真菌毒素是指丝状真菌产生的低分子量有毒次级代谢产物，误食受真菌毒素污染的食物对人和动物均会造成各种不利影响[1]。一些农产品及其制品，如谷物、玉米、大豆、花生、葡萄酒、果汁、饲料等，在其生长或生产过程中极易受到真菌毒素污染[2-3]。截至目前，已发现多达400 多种的真菌毒素。常见的真菌毒素有黄曲霉毒素（aflatoxins，AFs）、赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、棒曲霉素（patulin，PAT）、伏马毒素B1（fumonisin B1，FB1）以及脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）和T-2毒素（T-2）等[4]。这些毒素具有强烈的致畸性、致癌性、致突变性、神经毒性和肾毒性[5-6]。因此，多数国家都对其设定了严格的最大残留限量[7-8]。GB 2761—2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》[9]中规定，谷物、花生、油脂及其制品中的黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）含量分别不得超过20、5、60 μg/kg。所以，对真菌毒素污染水平的即时监控，是保障人身健康和降低由毒素污染而造成的经济损失的重要手段。
目前，以大型仪器为主的检测方法主要有气相色谱-串联质谱（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）法、高效液相色谱（high-performance liquid chromatographic，HPLC）法、液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法等[10-12]，这些方法具有准确性高、灵敏度高、多成分同时检测的优点，因此在实验室检测中被广泛应用。然而，这些方法缺点也尤为显著，例如步骤繁琐、检测周期长、成本高、对操作人员的专业水平要求高。另一方面，以快速检测为代表的酶联免疫吸附法[13]、侧流免疫层析法[14]和生物传感器[15]也已被应用于真菌毒素检测，这些检测方法在兼具灵敏性和准确性的同时，还因耗时短、价格低而逐渐成为了主角。然而，这些方法同样大都依赖实验室或主要实现定性检测，尤其在资源受限的环境下，不适合作为现场即时检测方法。因此，寻求简单、灵敏、快速、低成本且能实现现场检测真菌毒素的方法具有重要的应用意义。
现场即时检测（point-of-care testing，POCT）是利用便携式分析仪器及配套试剂快速得到检测结果的一种检测方式[16]，具有如下优点：1）不受检测时间、检测地点和专业技术人员的限制，可随时随地对目标物进行检测；2）设备便携小巧、操作简单、成本低、对用户友好，易于在资源匮乏的地区推广；3）无需样品前处理，可快速得到准确的检测结果等优点。因此。POCT技术的发展和普及在临床诊断[17]、食品安全检查[18]、环境监测[19]等方面具有重要意义。本文综述近年来基于POCT 技术开发的免疫分析、分子生物、微流控、生物传感器在检测真菌毒素中的应用，描述每种方法的原理、优缺点及其应用现状，讨论快速检测方法存在的问题和未来发展，为真菌毒素快速检测技术的发展提供参考，对各学科研究和食品安全监管具有一定意义。
POCT 在真菌毒素检测中的应用进展示意图见图1。
图1 POCT 在真菌毒素检测中的应用进展
Fig.1 Application of point-of-care testing（POCT）in mycotoxins detection
1 POCT 技术在真菌毒素检测中的应用
1.1 基于免疫学方法的POCT
免疫学检测技术检测真菌毒素原理是基于抗体-抗原相互作用，即特异性抗体（多克隆抗体或单克隆抗体）与其特异性抗原的酶联免疫吸附，实现对靶标定性和定量分析，其颜色的变化作为一种简单、可靠的POCT 直接读出分析信号在检测领域应用广泛[20]。
1.1.1 酶联免疫吸附技术（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）
