线性关系。
实时定量LAMP 方法可实时监测反应过程，避免扩增后开盖分析，降低了交叉污染的风险。但是，扩增反应前将荧光染料加入到反应体系中，还应考虑荧光染料对反应的抑制效应。
1.5 免疫磁珠分离-LAMP 方法
LAMP 方法可以简化操作步骤，节省试剂，并节省时间和费用，但试验过程中发现对于细菌量较少的检测样本，如果不进行增菌，采用LAMP 检测可能出现假阴性结果。为保证检测结果的准确性，需要进行增菌，这样就延长了LAMP 方法的检测时间，特别是对于现场检测时适用性不强。可采取一些细菌富集技术如免疫磁珠分离技术捕获浓缩再进行LAMP 方法检测，提高LAMP 方法检测准确性。
免疫磁珠分离技术（immunomagnetic separation，IMS）是将特异性抗体偶联在磁性颗粒表面，与样本中的被检测致病微生物发生特异性结合，在外加磁场的作用下，快速分离和富集浓缩目标菌，该技术可有效收集、浓缩大量样本中的少量病原微生物，并使之与样本中的干扰物质分离，缩短微生物检测时间、减少基质影响、提高检测的灵敏度和检出率、降低假阳性率[16-18]。刘涛等[19]制备副溶血性弧菌跨膜转录调控蛋白toxR多克隆抗体，鉴定纯化后，进行磁珠包被制成免疫磁珠。利用免疫磁珠分离技术和环介导等温扩增技术联用完成对副溶血性弧菌的检测，方法特异性强，检测副溶血性弧菌的检测限为105 CFU/mL。近年来，纳米粒子因其独特的光学特性、面积体积比较大、不依赖于颗粒尺寸的特性，成为免疫磁珠研究应用的热点。Zeng等[20]将纳米颗粒捕捉技术与LAMP 技术相结合，使用纳米颗粒捕捉分离牡蛎样品中的副溶血性弧菌，0.5 h即可完成捕捉试验，比免疫磁珠方法结合效率更高、结合速度更快，而且几乎没有抑制效应，整个检测过程可在1 d 内完成。
2 LAMP 扩增产物主要的分析方法
LAMP 检测方法优点之一就是结果判断较为快速、直观、简单、不需要特殊的设备，随着研究的进行，更多快速、灵敏的结果分析方法得到了开发和应用。LAMP 扩增产物的分析方法从单一方法向复合方法、定性方法向定量方法转变，使得LAMP 方法更快速、直观和灵敏，更利于推广应用。LAMP 扩增产物分析方法的比较见表2。
表2 LAMP 扩增产物分析方法的比较
Table 2 Comparison about the analytical methods of LAMP amplification products
置紫光本、、、、本本装察本度本浊记针记针成成低低泳观，成等时，成等荧，成标探高标探高测无本本电胶置中实仪中时备等要计本要计本检乎成成实设中需设成需设成几要凝装需和外要定需测要测需监物要物要引需引需间时测0 0 1 h 0 0 20min 20min检1～2 min约约验验验验验验验性内带、实可均、实可均、实可均室、实可均、实可均、实可均、实可均携测测测测测测验测测测测测测测测可检检场室检检检检实检检检检检检检检现场室现场室现场室现场室现场室现场室现/测，程测检测测测测过测监程测测程检检检检时测检程过测检检过点点点点实检点过时检点点时终终终终可终时实终终实可也实/间接法法法法法法法法法接接接接接接接/间接接接直间间间直间直直直性异异强异强异强特特性特性特性量/定法性性性性量量性性性方定定定定定定定定定一度、沉染，，明染剂增制敏响污透解叉示扩污指制景抑胶的叉、灵影溶叉度交入抑溶长背交交点新成应且可定成染成染缺差浊气较误景重造加会反成间并才一响影造污造污观背会易中度造时匀有易易主系程增在、受淀容均容容盖体定易系扩存般开应一盖反开体对易敏污止高受成受性的要同品异门、不，不合剂较高需，可样点较、灵便高便染、防度测要示，不、特专、不备个优简污简度便敏度监需/指测染监污便要备需设高设多法法法、灵简敏时，不针时简性的测方方灵实染探作、不异门检方染可污实操高特专时磷-焦应光料反荧甲加染生料产镁生物染增或、羟前染带酸产产光素应磷合术副荧变绿反黄或EB 