昆虫作为新蛋白资源，在食品、饲料、医药等方面具有潜在应用价值[1-2]，研究昆虫蛋白提取工艺及蛋白性质有利于昆虫资源的开发利用。昆虫蛋白的提取方法以碱法和酶法为主，碱法是常用的提取方法，提取效率高，但碱液会破坏蛋白质结构，使蛋白质营养和商业价值降低；酶法提取蛋白质是通过蛋白酶使部分蛋白质水解为多肽以提高蛋白质的溶解率[3]，反应条件温和，可水解得到高营养且具有功能性的蛋白质。Sun 等[4]研究表明沙虫蛋白经酶解后产生具有抗氧化、调节人体机能的生物活性肽。Purschke 等[5]研究酶法对蝗虫蛋白功能性质的影响，发现酶法提取对蛋白的持油性有积极作用。Mishyna 等[6]阐述了加工工艺对昆虫蛋白性质的影响，发现酶法提取可改善蛋白的溶解性和持油性。
竹虫（Omphisa fuscidentalis）又名竹蛆、竹蜂和竹螟，其营养丰富，粗蛋白含量达30%～40%[7]，胆固醇含量较低，是理想的蛋白食品。张芮娇等[8]采用碱法提取竹虫蛋白并研究其功能性质。向雄等[9]研究竹虫蛋白酶解产物对肠道益生菌增殖作用的影响，发现竹虫蛋白酶解液可促进4 种益生菌增殖。竹虫是云南省独具特色的食用昆虫，开发利用竹虫蛋白可为地方产业发展、乡村振兴提供基础。
基于此，本文通过酶法提取竹虫蛋白，采用响应面试验优化竹虫蛋白提取工艺，测定最佳提取工艺条件下的竹虫蛋白的体外抗氧化活性、等电点、溶解度、起泡性和起泡稳定性、乳化性和乳化稳定性，以期为竹虫资源的开发利用提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
冻品竹虫：市售；碱性蛋白酶（2×104 U/g）：合肥博美生物科技有限责任公司；中性蛋白酶（1×104 U/g）：上海源叶生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（8×104 U/g）：南宁庞博生物工程有限公司；胰蛋白酶（2.5×104 U/g）、胃蛋白酶（3×103 U/g）：南京都莱生物技术有限公司；石油醚（30～60 ℃）、95%乙醇（均为分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐[2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]（均为分析纯）：合肥巴斯夫生物科技有限公司；考马斯亮蓝G-250、牛血清蛋白、抗坏血酸（均为分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；氢氧化钠、盐酸（均为分析纯）：云南杨林工业开发区汕滇药业有限公司；十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfonate，SDS）（分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；大豆油：益海嘉里食品营销有限公司。
1.2 仪器
TG16-WS 高速台式离心机：湖南迈克尔实验仪器有限公司；PHS-25 pH 计：上海仪电科学仪器股份有限公司；UV-2600 紫外可见分光光度计：日本岛津公司；FJ200-SH 高速分散均质机：上海沪析实业有限公司；DHG-9240A 电热恒温鼓风干燥箱：上海齐欣科学仪器有限公司；CRT-400 高速多功能粉碎机：永康市超然电器有限公司；DZKW-4 电热恒温水浴锅：北京中兴伟业仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 竹虫蛋白提取工艺流程
竹虫洗净于40 ℃烘箱烘干后粉碎，加入液料比20∶1（mL/g）的石油醚脱脂，风干后过80 目筛得脱脂竹虫粉，备用。称取2.00 g 脱脂竹虫粉，加入去离子水配制为一定的液料比，调节溶液pH 值，加入酶制剂，水浴反应适当时间后，90 ℃水浴反应10 min 后钝化酶活，待冷却后于4 ℃、8 000 r/min 离心15 min，取上清液于40 ℃烘箱中烘干得竹虫蛋白，4 ℃保存。
1.3.2 脱脂竹虫总蛋白含量