可溶性抗原和抗体特异性结合后吸附于包被有抗原或抗体的固相载体表面，之后添加酶标的抗体或抗原，从而真菌毒素与酶标抗体或抗原产生竞争形成复合物，随后加入底物由于催化作用发生显色反应，进而根据显色深浅实现对真菌毒素的定性或定量检测[21]。
肖雪梅等[22]将样品通过处理后获得上清液，利用被辣根过氧化物酶标记或固定在反应孔中的AFB1 与样品或标准品中的AFB1 竞争性结合特异性抗体。在洗涤后加入相应的显色剂显色，经无机酸终止反应，实现对AFB1 的检测，回收率和精密度都比较高的超微量分析技术，结果准确，可满足标准的要求和客户的需求。但该法仍存不足，受环境因素影响显著，试验结果重复性差，对试剂的选择性较高，化学结构相似的物质无法辨别，存在假阳性。而核酸适配体具有长期储存、易于制备以及生产成本低等的优势；单链结合蛋白含有大分子四聚体能与核酸适配体具有高度的亲和力，进而取代霉菌毒素-蛋白质偶联物结合降低霉菌毒素的危害，因此基于这两种纳米材料，Xing 等[23]开发了一种绿色ELISA 方法用于检测AFB1、OTA 和ZEN，检测限分别为112、319 ng/L 和377 ng/L，此方法不需要繁琐的抗体制备过程以及霉菌毒素与蛋白质偶联，缩短了检测时间、简化了操作步骤并实现多种霉菌毒素同时检测，通过更换适配体即可扩展到其他生物危害物的检测。
1.1.2 荧光免疫分析技术（fluoroimmune assay，FIA）
将荧光材料标记抗原或抗体，根据特异性反应形成荧光复合物的荧光信号强弱实现真菌毒素的痕量检测[24]，主要分为荧光偏振免疫分析法、荧光能量共振转移技术、量子点荧光免疫分析等。
Zhang 等[25]开发了一种双波长同源高通量荧光偏振免疫测定法，用于同时检测黄曲霉毒素（AF）和玉米赤霉烯酮家族（ZENs），检测限分别为4.98 μg/kg 和11.03 μg/kg。该方法在一次测试中获得更多的信息，并且从双波长荧光信号的设计中获得更少的测定时间，通过改变靶标可实现其他污染物的检测。Zekavati等[26]基于标记有荧光团Rho123 荧光团（受体）和标记有AFB1 抗体的量子点（供体）产生荧光共振能量转移效应产生的荧光信号强弱实现对AFB1 的特异性检测，检测限为2×10-11 mol/L。由于多种毒素会引发协同作用和加性毒理学效应而增加对人类健康的风险，因此开发现场检测多种目标毒素的即时检测方法意义深远。Li 等[27]用具有红色荧光的量子点微珠标记AFB1、ZEN、DON 抗体，当有目标物时，单克隆抗体与AFB1、ZEN 和DON 发生特异性反应，使得荧光显著降低，荧光信号强度与分析物含量成负相关，并可在15 min 内实现分析物的定量分析，检测限分别为10、80、500 pg/mL。但该方法的局限性在于抗体与其类似物之间的交叉反应，可能会导致高于真菌毒素的实际含量。
1.1.3 胶体金免疫层析技术（colloidal gold immunochromatography assay，GICA）
以胶体金标记的抗原或抗体免疫竞争，通过在膜上进行层析和毛细管作用，使得真菌毒素与试纸特异性结合的免疫复合物截留，逐渐产生红色条状现象，显色深浅与真菌毒素的含量成正比。
Hou 等[28]采用胶体金免疫层析法实现一步法快速检测FB1、DON、ZEN，检测限分别为60、12.5、6 ng/mL，并通过液相色谱-质谱进行了验证，试纸的结果与液相色谱-质谱的结果一致，验证了该试纸的可行性。该方法具有操作及设备简单、体积小、易携带、即时可测、筛选量大等优势，但由于胶体金稳定性较差、受温度影响大、无法长时间保存、颜色亮度较浅等问题，导致其存在检测灵敏度低、定量困难、结果不准确等缺点。为进一步提高检测灵敏度，Jiang 等[29]基于适配体的胶体金免疫层析试纸，检测原理为T 线上的探针和胶体金-适配体偶联物的DON 之间的竞争性相互作用，随着呕吐毒素浓度的增加，T 线的红色减弱，T 线与C 线吸光度之比与DON 浓度成反比。通过分子对接方法缩短T线上的互补链，提高了条带的灵敏度和准确性，同时降低了条带生产成本。该试纸有望被开发为一种在现场检测和筛选样品中DON 的有效方法，并为开发基于适配体的侧流试纸条的其他靶标奠定基础。