等条形-焦结技物式EB），扩化生淀色剂（钙后，用梯物交术理产淀产技原产沉应镁入应入有副沉增光荧、杂交反酸，有指等）反DNA 嵌（SYBR GreenI 或颜泳会电应示生扩术技杂增系胶反产与析LAMP 扩体应料链入子蓝凝性反染层双加离酚糖增光后属萘金基脂，阳琼色扩荧法剂泳法度法示电法试酶（enzyme linked LAMP附法料指胶度析吸方/浊法染子法凝法浊光层条纸疫淀光离糖时荧向免沉荧属脂实时侧联say，ELISA）金琼实immunosorbent as-，备异相设等特本器中低仪本本计、成高较要成成设针要探对需需性时0即时即验、实可验以验均、实可、实可测测测都均检检检测测测场室场检检检现现室场室现，程测过可、也测检时测、也程测检点实检过检时终可法时点实可也点实终终可/直法法法法接接接接间间间异强特性可可，也量，也性定性量定定性定定可可易，容用性作染差异制污性特针抑叉异计探有交特设增需扩对样受的，可不处，不度速乎行高明响、几进度单透影，快带品敏简的单携速样法品简快对、灵方法应要理方反需、合成标结生目物应别产识增反光扩交子发，可与杂离发根针物剂酸探产示磷性指焦ATP，激异性物特活产计电副设器表谱（LAMP-SERS）光感光曼传发拉学物强化生增电面
2.1 浊度法
当反应体系中存在目的基因时，随着LAMP 扩增反应的进行，从dNTP 中析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生焦磷酸镁沉淀副产物，反应溶液变浑浊，离心后会析出白色沉淀，可通过肉眼观察浊度或白色沉淀来判定结果[21]。浊度法判断反应结果简单、直观、快速。刘道亮等[22]以rfbE 基因和fliC 基因为靶基因，分别设计6 条引物，两基因单管同时检测，通过肉眼观察白色沉淀建立了大肠杆菌O157：H7 的LAMP 检测方法，灵敏度比实时PCR 方法高10 倍，对137 份实际检测样品进行检测，结果与行业标准符合率达到99.3%。浊度法简单、直观、快速，但可能受粒度不均匀、空间分布不均匀、焦磷酸镁沉淀重新溶解甚至样品在扩增前就有初始浊度等因素的影响，导致检测结果受到影响[23]。此外，浊度法的另一缺点是有时间依赖性且不稳定，焦磷酸镁沉淀产生的浊度仅仅在短时间内稳定，必须快速判断。
2.2 实时浊度法
肉眼观察浊度来判定反应结果时，主观性强且仅能进行终点判断，无法实时监控反应过程。实时浊度法可实现检测过程的实时监控，使用光学设备观察焦磷酸镁副产物引起的浊度变化，反应60 min 后，在波长为650 nm 处吸光度超过0.1 即可判断为阳性[24]。实时浊度仪可用于定量分析，实现LAMP 方法的定量检测，使用不同浓度的基因拷贝数与产生阳性信号时间的线性关系对基因拷贝数实现定量检测。Di 等[25]使用浊度仪实时监控LAMP 扩增过程，建立了副溶血性弧菌的LAMP 检测方法，方法的灵敏度和特异性均为100%。
虽然实时浊度方法能够自动定量检测，但是使用浊度仪进行LAMP 反应检测无法避免浊度法本身的影响，方法受到如颗粒大小、空间分布、焦磷酸镁的重新溶解、样品本身的浊度等因素的影响[23]。
2.3 荧光染料法
