菠萝和菠萝蜜复合果醋发酵工艺及挥发性物质分析

菠萝属于热带水果，果实甘甜、多汁、营养丰富。菠萝除鲜食外还可加工成罐头、果酱、果酒、果醋等相关产品，但加工过程会损失部分风味物质[1-2]，导致菠萝产品香气变淡。同为热带水果的菠萝蜜有“热带水果皇后”、“齿留香”之称，其果肉醇厚鲜美，果香浓郁，有强烈的独特水果风味。与芒果、香蕉等热带水果相比，菠萝蜜果肉含有更丰富的蛋白质、维生素、微量元素以及其他抗氧化物质等营养成分。菠萝蜜属于药食同源类水果，药用价值较高[3]。但是菠萝蜜的成熟期较集中，不耐贮藏，其深加工产品较少[4]。

果醋是以水果为原料，以酵母菌和醋酸菌发酵为主，通过乙醇和醋酸发酵而得，同时具有水果风味和食醋营养特性，如抗氧化、抗疲劳、调节机体代谢、调节脂质代谢以及调节免疫等功能[5]。市售果醋大多为单一果醋，风味单一，而复合果醋可以同时兼具两种以上水果的独特风味，改善口感，张海玲等[6]以梨和山药为原料，制得同时具有梨香和山药香的复合果醋；王晓丽等[7]制备出了典型酥梨和柚子风味的复合果醋。

研究表明，酿酒酵母可以利用乳酸菌发酵所得的乳酸为底物进行乳酸乙酯、丁酸乙酯等其他香气化合物的合成[8]，同时，乳酸菌通过影响酵母菌的代谢，进而调节香气物质的产生[9]。Tristezza 等[10]接种酵母菌和乳酸菌共同发酵葡萄酒，发现葡萄酒的挥发性酸有所降低，酯类物质含量有所增加。Chen 等[11]的研究表明，在柑橘果醋乙醇发酵过程中加入植物乳杆菌，可明显提高果醋中浓香型乳酸乙酯的含量。田璐等[12]通过酿酒酵母、植物乳杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌混合发酵，使果醋的挥发性风味物质种类增多。贾瑞娟等[13]的研究表明，在芽孢杆菌与醋酸菌、乳酸菌共同培养下，山西老陈醋的乙酸乙酯、异戊酸乙酯等特征香气物质含量有所提高。因此，在果醋发酵过程中，加入植物乳杆菌可以有效增加酯类含量，减弱醋酸的刺激口感，进而改善果醋风味。

目前，复合原料和多种菌株同时发酵的研究报道较少，因此，将产量高的菠萝与菠萝蜜浓郁的香气相结合，开发一种新型复合果醋具有重要意义。本研究以菠萝和菠萝蜜为发酵原料，采用酵母菌、植物乳杆菌和醋酸菌进行多菌种发酵，优化醋酸发酵工艺，分析挥发性物质，以期为菠萝和菠萝蜜复合果醋的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

菠萝、菠萝蜜：市售；酿酒酵母：安琪酵母股份有限公司；植物乳杆菌（ACCC11095）：广东省微生物菌种保藏中心；Aa941 醋酸菌：广东海洋大学微生物实验室筛选。

1.1.2 主要试剂

焦亚硫酸钠、柠檬酸、L-抗坏血酸、无水葡萄糖（均为分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；果胶酶（>1 000 U/g）：山东隆科特酶制剂有限公司；YPD 肉汤培养基：生工生物工程（上海）股份有限公司；MRS 肉汤培养基、酵母浸粉、琼脂粉：北京陆桥技术股份有限公司；2-辛醇标准品（纯度98%）：北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

GC-MS-TQ8050NX 气相色谱-质谱联用仪：日本岛津公司；50/30μm PDMS/DVB SPME 萃取头：美国Supelco 公司；WYT-1 手持式折光仪：杭州汇尔仪器设备有限公司；HH-6 电热恒温水浴锅：国华电器有限公司；HZQ-F160 振荡培养箱：北京东联哈尔仪器制造有限公司；LTI-700W 生化培养箱：埃朗科技国际贸易（上海）有限公司；PHS-3E pH 计：上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 种子液的培养