1.2 基于分子生物学方法的POCT
分子生物学检测技术是基于核酸通过检测特定的靶向病原体DNA 或RNA 进行检测，进而通过将靶标序列与互补探针或引物杂交来实现的[30]。
1.2.1 变温扩增技术
变温扩增技术是一种基于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术的方法。常规PCR 一次只能检测一种真菌毒素，但食品中存在多种毒素，因此在常规PCR 的基础上衍生出几十种不同类型的PCR方法，主要包括多重聚合酶链反应（multiple polymerase chain reaction，mPCR）、实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，rqPCR）。
mPCR 基于传统PCR，即在同一PCR 反应系统中加入多对特异性引物和模板（引物与相应模板特异结合），以扩增具有不同序列的多个DNA 片段。在同一反应体系中扩增多个DNA 片段，可同时检测多种真菌毒素，减少试验操作次数，缩短检测时间，节省试剂。但在同一系统中扩增多对引物，每对引物相互影响，因此mPCR 实际操作中的扩增效果和扩增片段的实际数量有待进一步探究。rqPCR 通过将荧光标记的探针或荧光物质添加到PCR 系统中来运行，并通过仪器实时监测整个PCR 扩增过程中荧光信号的积累。最后，通过标准曲线对未知浓度的样品进行定量分析方法。由于rqPCR 技术的核酸扩增是在封闭系统中完成的，扩增后不需要电泳分析，不仅减少了样品污染的机会，而且避免了污染引起的假阳性结果，也缩短了检测时间。然而，rqPCR 的试验成本高、所需设备昂贵，这也要求操作人员具有高水平的专业技术。Guo 等[31]基于mPCR 和rqPCR 方法用于检测11 种霉菌毒素并同时检测真菌毒素代谢途径基因，该多相方法灵敏、快速、准确，为贮藏玉米籽粒中的产霉菌和霉菌毒素提供新的检测手段。
1.2.2 恒温放大技术
目前应用于真菌毒素的恒温扩增技术主要包括环介导的等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、重组酶介导的核酸扩增（recombinase aided amplification，RPA）和核酸序列依赖性扩增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）。LAMP 是一种将靶标序列在恒温下（60～65 ℃）通过两组或3 组引物使得核酸扩增的技术，通常采用4 种不同引物来扩增真菌毒素基因上的6 个不同的区域，进而提高检测特异性，另一对“环状引物”能进一步加速反应，缩短检测时间。Wigmann 等[32]设计了一套LAMP 引物，用于产生伏马菌素的镰刀菌属的基因特异性测定，检测限低至40 μg/L，该试验方法操作简单、选择性好、可视化、仅1 h 内获得结果，可应用于食品和饲料行业的研究和常规实验室检测真菌毒素。LAMP 技术具有很高的实用价值和检测效率，但它也有明显的缺点，例如添加环引物后出现假阳性结果，因此仍需在引物的设计上进一步研究；RAA 技术使用重组酶、单链结合蛋白和DNA 聚合酶进行核酸扩增的技术，在核酸扩增过程中不需要温度变化，能有效缩短检测时间。Liu 等[33]开发了基于RPA 的现场检测方法用于灵敏快速检测黄曲霉毒素，并开发了一种新型快速提取DNA 的方法用于视觉检测，检测测定可分别在环境温度[AT，（1±36）℃]和体温[BT，（1±20）℃]下30 min内完成。该试验方法成本更低、操作更简便，适用于籽粒中的黄曲霉污染进行现场检测。同时该试验方法可以用一些便携式设备进行，如注射器、防水砂纸和过滤器，或者与其他核酸扩增技术相结合，用于检测食品中的其他真菌毒素，对新的RAA 技术在其他应用领域具有巨大潜力。
1.3 基于微流控的POCT
微流控检测技术以其便携性、小型化、自动化、多通道样品测试、最大限度地减少危险材料处理和节省成本的优势，广泛应用于POCT 中。样品的制备、反应、分离和检测，都集成到微流控芯片中。与传统方法相比，微流控的最大优势是创造了一个受控的微环境，可以精确地驱动和控制微通道中的微流体流动，从而提高检测灵敏度。