LAMP 方法的优点之一是肉眼观察结果，实现了可视化检测。除浊度法以外，LAMP 扩增产物还可通过加入DNA 嵌入式核酸染料（SYBR Green I 或者EB）方法来观察颜色或荧光变化，实现LAMP 扩增产物的可视化检测。取1 μL 稀释10 倍的SYBR Green I 加入到反应产物中，阳性反应变为绿色，阴性反应保持为橘色，也可在紫外灯（波长260 nm）下观察，阳性反应会有绿色荧光，阴性反应无荧光。LAMP 反应效率较高，SYBR Green 染料为嵌入式核酸染料，可与DNA 结合且亲和度较高，使用SYBR Green 染料检测的LAMP反应灵敏度非常高，可视化检测仅需1 min 即可。Ren等[26]以创伤弧菌的溶细胞素基因为靶基因，设计4 条引物，65 ℃扩增60 min，使用SYBR Green I 染料观察及琼脂糖凝胶电泳来判断结果，结果表明方法具有较高的特异性，灵敏度比传统的PCR 方法高。SYBR Green I 染料是最常用的核酸染料，SYBR Green I 荧光染料方法也是文献中研究最多的LAMP 扩增检测方法[27-31]。此外，也可使将EB 染料加入扩增产物中，在紫外下观察，阳性反应会观察到橘色荧光，阴性反应无荧光[32]。但是SYBR Green I 或EB 染料需要在扩增后检测打开反应盖，增加了交叉污染的风险，可能造成假阳性结果。
除SYBR Green I 核酸染料外，近年来研究者还开发使用如SYTO-9 染料、EB 染料、钙黄绿素、羟基萘酚蓝、Genefinder 染料等。钙黄绿素是一种金属指示剂，可与多种金属离子如Ca2+、Mg2+结合形成复合物产生强烈的荧光，钙黄绿素通常与MnCl2 一起加入反应体系中，随着LAMP 反应的进行，钙黄绿素与Mg2+结合，产生绿色荧光[33]。含有DNA 模板的反应管具有黄到绿的颜色变化，阴性反应没有颜色变化，在紫外光（波长302 nm）下，阳性反应管出现黄到绿的荧光，阴性反应无变化，示意图见图2[34]。
图2 钙黄绿素发光方法示意图
Fig.2 Schematic diagram about the principle of the detection method with calcein as a metal indicator
Xu 等[35]使用MnCl2-钙黄绿素法检测扩增产物，以毒力基因（ctxA、tcpA、hapA、mshA、pilA 和tlh）和特异性基因lolB 为靶基因，建立了霍乱弧菌的LAMP 快速检测方法。羟基萘酚蓝（hydroxy naphthol blue，HNB）也是一种金属离子指示剂，在LAMP 体系中加入HNB 作为指示剂，LAMP 反应刚开始时HNB 与Mg2+结合使得体系为紫罗兰色，随着LAMP 反应的进行，焦磷酸根离子不断析出，与Mg2+结合生成焦磷酸镁沉淀，HNB 失去Mg2+，体系颜色由紫罗兰色变为天蓝色。徐匆等[27]以hlyA 基因为靶基因，设计2 对引物，在同一体系中对单增李斯特菌的RNA 进行反转录及环介导等温扩增，使用羟基萘酚蓝（HNB）作为反转录环介导等温扩增产物的指示剂，可直接根据体系颜色变化判读结果，能够在20 h 内（包括增菌时间）检测样品是否存在单增李斯特菌的RNA，检出限为5.8×10-3 μg/mL，灵敏度是RT-PCR 方法的10 倍。相较于钙黄绿素，羟基萘酚蓝易溶于水且更为稳定，染料配制更加方便，而且成本更低[36-39]。
2.4 实时荧光LAMP