利用考马斯亮蓝法测定脱脂竹虫总蛋白含量[10]。标准曲线的绘制：配制0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10 mg/mL 的牛血清蛋白溶液，加入100 μg/mL 考马斯亮蓝G-250 溶液5 mL，摇匀，静置10 min 后，595 nm 处测吸光值。线性方程为y=5.047 3x+0.020 8（R2=0.999 3）。根据公式（1）计算蛋白质含量（D，%）。
式中：m 为样品质量，mg；c 为测定竹虫蛋白溶液浓度，mg/mL；v 为样品定容体积，mL。
1.3.3 脱脂竹虫蛋白提取率
按公式（2）计算蛋白质的提取率（T，%）。
式中：c0 为脱脂竹虫粉总蛋白含量，76.54%；c1 为竹虫溶液蛋白含量，%；m1 为提取后竹虫蛋白的质量，g；m2 为称取脱脂竹虫粉的质量，g。
1.3.4 酶制剂的选取
以碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶为供选酶，在各自适宜条件下，统一加酶量及液料比，具体操作条件见表1，根据提取率确定酶制剂。
表1 不同酶制剂反应条件
Table 1 Reaction conditions of different enzymes
酶种类碱性蛋白酶中性蛋白酶木瓜蛋白酶胰蛋白酶胃蛋白酶适宜pH 值10.0 7.0 6.0 8.0 2.0适宜温度/℃55 50 55 40 40加酶量/%1.0 1.0 1.0 1.0 1.0液料比/（mL/g）10∶1 10∶1 10∶1 10∶1 10∶1
1.3.5 单因素试验
根据酶解竹虫蛋白提取率的结果，采用胃蛋白酶提取竹虫蛋白，并优化提取工艺。分别固定pH2.0、提取温度40 ℃、提取时间2.0 h、液料比10∶1（mL/g）、加酶量1.0%（质量分数）。探究不同pH 值（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0）、提取温度（30、35、40、45、50 ℃）、提取时间（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）、液料比[5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1（mL/g）]、加酶量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）对竹虫蛋白提取率的影响。
1.3.6 响应面试验
在单因素试验基础上，利用Design-Expert 13 进行四因素三水平的响应面试验进行优化。响应面因素水平见表2。
表2 响应面因素水平
Table 2 Factors and levels of response surface test
水平-1因素0 1 A pH 值1.5 2.0 2.5 B 提取温度/℃35 40 45 C 提取时间/h 1.5 2.0 2.5 D 液料比/（mL/g）5∶1 10∶1 15∶1
1.3.7 竹虫蛋白抗氧化活性研究
1.3.7.1 DPPH∙清除率测定
参考Yang 等[11]的方法并略作修改。取2.0 mL 不同浓度（0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL）的竹虫蛋白溶液，加入2.0 mL DPPH 溶液（0.1 mmol/L），涡旋混匀后避光反应30 min。以无水乙醇为参比，517 nm处测吸光值A1；以无水乙醇代替DPPH 溶液测吸光值A2；以无水乙醇代替样品溶液测吸光值A0。以同浓度抗坏血酸溶液做对照。DPPH∙清除率（P，%）按公式（3）计算。
1.3.7.2 ABTS+∙清除率测定
参照Fan 等[12]的方法并稍作修改。取0.5 mL 不同浓度（0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL）的竹虫蛋白溶液，加入5.0 mL ABTS 测定液混合摇匀，室温下避光反应20 min 后，734 nm 处测吸光值A1；以去离子水代替样品溶液测吸光值A0；以去离子水代替ABTS测定液测吸光值A2。同浓度抗坏血酸溶液做对照。ABTS+∙清除率（B，%）按公式（4）计算。