Feng 等[34]构建了基于ELISA 的折纸微流控纸基分析设备，将两种霉菌毒素抗体共价固定在壳聚糖-戊二醛修饰的样品储液槽上，之后将样品提取物和显色底物添加至槽内，2 min 内实现ZEN、DON 和T-2 毒素的比色检测，肉眼检测限均为1 μg/mL，该方法简单、快速、灵敏且经济高效，在测定动物饲料材料中的霉菌毒素方面具有潜力，可用于初步筛选动物饲料材料中的不同霉菌毒素。为提高检测灵敏度，Xiang 等[35]开发了一种基于双模式信号的聚二甲基硅氧烷重力驱动的环状微流控芯片，量子点偶联的链霉亲和素用作参考信号，以减少系统在并联操作、环境条件和激发强度下的波动，基于抗原修饰聚苯乙烯微球具有提高免疫应答率的潜力，有助于根据检测要求灵活调整免疫微球的类型和数量。同时重力驱动的芯片通过简单地操纵与水平面的倾斜角度，可以在几分钟内实现AFB1 的超灵敏高通量定量检测。该芯片具有优异稳定性、易操作性、可回收性、高灵敏度和灵活的结构设计等优点，在资源有限的环境中具有开发实时多重检测技术的潜力。
1.4 基于生物传感器的POCT
生物传感器检测技术是由生物传感器和转换器组成的分析设备，当靶标与特异性识别原件（纳米材料、抗原、酶、适配体等）发生反应时，将反应过程转换为可监测易读取的信号[36]。生物传感器检测结果快速且易读取的特性已成为POCT 领域最为重要检测手段之一。根据转换的信号不同，生物传感器可分为电化学生物传感器、荧光生物传感器、比色生物传感器和表面增强拉曼散射生物传感器等。
1.4.1 电化学生物传感器
电化学生物传感器使用电极作为信号转换器，目标分析物在电极界面上进行电化学反应，导致传感器表面的电流、电位、阻抗或电导率发生变化。Jafari等[37]基于智能手机的磁免疫传感器，该传感器在炭黑修饰电极上用于按需检测谷物中的AFB1。其检测原理为样品中的AFB1 与磁珠上的AFB1-抗体竞争形成复合物，并与一定数量的抗体结合。分离磁珠后，辣根过氧化酶（HRP）抗体与磁珠上的AFB1-抗体结合，随后使用电极下方的外部磁铁将磁珠固定在电极上。此时HRP 与底物反应产生电流信号，信号强度与AFB1浓度成反比，对于缓冲的分析物溶液和玉米提取物样品，该检测限分别为13、24 pg/mL。基于此原理，进一步设计了小型恒电位仪和定制的智能手机应用程序，结果可通过红绿灯格式可视化，红色表示受污染的样品，绿色表示未受污染的样品，最大程度地减少了对用户培训和繁琐数据分析的需求，在POCT 检测真菌毒素上具有显著优势。为进一步提高传感设备检测目标物的灵敏性，Wang 等[38]设计的一种核酸外切酶III 介导的信号放大的电化学传感器用于检测DON，在其中采用金颗粒修饰的铈金属有机框架（CeMOF@Au）作为底物材料不仅增强了传感平台的导电性并为DNA 提供了更多的活性位点，从而获得了广泛的检测限；磁选技术应用于高效分离、富集和减少基质内干扰；磁珠上的适配体是DON 的生物识别元件。在DON 存在下，由于适配体与DON 特异性结合此时由互补链与适配体形成的双链断裂，互补链通过外部磁铁与磁珠分离，在核酸外切酶III 辅助下，实现了互补链的回收和电信号的有效放大，进而实现对DON 高灵敏性检测，线性范围为1×10-8～5×10-4 mg/mL，检测限为1.79×10-9 mg/mL，因此所设计的适配体传感器有望成为未来现场检测DON 的方法。
1.4.2 荧光生物传感器
荧光生物传感器是由利用待检测物经外加频率的紫外线照射后，激发出能够反映其特性的荧光信号，从而实现对待检测物的定量分析，已广泛应用于真菌毒素的检测中[39]。