实时荧光LAMP 是利用实时荧光监测仪对LAMP扩增反应进行实时监测，在反应体系内加入核酸荧光染料，随着DNA 量在反应中不断增加，荧光信号也随之增强，实时荧光LAMP 方法具有反应快速、灵敏度高、特异性强等特点。实时荧光LAMP 方法可实时动态监测，能直观反映整个LAMP 过程的动态变化；除了加样时一次开盖外，全闭管操作，有效防止扩增产物污染导致的假阳性。基于初始拷贝数的对数值与反应时间的线性关系，可进行定量检测。实时荧光LAMP 检测方法反应体系加入的染料有SYBR Green I、SYTO-9、Midori Green。荧光监测仪可使用荧光扫描仪（ESEQuant），也可使用荧光定量PCR 仪。Ye 等[40]以hlyA基因为靶基因，加入SYBR Green I 核酸染料，用ESEQuant 扫描仪采集荧光信号，建立了单增李斯特菌的实时荧光LAMP 检测方法，试验可在30 min 内完成，特异性和灵敏度均较高。赵远洋等[41]以Midori Green为核酸染料，将制备好的LAMP 反应体系加入荧光定量PCR 仪内，65 ℃扩增60 min，建立了大肠杆菌O157：H7 的实时荧光LAMP 检测方法，将该方法用于人工污染的鸡肉样品中大肠杆菌O157：H7 的检测，方法的检测灵敏度为140 CFU/g，整个检测时间为7 h（包含增菌4 h）。
2.5 琼脂糖凝胶电泳法
琼脂糖凝胶电泳法是检测LAMP 扩增产物的最直接方法，能通过电泳观察扩增核酸的真实情况。取1 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，用EB 或者其他替代染料染色，紫外线下观察电泳结果来判断产物情况。由于LAMP 扩增产物是一系列反向重复形成的类似花椰菜结构的物质，电泳呈现的是不同片段大小组成的阶梯式条带。为确认LAMP 扩增目的基因情况，其他间接方法（如浊度法或荧光染料法等）多使用与琼脂糖凝胶电泳相结合的方法进行检测。而且，对大小不同的扩增产物进行纯化和测序也有助于区分目的基因的扩增情况[42]。但是，使用琼脂糖凝胶电泳进行检测时，打开扩增产物的过程容易形成气溶胶，造成交叉污染，导致假阳性结果。此外，电泳方法需要电泳装置、凝胶观察装置，而且配制凝胶及电泳过程占用了较多时间，导致检测时间较长。
2.6 LAMP-酶联免疫吸附（LAMP-ELISA）方法
LAMP-ELISA 检测方法是针对目标基因设计引物时，在引物（FIP 或BIP）的5'端使用地高辛进行标记，带有地高辛标记的扩增产物与设计的高特异性寡核苷酸探针杂交，再使用免疫方法进行检测。Ravan 等[43]开发了LAMP-ELISA 方法特异性检测D 血清组的沙门氏菌，并将该方法应用于人工污染的肉类样品中，检测限为103 CFU/mL，灵敏度比PCR-ELISA 方法高10 倍。Sun 等[44]将LAMP-ELISA 方法应用于犬细小病毒的检测，同时使用传统PCR 方法和LAMP 方法对犬细小病毒进行检测，PCR、PCR-ELISA、LAMP 和LAMP-ELISA 的检测限分别为100、100、0.1、0.1 TCID50/mL，LAMP-ELISA 方法检测灵敏度与常规LAMP 方法相当，高于PCR 方法。LAMP-ELISA 方法原理示意图如图3所示[44]。
图3 LAMP-ELISA 方法原理示意图
Fig.3 Schematic diagram about the principle of LAMP-ELISA coupled method
2.7 LAMP-侧向层析试纸（LAMP-LFD）方法