酵母菌活化液：接种0.02% 活性干酵母于葡萄糖培养基中30 ℃振荡培养30 min。

酵母菌种子液：吸取10 mL 酵母菌活化液至90 mL YPD 培养基中，于28 ℃培养24 h。

植物乳杆菌种子液：从斜面挑取1～2 环植物乳杆菌于100 mL MRS 培养基中，37 ℃培养48 h。

醋酸菌活化液：从斜面挑取1～2 环醋酸菌于20 mL醋酸菌培养基（1%葡萄糖、1%酵母浸粉，自然pH 值）中进行活化，30 ℃培养48 h。

醋酸菌种子液：从醋酸菌活化液中吸取1 mL 至100 mL 醋酸菌培养基中进行扩培，30 ℃培养48 h，备用。

1.3.2 工艺流程

菠萝和菠萝蜜复合果醋发酵工艺流程见图1。

操作要点如下。

护色：置于0.8% 柠檬酸与0.01% 抗坏血酸质量比为1∶1 的护色液中浸泡20 min[14-15]。

打浆：护色后按体积比1∶1.5 加入蒸馏水进行榨汁。

酶解：加入0.5 g/L 的果胶酶，搅拌均匀后30 ℃静置，酶解3 h。

调糖度：添加白砂糖调节糖度至20%。

乙醇发酵：同时接种3% 植物乳杆菌（1×107 CFU/mL）和3%酿酒酵母（1×106 CFU/mL）发酵6 d[16]。

调节pH 值：使用pH 计，利用柠檬酸和碳酸氢钠饱和溶液，调节pH 值。

1.3.3 果汁混合体积比的确定

将打浆后未调糖度的菠萝和菠萝蜜果汁以不同体积比（1∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5）混合，进行感官评分。

1.3.4 醋酸发酵单因素试验

1.3.4.1 乙醇体积分数对总酸含量的影响

分别调节乙醇体积分数为2%、4%、6%、8%、10%，初始pH3.5，接种8%醋酸菌种子液，置于31 ℃振荡培养7 d，测定总酸含量。

1.3.4.2 初始pH 值对总酸含量的影响

调节乙醇体积分数为6%，初始pH 值分别为2.5、3.5、4.5、5.5、6.5，接种8%醋酸菌种子液，置于31 ℃振荡培养7 d，测定总酸含量。

1.3.4.3 醋酸菌接种量对总酸含量的影响

调节乙醇体积分数为6%、初始pH3.5，分别接种5%、8%、11%、14%、17% 醋酸菌种子液，置于31 ℃振荡培养7 d，测定总酸含量。

1.3.4.4 发酵温度对总酸含量的影响

调节乙醇体积分数至6%、pH3.5，接种8%醋酸菌种子液，分别置于25、28、31、34 ℃振荡培养7 d，测定总酸含量。

1.3.5 醋酸发酵正交试验

在单因素试验的基础上，以总酸含量为指标，设计四因素三水平正交试验，因素及水平见表1。

1.3.6 挥发性物质检测

采用顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）结合气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术分别对最优工艺获得的菠萝和菠萝蜜复合果醋（1 号醋）；不同原料、相同菌种、相同工艺条件发酵的单菠萝醋（2 号醋）以及相同原料、相同工艺条件、不添加植物乳杆菌发酵的菠萝和菠萝蜜复合果醋（3 号醋）进行挥发性物质分析，参考Al-Dalali 等[17]的方法并略作改动，为更好地分离挥发性物质，本研究以2-辛醇为内标物。

HS-SPME 条件为加入8 mL 样品和1.9 g 氯化钠于20 mL 顶空瓶中，加入5 μL 的2-辛醇（0.822 mg/mL，稀释于甲醇）作为内标物，加入磁力搅拌子，用内衬聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene，PTFE）硅胶垫的瓶盖密封，置于45 ℃恒温磁力搅拌水浴锅中，使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取头插入顶空瓶中，于液面上方进行顶空萃取30 min，于250 ℃下解吸5 min。每种样品做3 组平行试验。

GC-MS 条件为HP-INNOWAX 毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气：高纯度氦气，载气流速1 mL/min，分流进样；程序升温：40 ℃保持3.5 min，以5 ℃/min 的速率升温至90 ℃并保持2 min，然后以12 ℃/min 的速率升温至230 ℃并保持10 min。电离方式：电子轰击（electron impact，EI）；电离电压：70 eV；离子源温度：250 ℃，传输线温度：250 ℃；质量扫描范围：m/z 33～450。

定性方法：采用NIST14s.lib 谱库对挥发性物质进行定性分析。

定量方法：根据罗美燕等[18]的方法，采用内标法进行半定量，即挥发性成分通过各挥发性物质峰面积（A）与已知浓度的内标物（2-辛醇）峰面积（A0）的比值进行定量，每种样品做3 组平行试验，结果以平均值±标准差表示。挥发性成分质量浓度的计算公式如下。

式中：X 为挥发性成分质量浓度，μg/L；A 为挥发性物质的峰面积；A0 为内标物（2-辛醇）的峰面积；0.822为内标物浓度，mg/mL；5 为内标物体积，μL；V 为样品体积，mL。

