膳食纤维（dietary fiber，DF）是一类不易被人体内源酶所消化吸收的功能性物质[1]。研究表明，DF 是保障人体健康的一类重要营养素，因此将DF 应用在食品开发中越来越受到关注。DF 包括可溶性膳食纤维与不溶性膳食纤维，其中不溶性膳食纤维（insoluble dietary fiber，IDF）指那些在水中不溶解、不形成胶状物质的纤维成分。这类纤维主要存在于全麦食品、谷皮、坚果、蔬菜等食物中[2]，可以通过降低能量密度、改善肠道蠕动、活化巨噬细胞免疫应答等方式来调节人体的代谢机能，对于肥胖、肠道疾病、心血管疾病等具有预防的作用[3-5]。另外，在食品加工过程中，可以通过添加IDF 来改善食品的加工性能、感官及稳定性[6]，并已在保健品、肉制品、面制品等生产加工中被广泛应用[7]。为了进一步拓展优质膳食纤维补充渠道，更好地满足大众对健康食品的需求，通过各种手段对IDF的功能特性加以改善，已得到相关领域研究重点关注[8]。
莴苣因其富含维生素、半纤维素、木质素、氨基酸、矿物质等而具有很高的营养价值，有研究证实[9]，其含有的谷甾醇、黄酮及黄酮苷类、三萜类以及倍半萜类等成分具有保肝、抗炎、抗菌、抗脑缺血以及抗氧化等积极的作用[10-11]。然而，国内外有关从莴苣叶中提取不溶性膳食纤维方面的研究鲜见报道。为了更好地开发和利用莴苣资源，本文以莴苣叶为原材料，探讨碱提法[12]提取IDF 的工艺条件，以期为莴苣的高效利用提供技术参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
莴苣叶（青皮莴苣，Lactuca sativa var.angustata Irish ex Bremer）：市售；乙醇（95%，分析纯）：山东百化化工有限公司；氢氧化钠（分析纯）：济南弘创化学品有限公司；盐酸（分析纯）：明晟化工有限公司；花生油：九三粮油工业集团有限公司。
1.2 仪器与设备
CP214 电子天平：奥豪斯仪器有限公司；DHG-9070A 恒温鼓风干燥箱：上海精宏试验设备有限公司；HWS-26 恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；XFB 粉碎机：吉首市中诚制药机械厂；IS50 型傅里叶变换红外光谱仪：美国Nicolet 公司；Merlin Compact 扫描电子显微镜：德国蔡司股份有限公司；D8 型X 射线衍射仪：德国Bruker 公司；Q50 型热重差热综合分析仪：美国TA 仪器沃特世科技（上海）有限公司。
1.3 莴苣叶中不溶性膳食纤维的提取
1.3.1 莴苣叶的脱脂处理
参照谢建华等[13]的方法并做出适当改进。将新鲜莴苣叶用蒸馏水洗净，沥干后于75 ℃烘干，粉碎过60 目筛，经过95%乙醇脱脂2 h 后，抽滤洗涤，在80 ℃下烘干研磨后得到可通过60 目筛的固体粉末。
1.3.2 碱法提取IDF
准确称取1.000 0 g（W）脱脂后的莴苣叶粉与NaOH混合，水浴反应后抽滤洗涤至中性，将固体于75 ℃烘干，得到产品（质量记为WIDF）。IDF 得率（η，%）的计算公式如下。
1.3.3 单因素试验设计
根据李永平等[14]的研究结果选定IDF 的提取因素并对具体提取条件进行修改，分别精密称取过60 目筛的莴苣叶粉末0.500 g，固定提取温度为45 ℃、提取时间为30 min、液料比为30∶1（mL/g），考察NaOH 浓度（3%、4%、5%、6%、7%）对莴苣叶中IDF 得率的影响；固定提取温度为45 ℃、提取时间为30 min、NaOH 浓度为6%，考察液料比[25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、50∶1、60∶1（mL/g）]对莴苣叶中IDF 得率的影响；固定提取温度为45 ℃、NaOH 浓度为6%、液料比为50∶1（mL/g），考察提取时间（15、30、45、60、75、90 min）对莴苣叶中IDF 得率的影响；固定提取时间为30 min、NaOH 浓度为6%、液料比为50∶1（mL/g），考察提取温度（30、45、60、75 ℃）对莴苣叶中IDF 得率的影响。
以NaOH 浓度、液料比、提取时间和提取温度为因素，以IDF 的得率为响应值，进行四因素三水平的响应面试验设计，因素与水平见表1。
表1 响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface test
水平-1 A NaOH 浓度/%0 1 5 6 7 B 液料比/（mL/g）40∶1 50∶1 60∶1 C 提取时间/min 15 30 45 D 提取温度/℃45 60 75
1.4 莴苣叶中IDF 的表征