LAMP-LFD 方法是使用生物素对设计的引物进行标记，扩增完成后生物素标记的LAMP 产物与设计的地高辛标记的DNA 探针杂交，并与纳米金标记的抗地高辛抗体结合成为复合物，杂交产物可用生物素配体捕捉，结合在LFD 测试线上，形成免疫复合物。没有杂交的地高辛标记探针通过测试线，与山羊抗鼠免疫球蛋白结合，形成控制线。地高辛标记探针的使用增加了方法的特异性和灵敏度，降低了非特异性扩增导致的假阳性率，确保了结果的准确度。LAMP-LFD 方法与凝胶电泳方法相比，时间从35～50 min 缩短为10～15 min。方法避免使用专用的设备，不使用EB 及其他致癌物染料。Liu 等[45]以invA 基因为靶基因，设计引物，建立了快速检测沙门氏菌的LAMP-LFD 方法，对纯培养物的灵敏度为89 fg/μL，比传统PCR 方法高1 000 倍，将该方法用于人工污染的饲料样品，比PCR 方法灵敏度高。
LAMP 与LFD 技术结合建立的方法简便、易于使用，满足了现场试验的要求，但是引物标记不适当会造成假阳性结果或降低方法的灵敏度，而合适的标记引物组合可以提高检测效率、缩短扩增时间。比如，FIPBIP 双标记和三标记引物可能会引起假阳性结果，FIPLF 或者BIP-LB 双标记引物能短时间内检测致病菌[46]。Xing 等[47]使用优化的标记引物组合，选择FIPLP 标记，可以检测食品样品中的副溶血性弧菌，结果证实优化的LFD 方法更为灵敏、节约时间。DNA 探针和LAMP 产物的选择性结合对于方法的特异性非常关键，设计的DNA 探针序列应当位于FIP 和BIP 之间，长度不少于18 bp，避免非特异性结合，不得多于30 bp以免杂交过程空间位阻[48]。Wang 等[49]建立了多重LAMP-LFD 方法同时检测粪肠球菌和金黄色葡萄球菌，使用FITC 标记和地高辛标记引物用以检测和区分粪肠球菌特异性基因Ef0027 和金黄色葡萄球菌特异性基因nuc。在生物素标记和FITC/地高辛标记的引物存在时，多重LAMP 检测过程扩增了许多生物素标记和FITC/地高辛连接的多重LAMP 产物，通过生物素和链霉亲和素的反应（生物素在多重产物中，链霉亲和素在纳米金颗粒上）、免疫反应（FITC/地高辛在产物上，抗FITC/地高辛抗体在侧向层析生物传感器的测试线上）可检测LAMP 产物。方法的检测限、特异性和可行性通过纯培养和血样同时验证。整个过程，包括样品处理（30 min）、等温反应（40 min）和结果报告（2 min内），可在75 min 内完成。研究发现LAMP-LFD 方法容易受到污染，在同一地方经过几次检测后，LAMPLFD 方法有假阳性结果，去除污染降低假阳性率，对LAMP-LFD 方法是非常重要的。
2.8 LAMP-生物发光法
生物发光法是基于LAMP 扩增反应中产生的大量副产物焦磷酸根离子，聚合反应中每增加一个核苷酸碱基，就会释放出一个焦磷酸根离子。生成的焦磷酸根离子和合成的聚核苷酸碱基的量是成比例的，焦磷酸根离子在ATP 硫酸化酶的作用下，以磷酸硫酸酐为底物，转化成为ATP。产生的ATP 用于荧光素酶作用其底物荧光素发光。基于以上原理，焦磷酸根离子的动力学变化，即DNA 扩增的产物可通过实时模式检测产生的光来进行检测。在DNA 扩增过程中，随着产生的焦磷酸根离子的增加，开始光信号快速增加。当反应中的底物腺苷-5'-磷酸硫酸酐用完后，产生的光信号减少。到达峰值的时间与初始模板的浓度是呈比例相关的。LAMP 方法和实时生物发光监测技术结合（LAMP-BART 技术）可用于DNA 模板的检测。当RNA 为检测靶标时，方法即为RT-LAMP-BART 方法。这个发光方法比荧光方法成本低，更耐受基质样品的影响。LAMP-BART 方法已应用于转基因玉米、人类小病毒B18、SARS-CoV2 的检测。