1.3.7.3 总还原力测定
参照Wang 等[13]的方法并稍作修改。取2.5 mL 不同浓度（0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL）的竹虫蛋白溶液，加入磷酸缓冲液（0.2 mol/L，pH6.6）2.5 mL和1.0% 铁氰化钾2.5 mL，混合均匀反应20 min（50 ℃）。加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，混合均匀反应10 min。取上清液2.5 mL，加入去离子水2.5 mL 和0.1%三氯化铁0.5 mL，混匀反应10 min。700 nm 处测吸光值，吸光值越大表示还原能力越强。
1.3.7.4 其它性质的测定
参考Qi 等[14]和Yan 等[15]的方法，并稍作修改，对酶法提取竹虫蛋白的等电点、溶解度、起泡性和起泡稳定性、乳化性和乳化稳定性进行测定。
等电点：取7 mL 竹虫蛋白溶液（5 mg/mL），加入HCl 溶液（0.25 mol/L）和NaOH 溶液（0.25 mol/L）分别调节pH 值至4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8，摇晃均匀，静置10 min，5 000 r/min 离心10 min。取沉淀，烘干称重。依据公式（5）计算竹虫蛋白残留率（L，%），残留率最低处pH 值为蛋白等电点。
式中：M 为称取竹虫蛋白质量，g；m 为烘干后沉淀的质量，g。
溶解度：取10 mL 竹虫蛋白溶液（10 mg/mL，pH2.0），将溶液于室温下搅拌20 min（100 r/min）后，10 000 r/min 离心10 min。取0.2 mL 上清液，加入0.8 mL 去离子水，加入5 mL 考马斯亮蓝G-250 溶液，混匀后静置15 min。测吸光值（595 nm），对照考马斯亮蓝法标准曲线计算得溶解度。
起泡性和起泡稳定性：取质量分数5.0%的竹虫蛋白质溶液20 mL，以10 000 r/min 高速分散2 min，记录泡沫的体积V1，静置30 min 后，记录其泡沫体积V2。起泡性（Q1，%）和起泡稳定性（Q2，%）按公式（6）、公式（7）计算。
式中：V 为量取竹虫蛋白溶液体积，mL；V1 为静置前泡沫体积，mL；V2 为静置后泡沫体积，mL。
乳化性和乳化稳定性：取6 mL 竹虫蛋白溶液（10 mg/mL），加入2 mL 大豆油，10 000 r/min 高速分散2 min 后，吸取乳化液0.1 mL，用SDS（0.1%）溶液稀释300 倍，以SDS（0.1%）溶液为空白对照，500 nm 处测定吸光值A1，静置30 min 取样，测定其吸光值A2。乳化性（E，m2/g）及乳化稳定性（S，%）按公式（8）、公式（9）计算。
式中：C 为溶液中样品蛋白质浓度，g/mL；ɸ 为油相体积分数，25%；N 为稀释倍数，300。
1.4 数据分析
所有试验重复3 次。通过SPSS 22.0 和GraphPad Prism 9 软件分析处理数据；并采用Origin 2022 软件作图；采用Design-Expert 13 软件进行响应面试验设计。
2 结果与分析
2.1 脱脂竹虫总蛋白含量及酶制剂的选择
经计算得出脱脂后的竹虫粉中蛋白含量达76.54%，此结果与王琦等[7]的研究结果一致。酶的特性不同，与蛋白质作用位点不同，蛋白质酶解程度不同，对蛋白质的提取效果有一定差异。酶种类对竹虫蛋白提取率的影响如图1所示。
图1 酶制剂对竹虫蛋白提取率的影响
Fig.1 Effects of enzymes on the extraction rate of Omphisa fuscidentalis protein
不同小写字母表示差异显著，P<0.05。
酶种类对竹虫蛋白提取率影响较大，其中胃蛋白酶对竹虫蛋白提取率的影响显著高于其它酶（P<0.05），提取率达20.30%，因此选用胃蛋白酶作为酶法提取竹虫蛋白的酶制剂。
2.2 单因素结果