参照邓叶俊等[15]的方法，对IDF 进行表征分析，采用傅里叶变换红外光谱仪（Fourier transform infrared spectrometer，FTIR）对样品有机官能团进行分析，采用扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）对样品进行形貌观察，采用X 射线衍射仪（X-ray diffraction，XRD）进行样品的物相分析，采用热重差热综合分析仪（thermogravimetric differential thermal comprehensive analysis，TG/DTA）进行样品热稳定性分析。
1.5 莴苣叶中IDF 的理化性质测定
1.5.1 持水力
参照潘宇等[16]的方法并进行适当修改。准确称取0.300 0 g 记为M0（g）的IDF 粉末于离心管中，加入5 mL蒸馏水，充分振荡，在37 ℃水浴中搅拌30 min 后，4 000 r/min 离心15 min，称取沉淀物的质量为M1（g），按照下列公式计算IDF 的持水力（W1，%）。
1.5.2 持油力
参照郝晓华等[17]的方法，准确称取0.500 0 g 记为M0（g）的IDF 粉末于离心管中，加入5 g 花生油，充分振荡，在37 ℃水浴中搅拌30 min 后，4 000 r/min 离心15 min，称取沉淀物的质量为M2（g），按照下列公式计算IDF 的持油力（W2，%）。
1.5.3 溶胀度
参照鲜诗敏等[18]的方法，准确称取1.000 0 g 记为M0（g）的IDF 粉末于50 mL 量筒中，加入纯净水30 mL，充分混合后，记录初始刻度V0（mL）。在4 ℃下放置12 h，记录IDF 吸水体积膨胀后对应的刻度为V1（mL）。按照下列公式计算IDF 的溶胀度（W3，%）。
1.6 数据处理
每组做3 次平行试验，结果以平均值±标准差表示。采用软件SPSS 20.0 对单因素进行Tukey 显著性检验，软件Origin 2019 作折线图，软件Design-Expert 10 进行响应面设计与方差分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
NaOH 浓度、液料比、提取时间、提取温度对IDF得率的影响见图1。
图1 NaOH 浓度、液料比、提取时间、提取温度对莴苣叶中IDF 提取的影响
Fig.1 Effects of NaOH concentration，liquid-to-solid ratio，extraction time，and extraction temperature on the yield of insoluble dietary fiber from lettuce leaf residue
a.NaOH 浓度；b.液料比；c.提取时间；d.提取温度。
由图1a 可以看出，NaOH 浓度在3%～6%时，随着NaOH 浓度的增加，IDF 的得率持续上升，这可能是纤维素与半纤维素之间的氢键断裂所致[19]，但是当NaOH 浓度继续增大时，IDF 的得率反而下降，可能是由于强碱的作用使得部分IDF 水解。由图1b 可以看出，随着溶剂体积的增加，IDF 的得率先降低后上升，当液料比为60∶1（mL/g）时得率最高。由图1c 可以看出，当提取时间较短时，莴苣叶中的杂质可能析出不充分，而提取时间过长时，水解液浓度的增加会促进IDF 的水解，从而导致IDF 的得率降低。由图1d 可以看出，随着提取温度的升高，IDF 的得率先升高后降低，是因为提取温度过低时，莴苣叶中的杂质析出不充分，而提取温度过高时膳食纤维的结构被破坏。
2.2 响应面优化试验
2.2.1 响应面试验设计结果及分析
响应面试验设计和结果如表2所示。
表2 响应面试验方案及结果
Table 2 Response surface test design and results
试验号A NaOH浓度/%1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 5 7 5 7 6 6 6 6 5 7 5 7 6 6 6 6 5 7 5 7 6 6 6 6 6 6 6 B 液料比/（mL/g）40∶1 40∶1 60∶1 60∶1 50∶1 50∶1 50∶1 50∶1 50∶1 50∶1 50∶1 50∶1 40∶1 60∶1 40∶1 60∶1 50∶1 50∶1 50∶1 50∶1 40∶1 60∶1 40∶1 60∶1 50∶1 50∶1 50∶1 C 提取时间/min 30 30 30 30 15 45 15 45 30 30 30 30 15 15 45 45 15 15 45 45 30 30 30 30 30 30 30 D 提取温度/℃60 60 60 60 45 45 75 75 45 45 75 75 60 60 60 60 60 60 60 60 45 45 75 75 60 60 60 IDF 得率/%44.50 37.47 43.31 41.39 27.93 22.80 41.70 33.54 20.73 20.31 38.27 37.50 46.74 42.35 37.61 46.96 51.10 46.67 34.80 37.13 26.63 26.18 36.40 34.20 42.67 43.67 44.67