Wu 等[50]第一次研发了RT-LAMP-BART 方法，用以快速检测不同食品基质样品中的甲肝病毒，使用一步法RT-LAMP-BART 和两步法RT-LAMP-BART 对于不同食品中的甲肝病毒的检测均进行了研究，并与传统的PCR 方法进行了研究。RT-LAMP-BART 方法使用的仪器和数据软件比较简单，因为RT-LAMP-BART 方法依赖于光的时间与光信号的峰值，不是绝对的信号浓度。一个控温加热模块和一台相机或者CCD 相机检测光就能满足方法的需要。此外，因为等温反应，RT-LAMP-BART 可使用可携带的装置，适用于现场检测应用。Mikš-Krajnik等[51]使用单增李斯特菌（3 种菌的混合物），浓度为（1、10、100 CFU/100 cm2），接种到不锈钢和聚乙烯（polyethylene，PE）表面（盛有和不盛有冷冻的烟熏三文鱼），验证了一种基于生物发光检测的商品化的LAMP方法，并与国际标准化组织（International Organization for Standardization，ISO）标准方法进行比较。结果表明，在1、100 CFU/100 cm2 的接种浓度下，商业化的LAMP 方法与ISO 方法结果相同，灵敏度和特异性均一致。在10 CFU/100 cm2 接种浓度下，LAMP 方法的有效性稍低，可能是因为LAMP 方法使用了较为简单的增菌步骤。LAMP 扩增反应发光法检测原理示意图见图4[50]。
图4 LAMP 扩增反应发光法检测原理示意图
Fig.4 Schematic diagram about the principle of LAMPbioluminescence coupled method
2.9 表面增强拉曼光谱（LAMP-SERS）方法
SERS 是一种快速发展的新兴技术，是生物和化学分析中应用潜力较大的方法，因为其快速、几乎不需要对样品进行处理。同时，其能对样品实施非破坏性检测，而且灵敏度能到单分子水平。
Draz 等[52]基于LAMP 的DNA 扩增、拉曼活性纳米金探针、核糖核酸酶酶切和SERS 分析等，建立了LAMP-SERS 方法。探针包含连接有捕获DNA 探针（针对肠炎沙门氏菌的Sdf I 基因的20 个寡核苷酸碱基）的纳米金颗粒，捕获DNA 的寡核苷酸碱基首先在3'末端用巯基标记修饰，从巯基在的DNA 同一端用cy5 标记，以确保将纳米金颗粒定向偶联到纳米金颗粒上，最后将cy5 引入到靠近纳米金颗粒的表面，使得拉曼信号明显增加。当探针加入到目标DNA 上时，因为标记有cy5 的DNA 探针与其互补序列特异性杂交，纳米金探针和目标DNA 形成杂交复合物，在独特的拉曼光谱cy5 上使用SERS 很容易可以检测到。此外，使用S1 核糖核酸酶进行酶切可以区分目的DNA 是否存在。S1 核糖核酸酶可特异性将单链DNA（ssDNA）降解成为dNTP 混合物。在目的DNA 存在时，探针与互补序列特异性结合，形成双链DNA 结构，其中复合cy5-DNA 复合物免于核糖核酸酶的酶切，最终cy5 保持连接在纳米金颗粒的表面。目的基因不存在时，核糖核酸酶通过酶切纳米金颗粒上的DNA 寡核苷酸，将cy5 从纳米金颗粒上释放出来，导致拉曼信号明显降低。