2.2.1 pH 值对竹虫蛋白提取率的影响
pH 值对竹虫蛋白提取率的影响如图2所示。
图2 pH 值对竹虫蛋白提取率的影响
Fig.2 Effect of pH on the extraction rate of Omphisa fuscidentalis protein
不同小写字母表示差异显著，P<0.05。
由图2 可知，竹虫蛋白提取率随pH 值增加呈先上升后下降的趋势，pH 值2.0 时竹虫蛋白提取率最高，达20.30%。胃蛋白酶最适pH 值范围为2.0～3.0[16]，pH 值过高或过低均会影响酶分子的空间结构，导致酶活性部位的构象发生变化，同时改变酶分子和底物分子的解离状态，使酶的作用效果减弱，蛋白提取率降低[17]。pH 值继续升高，逐渐接近蛋白的等电点，蛋白间的静电斥力作用减弱，发生聚集沉淀，导致蛋白提取率降低。因此选取pH 值为1.5、2.0、2.5 进行响应面试验。
2.2.2 提取温度对竹虫蛋白提取率的影响
酶活性受提取温度影响，最适反应温度下其活性最高，蛋白提取率最高。提取温度对蛋白提取率的影响如图3所示。
图3 提取温度对竹虫蛋白提取率的影响
Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction rate of Omphisa fuscidentalis protein
不同小写字母表示差异显著，P<0.05。
由图3 可知，随提取温度升高，蛋白提取率显著增大（P<0.05），提取温度为40 ℃时，提取率最高为20.30%。提取温度大于40 ℃时，竹虫蛋白提取率显著降低（P<0.05）。适当升高提取温度可增强水分子和蛋白质分子间相互作用，同时部分蛋白质结构展开使部分反应位点暴露，酶解率和蛋白提取率提高[18]。提取温度继续升高，蛋白质空间构象被破坏，部分酶在高温下失活，蛋白提取率降低[19]。高云龙等[20]提取刺参内脏团蛋白时发现，适当升高温度可提高蛋白提取率，与本文研究结果一致。因此，选取提取温度35、40、45 ℃3 个水平进行响应面试验。
2.2.3 提取时间对竹虫蛋白提取率的影响
提取时间对竹虫蛋白提取率的影响如图4所示。
图4 提取时间对竹虫蛋白提取率的影响
Fig.4 Effect of extraction time on the extraction rate of Omphisa fuscidentalis protein
不同小写字母表示差异显著，P<0.05。
由图4 可知，竹虫蛋白提取率随提取时间延长先显著上升后显著下降（P<0.05），2.0 h 时竹虫蛋白提取率最高20.30%。在反应初期，蛋白中存在大量酶切位点，酶作用于蛋白的酶切位点，随反应时间增至2.0 h，肽链大部分断裂，酶切位点减少，提取率达到最大值。反应时间继续延长，蛋白过度水解，部分蛋白水解为小分子肽，使蛋白提取率降低。时间延长，蛋白分子间产生相互作用，使蛋白发生聚集、凝结等[21]，竹虫蛋白提取率降低。因此，选取提取时间1.5、2.0、2.5 h 3 个水平进行响应面试验。
2.2.4 液料比对竹虫蛋白提取率的影响
液料比对竹虫蛋白提取率的影响如图5所示。
图5 液料比对竹虫蛋白提取率的影响
Fig.5 Effect of liquid-to-solid ratio on the extraction rate of Omphisa fuscidentalis protein
不同小写字母表示差异显著，P<0.05。
由图5 可知，液料比由5∶1（mL/g）增至10∶1（mL/g）时，竹虫蛋白提取率显著增加（P<0.05），液料比为10∶1（mL/g）时提取率最高（20.30%）。液料比继续增加[10∶1～25∶1（mL/g）]，竹虫蛋白提取率显著下降（P<0.05）。原因可能为适宜的液料比能促进胃蛋白酶与竹虫蛋白作用位点的结合。液料比过低，液料黏度大，底物与酶的流动受限制，影响酶与底物结合的效果，降低蛋白提取率[22]。液料比过高，酶和底物浓度降低，酶分子与底物分子的碰撞机率减小，不利于蛋白的提取。因此，选用液料比5∶1、10∶1、15∶1（mL/g）3 个水平进行响应面试验。