采用Box-Behnken 软件对表1 的结果进行回归拟合，建立IDF 得率与NaOH 浓度、液料比、提取时间、提取温度的二阶多项式模型：Y=-1.02A+0.42B-3.64C+6.42D+1.28AB+1.69AC-0.09AD+3.43BC-0.44BD-0.76CD-1.7A2-0.38B2+0.32C2-12.57D2。
2.2.2 响应面试验方差分析
响应面方差分析如表3所示。
表3 回归模型的显著性检验及方差分析
Table 3 Significance test and analysis of variance for the regression model
方差来源模型自由度14显著性**A B C D AB****AC AD BC BD CD平方和1 751.41 12.46 2.13 158.76 494.24 6.53 11.45 0.032 47.17 0.76 2.29 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1均方125.10 12.46 2.13 158.76 494.24 6.53 11.45 0.032 47.17 0.76 2.29 F 值13.29 1.32 0.23 16.87 52.51 0.69 1.22 0.003 4 5.01 0.081 0.24 P 值<0.000 1 0.272 4 0.642 8 0.001 5<0.000 1 0.421 0 0.291 7 0.954 5 0.044 9 0.780 8 0.630 9*
续表3 回归模型的显著性检验及方差分析
Continue table 3 Significance test and analysis of variance for the regression model
注：*表示影响显著（P<0.05）；**表示影响极显著（P<0.01）。
方差来源A²B²C²D²残差失拟项纯误差总和平方和15.40 0.76 0.55 842.77 112.94 110.94 2.00 1 864.35自由度显著性1 1 1 1 12 F 值1.64 0.081 0.059 89.54 P 值0.225 0 0.780 7 0.812 5<0.000 1 0.085 5**10 2 26均方15.40 0.76 0.55 842.77 9.41 11.09 1.00 11.09
由表2 可知，模型的P 值小于0.000 1，具有极显著性，失拟项的P 值为0.085 5>0.05，不显著，说明该模型具有良好的稳定性。模型决定系数R2=0.939 4，R2Adj=0.868 7，说明模型的可信度高，拟合程度良好。BC 的P 值小于0.05，表明液料比和提取时间对莴苣中IDF 得率的影响显著。C、D、D2 的P 值小于0.01，表示影响极显著。
2.2.3 响应面结果分析
利用软件Design-Expert10 得到各因素交互作用对IDF 得率影响的响应面见图2。
图2 各因素交互作用对IDF 得率影响的响应面图
Fig.2 Response surface diagram of the influence of interaction of various factors on IDF yield
由图2c、图2e、图2f 可知，每两个因素交互作用均呈椭圆形，均能明显影响IDF 的得率。其中提取温度和提取时间的交互作用响应曲面坡度最为陡峭，能显著影响IDF 的得率。液料比对IDF 得率的影响稍弱于温度和时间；NaOH 浓度影响较小，图2 中料液比与NaOH 浓度、提取时间与NaOH 浓度交互作用的相应曲面比较平缓，这与表2 方差分析结果一致。
2.2.4 最佳条件确定及验证
通过Optimization 的Numerical 功能，进行参数分析，得到提取IDF 理论上最佳提取条件为NaOH 浓度5.496%、液料比40.043∶1（mL/g）、提取时间15.171 min、提取温度64.942 ℃，在此条件下预测IDF 的得率为53.056%。
为了试验操作方便，将最佳提取条件调整为NaOH浓度5.5%、液料比40∶1（mL/g）、提取时间15 min、提取温度65 ℃，IDF 得率为51.43%，与预测值53.056% 接近。因此用该模型优化碱法提取莴苣叶中IDF 的工艺是可行的。
2.3 莴苣叶中IDF 的表征
采用扫描电子显微镜分别观察莴苣叶、脱脂后的莴苣叶和不溶性膳食纤维的表面特征，结果如图3所示。
图3 莴苣叶、脱脂后的莴苣叶和不溶性膳食纤维的扫描电子显微镜图
Fig.3 SEM of lettuce leaves，defatted lettuce leaves，and insoluble dietary fiber