Luo 等[40]开发了一种双信号（荧光和质量）读出的荧光传感器检测AFB1。AFB1 的适配体修饰在铂纳米颗粒（PtNPs）上，在磁珠上固定互补链，两条链杂交形成稳定的双链结构（成为复合探针），在没有AFB1 的情况下，复合探针保持完整，而在AFB1 存在的情况下，适配体由于其较高的亲和力特异性地与AFB1 结合，导致复合探针解离，随后将PtNPs 释放到上清中。压敏材料发生荧光猝灭，在紫外照射下可以目测到。磁分离后，PtNPs 由于催化作用促进H2O2 分解生成O2，设备内外压差产生的水被排出并收集在一个小烧杯中，然后用电子天平测量收集的水。由于适配体链上附着PtNPs 的数量与收集水的质量和视觉荧光强度的变化直接相关，因此可以通过评估收集水的质量和相应的视觉荧光强度变化来识别AFB1，该装置能够在1.5～32 μg/mL 的浓度范围内准确检测AFB1，检测限为0.47 μg/mL。此方法开创了在POCT 中使用压敏材料作为视觉信号的先河，并通过解决单信号读出方法的局限，满足了直观性、灵敏度、定量分析和可重用性的要求。Hu 等[41]采用量子点纳米珠实现在POCT 平台上双重检测霉菌毒素，该传感器基于特异性抗原-抗体识别间接竞争性免疫层析检测，当有AFB1 和ZEN 时，纳米珠荧光显著增强。为定量检测，该团队还设计了基于智能手机的读数，该设备具有实时分析速度快、体积小、成本低、使用方便等优点，该生物传感平台可广泛应用于临床医疗保健和食品安全应用。
1.4.3 比色生物传感器
比色生物传感技术是基于将待检测物质与识别元件的响应信号转化为颜色信号，通过肉眼和简单的仪器设备比较或测量有色物质颜色深浅来测定目标物含量的分析方法。Zhang 等[42]设计了一种无标签比色设备，该设备集成了3D 纸质分析设备和智能手机作为手持读数，可快速灵敏地检测OTA。其检测原理为当有OTA 后，适配体与互补链形成的双链体通过竞争性置换反应解离，随着适配体结构从线圈转变为G4 结构。G4 序列通过纤维素纸向下流入第二层，这在氯化血红素存在下触发了大量G4/氯化血红素DNA 酶单元的自组装。通过利用具有优异过氧化物酶活性的纳米酶，在H2O2 存在下产生蓝色氧化产物，导致比色检测区出现明显的颜色变化，此时比色信号强度与OTA浓度呈正相关，对OTA 的检测范围为0.1～500 ng/mL，检测限为41.9 pg/mL。该装置可以通过简单的肉眼快速区分阳性和阴性样品，而不需要额外的操作，还可以通过智能手机读数实现OTA 的定量检测。该试验方法具有便携、简单、低成本和易操作等优点，在POCT真菌毒素中具有应用前景。
1.4.4 表面增强拉曼散射生物传感器
表面增强拉曼散射生物传感器是基于贵金属纳米结构之间的纳米间隙产生电场增强，当拉曼活性分子在纳米间隙中被修饰时，拉曼信号在激光照射下会被放大，进而实现对真菌毒素的检测[43-44]。Yin 等[45]构建了基于表面增强拉曼散射（SERS）的竞争性免疫传感器，用于高灵敏检测玉米中的ZEN。该传感器选择具有大拉曼散射截面特性的4-巯基苯甲酸（4-MBA）作为SERS 探针分子，核壳结构负载两层4-MBA 分子（AuMBA@AgMBANPs）为SERS 标签。将ZEN 抗原与外部4-MBA 偶联以形成信号探针，ZEN 单克隆抗体标记在AuNSs 表面以形成捕获探针，当有ZEN 时，与捕获探针（AuNS-mAb）竞争性结合，金纳米星和AuMBA@AgMBANPs 可以产生强大的电磁场，从而显著放大拉曼信号，检测限为0.15 ng/mL。基于该原理，通过侧流免疫层析试纸条进一步验证拉曼信号探针的成功制备，进一步扩宽POCT 在真菌毒素中的应用。
2 结论与展望
基于免疫分析、分子生物学、微流控和生物传感的POCT 检测技术的开发，对真菌毒素的快速、低成本、高灵敏度和高度特异性的检测具有重要推动作用。然而，这些技术在实际应用中仍面临诸多挑战：1）免疫分析过程中含有竞争性靶标导致出现交叉反应，使得检测食品原料中的真菌毒素时极有可能出现假阳性结果，灵敏度不高；2）分子生物学检测技术目前并不适用于大批量检测，且存在样品前处理时间长和由于靶基因同源序列的非特异性结合而影响检测准确性的缺点；3）微流控检测芯片制作较为复杂、重复性较差，在走向市场应用上仍需进一步研究；4）大部分的生物传感器中用于识别靶标的识别元件合成复杂且成本高，也会限制其在实际中的应用。
随着这些问题的解决和完善，POCT 技术将会在食品安全领域具有更广阔的应用前景，在智能设备和互联网大数据的支撑下，为食品安全提供强有力的保障。
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