2.2.5 加酶量对竹虫蛋白提取率的影响
加酶量对竹虫蛋白提取率的影响如图6所示。
图6 加酶量对竹虫蛋白提取率的影响
Fig.6 Effect of enzyme dosage on the extraction rate of Omphisa fuscidentalis protein
不同小写字母表示差异显著，P<0.05。
由图6 可知，随加酶量增加竹虫蛋白提取率先上升后下降。加酶量为2.0% 时提取率最高（20.51%），加酶量大于2.0% 时蛋白提取率显著下降（P<0.05）。加酶量过低时，体系处于底物浓度过饱和状态，酶-底物复合物较少，提取率较低。而随加酶量增加提取率提高，酶含量达到饱和，提取率达最高。继续增大加酶量，胃蛋白酶处于过量状态，过量的酶开始酶解多肽使蛋白被高度水解，导致提取率降低[23]。因加酶量由1.0%增至2.0%时，蛋白提取率未显著增加（P>0.05）。考虑到经济因素。因此选取胃蛋白酶添加量为1.0%。
2.3 响应面优化试验
2.3.1 竹虫蛋白提取结果
根据单因素结果进一步优化竹虫蛋白提取工艺，以溶液pH 值（A）、提取温度（B）、提取时间（C）、液料比（D）为自变量，竹虫蛋白提取率（Y）为响应值，进行Box-Behnken 的中心组合试验，响应面试验设计和结果见表3。
表3 响应面试验设计及结果
Table 3 Response surface test design and results
组别C 提取时间D 液料比1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A pH 值-1 0-1 B 提取温度-1 0 0-1 0 0 0 1 1 0-0 0 0-1 0 0 0--1 0-1 0 0 0 1-1-1-1 0 0-0 1-11 12 13 14 15 16 1 0-1 1 1 0 1 1 0 1 0 0-1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0-1 0 Y 提取率/%12.94 20.74 13.18 19.59 8.03 9.09 8.68 12.30 17.09 11.61 18.96 16.23 17.38 12.42 10.57 13.28
续表3 响应面试验设计及结果
Continue table 3 Response surface test design and results
组别17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 A pH 值B 提取温度C 提取时间D 液料比0 0 0 0 0 0 0 1-0 1-1-1 0 1 1 0 1 0-1-1 1 0-1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0-1 0 Y 提取率/%19.72 17.69 15.70 18.94 18.14 20.81 17.57 14.16 16.53 19.81 15.65 10.91 20.37
2.3.2 响应面试验回归模型的建立
采用Design-Expert 13 软件对试验结果进行回归分析，回归模型的方差分析结果如表4所示。
表4 竹虫蛋白提取率试验方差分析结果
Table 4 Analysis of variance results on the extraction rate of Omphisa fuscidentalis protein
注：*表示影响显著（P<0.05）；**表示影响极显著（P<0.01）。