影响LAMP-SERS 方法特性的关键因素之一是试验条件下纳米金探针的稳定性。有两个因素提高LAMP-SERS 方法的特异性：1）LAMP 引物是针对肠炎沙门氏菌特异性基因来设计；2）纳米金探针是针对目标扩增产物来专门设计的。由于LAMP 方法存在易于因为交叉污染或者携带污染造成假阳性的问题，而该方法特异性良好，没发现有交叉污染的问题。这可能是因为纳米金探针扩增后标记以及酶切的原因，使得方法能区分特异性扩增和非特异性扩增。LAMPSERS 方法的灵敏度比传统PCR 方法高100 倍。该方法可特异性检测肠炎沙门氏菌DNA，能区分与之相近的细菌或非特异性扩增污染，使得方法比常规LAMP方法更加准确。
2.10 LAMP-传感器法
传感器法有电化学传感器、光学传感器、生物传感器等，电化学方法使用较多，因为其易于控制、操作简单、反应条件温和。通过检测电压、电流、电阻和其他相关信号，可使用不同的电极，底物浓度能快速、准确通过电化学方法测定。Kampeera 等[53]结合LAMP 技术和电化学传感器（基于丝网印刷石墨烯电极），以toxR 基因为靶基因，建立了副溶血性弧菌的快速检测方法，检测限为0.3 CFU/25 g。该方法可识别25 g 海产品或加工海产品中2 CFU 的副溶血性弧菌，满足国际粮农组织/世界卫生组织（Food and Agriculture Organization/World Health Organization，FAO/WHO）的食品安全要求。Xiang 等[54]基于实时电阻监测检测原理建立了LAMP-电化学方法，用于检测副溶血性弧菌，可在1～2 h 内完成反应，检测限为10 CFU/mL，相对于传统LAMP 方法或实时PCR 方法，灵敏度为86%～97%，特异性为94%～100%。LAMP 方法实现了等温条件核酸的快速扩增，其可与罗丹明双向化学传感器结合，使得结果可视化检测，能更有效地、现场友好地检测目标物。Wachiralurpan 等[55]通过形成LAMP 反应扩增产物和纳米金DNA 探针复合物，进行比色来快速检测单增李斯特菌，整个反应过程大约1 h 即可完成，不需要复杂的仪器设备。对纯基因组DNA 和纯培养物，检测限分别为800 fg/mL 和2.82 CFU/mL，将该方法应用于200 份鸡肉样品的检测，与常规方法进行比较，该方法特异性、灵敏度和准确度分别为100%、90.20%和97.50%。
没有目标DNA 的情况下，一旦杂交加入最适浓度的盐后，纳米金DNA 探针表面离子变为中性，导致纳米颗粒迅速聚集，溶液颜色由红色变为蓝色和/或灰色，紫外吸收峰波长为550～650 nm。相反，有目标DNA 的情况下，纳米金DNA 探针与样品DNA 互补结合，形成杂交复合物，在离子力的条件下有利于纳米颗粒的分散，结果没有颜色变化，紫外吸收峰波长为520～550 nm。该技术可修改用作纳米材料辅助核酸适配体，用于适配体光学传感器。
3 展望
LAMP 技术方法简便、快速、可靠、灵敏度高、特异性好，在食源性致病菌、基因成分鉴定、寄生虫检测等领域得到了广泛的应用。LAMP 优势之一是基于多条引物的设计，方法灵敏度高、特异性好，扩增效率高。优势之二是检测速度快、扩增过程不依赖于仪器设备。一是因为扩增不需要循环升降温，其二是产物分析实现可视化、不再依赖于电泳等方法。在扩增时间不变的情况下，实现检测时间缩短，就必须在产物分析步骤深入研究，一方面开发灵敏度高、指示性强的荧光染料，既不抑制扩增反应，又可快速准确地判断结果；另一方面，将LAMP 技术与其他分析技术相结合，如LFD检测方法、生物传感器技术，从化学领域选择适当的检测手段，寻找扩增产物和电信号、光信号、化学信号响应的关系，利用信号杂交探针类敏感性强的物质，提高产物分析的灵敏度。
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