A.莴苣叶，500 倍；B.脱脂后的莴苣叶，500 倍；C.不溶性膳食纤维，500 倍；a.莴苣叶，5 000 倍；b.脱脂后的莴苣叶，5 000 倍；c.不溶性膳食纤维，5 000 倍。
由图3 可以看出，各种样品均呈现不规则的层状结构。在图3a 观察到有颗粒状结构分布于其表面，根据Wen 等[20]研究的RBDF 微结构判断颗粒状结构可能是分离纯化后后残留的蛋白聚合物和小淀粉颗粒，在图3c 观察到层状结构变得疏松且多孔，这是由于在碱提取IDF 过程中，糖苷键及氢键被破坏所致，这种疏松多孔结构使IDF 具有更高的比表面积，对于提高其持水力、持油力有利。
莴苣叶、脱脂后的莴苣叶和不溶性膳食纤维的红外光谱如图4所示。
图4 莴苣叶、脱脂后的莴苣叶、不溶性膳食纤维的红外光谱
Fig.4 FTIR spectra of lettuce leaves，defatted lettuce leaves，and insoluble dietary fiber
a.莴苣叶；b.脱脂后的莴苣叶；c.不溶性膳食纤维。
由图4 可以看出，3 个样品的谱图相似，仅是强度发生变化。3 298 cm-1 处是糖醛酸的OH 伸缩振动峰，2 918 cm-1 处是纤维素特有的糖CH3 或CH2 的C—H 伸缩振动峰[21]，1 660 cm-1处是半纤维素的
或果胶的甲酯化
的拉伸振动峰[22]，1 543 cm-1 与1 424 cm-1处是木质素的C—H 振动峰，1 333 cm-1 与1 244 cm-1处的弱峰分别是果胶或β-糖苷键的O—H 与C—O 振动特征峰，而1 103 cm-1 与1 022 cm-1 处是木质素或半纤维素的C—O—O 伸缩振动[23]。1 000～600 cm-1 范围被认为是碳水化合物“指纹”区，综上分析说明，由莴苣叶中提取的IDF 是典型的膳食纤维，主要由纤维素、半纤维素、木质素和果胶4 种成分组成[24]。
莴苣叶、脱脂后的莴苣叶和不溶性膳食纤维的X射线衍射谱如图5所示。
图5 莴苣叶、脱脂后的莴苣叶、不溶性膳食纤维的X 射线衍射谱（XRD）
Fig.5 XRD spectra of lettuce leaves，defatted lettuce leaves，and insoluble dietary fiber
a.莴苣叶；b.脱脂后的莴苣叶；c.不溶性膳食纤维。
由图5 可以看出，在22°处均存在衍射峰，而不溶性膳食纤维在16°处存在衍射峰，表明提取得到的不溶性膳食纤维属于纤维素Ⅰ型晶体结构且结晶度明显增加，这可能是由于无定形纤维素在强碱条件下参与反应而被破坏[25]。
莴苣叶、脱脂后的莴苣叶和不溶性膳食纤维的热重如图6所示。
图6 莴苣叶、脱脂后的莴苣叶、不溶性膳食纤维的热重分析（TG/DTG）图
Fig.6 Thermogravimetric analysis/differential thermal analysis of lettuce leaves，defatted lettuce leaves，and insoluble dietary fiber
a.莴苣叶；b.脱脂后的莴苣叶；c.不溶性膳食纤维。
由图6 可以看出，3 个样品均存在两个质量损失阶段：在40～200 ℃的第一阶段，是由于样品中水分蒸发引起的，质量损失率在5%～11% 之间。在200～600 ℃的第二阶段，质量损失率在65%左右。由图6c的DTG 曲线可以看出256.06 ℃和346.45 ℃出现了两个尖峰，第一个峰的出现可能与半纤维素、果胶的热解或纤维素的预碳化有关，第二个峰的出现可能与多糖的热解有关[26]。比较图6b 与图6c 可以看出，IDF 的热解温度更高，这可能是在脱脂过程中除去了莴苣叶中的熔点低的组分；IDF 的热稳定性更好，这可能与其结晶度高有关[27]。
2.4 莴苣叶中IDF 的理化性能结果分析
持水性、持油性和溶胀度是评价不溶性膳食纤维预防和缓解肥胖、肠道疾病等功能性质的重要指标。莴苣叶中IDF 的理化性能见表4。
表4 IDF 的理化性能
Table 4 Physical and chemical properties of insoluble dietary fiber
持水力/（g/g）5.80±0.16持油力/（g/g）1.76±0.17溶胀度/（mL/g）0.12±0.02
由表4 可知，提取的IDF 表现出持水能力良好，但其溶胀现象并不明显，持水能力优于持油能力，这进一步证实了其具有疏松的表面结构和具有更多的亲水基团。
3 结论
采用碱提法提取莴苣叶中的IDF，在单因素的基础上利用响应面法对提取工艺进行优化，最优工艺条件优化结果为NaOH 浓度5.5%、液料比40∶1（mL/g）、提取时间15 min、提取温度65 ℃，IDF 得率为51.43%。通过对提取的IDF 进行表征分析可知，提取的IDF 是典型纤维素Ⅰ型晶体结构的膳食纤维，而且提取的IDF 具有更高的热解温度和更好的热稳定性。TDF 表现出较好的溶水力和持油力。
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