方差来源模型A pH 值B 提取温度C 提取时间D 液料比AB AC AD BC BD CD A²B²C²D²残差失拟项纯误差总误差平方和407.42 5.23 6.16 0.007 213.79 0.855 6 6.03 3.57 0.57 1.59 2.67 106.04 32.35 22.98 81.04 14.86 13.82 1.03 422.28自由度14显著性**1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 14 F 值27.42 4.93 5.81 0.006 6 201.44 0.806 2 5.68 3.37 0.537 1 1.5 2.52 99.92 30.48 21.65 76.36 P 值<0.000 1 0.043 5 0.030 3 0.936 4<0.000 1 0.384 4 0.031 9 0.087 9 0.475 7 0.241 5 0.134 8<0.000 1<0.000 1 0.000 4<0.000 1*************10 4 28均方29.1 5.23 6.16 0.007 213.79 0.855 6 6.03 3.57 0.57 1.59 2.67 106.04 32.35 22.98 81.04 1.06 1.38 0.258 6 5.34 0.060 2不显著
回归模型：Y=20.290 0-0.660 0A+0.716 7B+0.024 2C+4.220 0D-0.462 5AB-1.230 0AC+0.945 0AD+0.377 5BC-0.630 0BD-0.817 5CD-4.040 0A2-2.230 0B2-1.880 0C2-3.530 0D2。
由表4 可知，模型F=27.42，P<0.000 1，该回归模型差异极显著；回归方程失拟项P=0.060 2>0.05，无显著性差异，说明该模型拟合度较好；决定系数R2=0.964 8，R2adj=0.929 6，变异系数6.67%。表明模型与试验数据拟合程度较好，具有较好的相关性，置信度高，表明该模型合理，可对竹虫蛋白提取率进行预测及分析。
该模型的一次项（D）对竹虫蛋白提取率的影响极显著（P<0.000 1），一次项（A 和B）和交互项（AC）对蛋白提取率的影响显著（P<0.05），二次项（A2、B2、C2、D2）对蛋白提取率影响极显著（P<0.01）；由F 值可看出，各因素对竹虫蛋白提取率影响大小为D（液料比）>B（提取温度）>A（pH 值）>C（提取时间），各交互项影响大小为AC>AD>CD>BD>AB>BC。
2.3.3 响应面分析与优化
根据回归方程，得到各因素交互作用对竹虫蛋白提取率影响的响应面图和等高线图如图7所示。
图7 交互作用对竹虫蛋白提取率的影响
Fig.7 Effects of interactions between extraction factors on the extraction rate of Omphisa fuscidentalis protein
因素间交互作用的强弱与投影面等高线的形状有关，形状趋于椭圆时交互作用对蛋白提取率影响越大；形状趋于圆形，交互作用对蛋白提取率影响越小。响应面曲面形状的陡峭程度反应因素间交互作用对提取率的影响，其形状越陡峭，对蛋白质提取率影响越大，反之，影响越小。由图7e 知，A（pH 值）与C（提取时间）的等高线更趋于椭圆，响应曲面的坡度更陡峭，对蛋白质提取率影响较大。其他因素间的等高线图趋于圆形且响应曲面坡度较缓，交互作用对蛋白提取率影响较小，与方差分析结果一致。
2.3.4 模型验证
由模型拟合得出竹虫蛋白提取的最佳工艺为pH1.98、提取温度38.29 ℃、提取时间1.99 h、液料比12.32∶1（mL/g），竹虫蛋白的提取率达21.09%。依据实际情况，将竹虫蛋白提取条件设置为pH 值2.0、40 ℃、2.0 h、液料比12.5∶1（mL/g），加酶量1.0%，蛋白质提取率为21.00%。与预测值接近，该数学模型的可行性得到验证。
2.4 酶法提取竹虫蛋白的抗氧化性
2.4.1 DPPH∙清除能力
DPPH∙清除能力测定是一种简便准确的体外抗氧化性测定方法，是基于抗氧化剂提供氢原子或电子，将DPPH∙转化为非自由基。竹虫蛋白对DPPH 的清除率如图8所示。
图8 竹虫蛋白对DPPH∙清除率
Fig.8 DPPH∙scavenging rate of Omphisa fuscidentalis protein
同一样品不同字母表示差异显著，P<0.05。
由图8 可知，随竹虫蛋白浓度增大，DPPH∙清除率先显著增大（P<0.05）后趋于平缓。当竹虫蛋白浓度为1.5 mg/mL，竹虫蛋白对DPPH∙的清除率达94.13%，但低于抗坏血酸，原因为竹虫蛋白与抗坏血酸释放质子和电子的能力不同导致清除能力不同[24]。竹虫蛋白IC50 为0.43 mg/mL，IC50 值越小蛋白质抗氧化性能越好。结果表明在试验浓度范围内，竹虫蛋白对DPPH∙的清除能力较好。
2.4.2 ABTS+∙清除能力
ABTS+∙清除率测定是一种广泛应用的体外抗氧化性检测方法。竹虫蛋白ABTS+∙清除率如图9所示。
图9 竹虫蛋白对ABTS+∙清除率
Fig.9 ABTS+∙scavenging rate of Omphisa fuscidentalis protein
同一样品不同字母表示差异显著，P<0.05。
由图9 可知，竹虫蛋白对ABTS+∙清除能力与其浓度呈正相关，ABTS+∙清除能力随其浓度增加而显著增加（P<0.05），竹虫蛋白浓度为3.0 mg/mL 时ABTS+∙清除率达为69.45%，其IC50 为0.66 mg/mL。较DPPH∙清除率低，原因可能为不同自由基的氧化机制不同，同一物质对不同种类自由基的清除作用存在差异。与抗坏血酸相比，竹虫蛋白的ABTS+∙清除率较低，但仍是一种有潜力的抗氧化剂。
2.4.3 总还原力的测定
竹虫蛋白总还原力结果如图10所示。
图10 竹虫蛋白的总还原力
Fig.10 Reducing power of Omphisa fuscidentalis protein
同一样品不同字母表示差异显著，P<0.05。
由图10 可知，竹虫蛋白溶液的总还原力与其浓度呈正相关，随浓度升高，其还原力升高，即抗氧化能力增强。浓度为3.0 mg/mL 时，吸光值达1.13，与抗坏血酸相比，其还原力较低。杨晶莹等[25]对富硒灵芝蛋白抗氧化活性进行研究，发现富硒灵芝蛋白对DPPH∙和ABTS+∙清除率较高，而总还原力较低，与本文研究结果一致。
2.5 竹虫蛋白其它性质
对酶法提取蛋白的等电点、溶解性、起泡性、起泡稳定性、乳化性、乳化稳定性进行测定，结果如表5所示。
表5 竹虫蛋白的性质测定
Table 5 Properties of Omphisa fuscidentalis protein
等电点pH 值4.6溶解度/%20.88±0.07起泡性/%142.00±2.00起泡稳定性/%7.51±0.72乳化性/（m2/g）25.17±0.26乳化稳定性/%103.12±0.17
由表5 可知，酶法提取竹虫蛋白等电点为pH4.6、溶解性20.88%（pH2.0）、起泡性142.00%、起泡稳定性7.51%、乳化性25.17 m2/g、乳化稳定性103.12%。酶法提取竹虫的蛋白等电点为pH4.6，与张芮娇等[8]采用碱法提取的蛋白等电点（pH4.4）存在一定差异，原因可能为酶水解的蛋白质改变了其分子量、表面活性和疏水性，蛋白性质发生改变使其等电点发生变化[26]。酶法提取蛋白的起泡性较好，原因为胃蛋白酶使部分蛋白水解为多肽，导致分子量降低，柔韧性增加，形成稳定的界面层从而改善了蛋白的起泡性[27]。同时，随分子量的降低，蛋白溶液维持水界面与空气的能力降低，而使竹虫蛋白的起泡稳定性降低[6]。酶解竹虫蛋白的乳化性和乳化稳定性较高，原因可能为蛋白经过酶解后，疏水区域暴露，蛋白与油的接触面积增大，而提高了蛋白的乳化性和乳化稳定性[28]。
3 结论
采用酶法提取竹虫蛋白，考察pH 值、提取温度、提取时间、液料比和加酶量5 个因素对竹虫蛋白提取率的影响。通过响应面优化提取工艺条件，最佳工艺条件为pH2.0、提取温度40 ℃、提取时间2.0 h、液料比12.5∶1（mL/g），此时竹虫蛋白提取率为21.00%。测定最佳提取条件下竹虫蛋白具有良好抗氧化能力，DPPH∙和ABTS+∙的最大清除率分别为94.13%和69.45%，IC50分别为0.43 mg/mL 和0.66 mg/mL。酶法提取竹虫蛋白的等电点为pH4.6，其溶解度、起泡性、乳化性和乳化稳定性均较好。本文为竹虫在食品、保健品等领域的开发利用提供理论依据。
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