1.3.7 主要指标测定方法

利用手持折光仪进行糖度测定；总酸（以乙酸计）测定参照GB 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》中的酸碱滴定法；乙醇体积分数的测定参照GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》中的旋蒸法。

感官评价：由11 人组成评判小组，根据NY 82.2—1988《果汁测定方法感官检验》进行感官评分。

1.4 数据分析

所有试验重复3 次，数据结果以平均值±标准差的形式表示，使用JMP Pro16 软件进行显著性分析，使用Origin 2021b 和Excel 软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1 复合果汁体积比的确定

以果汁的颜色、风味、滋味和组织形态为评价要素，对6 组不同果汁体积比的复合果汁进行感官评价，结果如图2所示。

由图2 可知，菠萝与菠萝蜜体积比为1∶0、9∶1、8∶2、7∶3、5∶5 时的感官评分无显著性差异（P>0.05），菠萝与菠萝蜜体积比为6∶4 时感官评分最高。

2.2 醋酸发酵单因素试验结果

2.2.1 乙醇体积分数对复合果醋总酸含量的影响

乙醇体积分数对复合果醋总酸含量的影响如图3所示。

由图3 可知，乙醇体积分数为2%和8%时，没有显著差异（P>0.05）；4%、6%、10% 时差异显著（P<0.05）。乙醇体积分数为2%～4%时，总酸含量增加；4%时达到最高；在4%～10%之间，总酸含量持续下降。乙醇是乙酸发酵的基质，乙醇体积分数过低时，醋酸菌的代谢产物较少；过高的乙醇会影响醋酸菌的生长。

2.2.2 初始pH 值对复合果醋总酸含量的影响

初始pH 值对复合果醋总酸含量的影响见图4。

由图4 可知，随着初始pH 值的升高，总酸含量呈先升高后降低的趋势。醋酸菌在初始pH3.5～6.5 之间，适宜生长。在初始pH2.5 时，几乎不生长。初始pH2.5～4.5 时，总酸含量升高；当初始pH4.5 时，总酸含量达到最高；初始pH4.5～5.5 时，总酸含量降低。初始pH 值过低或过高均会影响醋酸菌中乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活性[19]，代谢受限，总酸含量也会降低。

2.2.3 醋酸菌接种量对复合果醋总酸含量的影响

醋酸菌接种量对复合果醋总酸含量的影响见图5。

由图5 可知，不同醋酸菌接种量的复合果醋总酸含量呈先升高后降低的趋势，且差异显著（P<0.05）。醋酸菌接种量为5%～14%时，总酸含量持续升高；14%时达到最高；醋酸菌接种量为14%～17%时，总酸含量降低。醋酸菌接种量过小，菌种生长缓慢，发酵周期延长；接种量过多时，发酵前期醋酸菌快速生长，发酵液中营养物质消耗快，菌种代谢物加速醋酸菌老化，总酸含量不再呈增加趋势。

2.2.4 发酵温度对复合果醋总酸含量的影响

发酵温度对复合果醋总酸含量的影响见图6。

由图6 可知，发酵温度为25～28 ℃，总酸含量增加；28～31 ℃总酸含量差异不显著（P>0.05），在该范围内适合醋酸菌生长；31～34 ℃时总酸含量降低。发酵温度过低，醋酸菌生长缓慢，代谢产物少，延长发酵周期；发酵温度过高会影响醋酸菌体内酶、蛋白质等活性，醋酸菌代谢受限，总酸含量也会降低。

因此，分别选择乙醇体积分数2%、4%、6%；初始pH3.5、4.5、5.5；醋酸菌接种量11%、14%、17%；发酵温度25、28、31 ℃作为正交试验设计水平。

2.3 醋酸发酵正交试验结果

醋酸发酵正交试验结果见表2。

从表2 的极差分析可以看出，4 个因素对复合果醋总酸含量的影响程度依次是C>B>A>D，即乙醇体积分数>初始pH 值>醋酸菌接种量>发酵温度。比较极差得出各因素的最优水平，最佳组合为A1B2C3D1，即菠萝和菠萝蜜复合果醋醋酸发酵最佳工艺条件为醋酸菌接种量11%、初始pH4.5、乙醇体积分数6%、发酵温度28 ℃。在此条件下发酵8 d，总酸含量为（31.92±0.12）g/L。

2.4 挥发性物质分析

通过最优工艺获得的菠萝和菠萝蜜复合果醋（1号醋）；不同原料、相同菌种、相同工艺条件发酵的单菠萝醋（2 号醋）以及相同原料、相同工艺条件、不添加植物乳杆菌发酵的菠萝和菠萝蜜复合果醋（3 号醋），将3 种果醋的挥发性物质与NIST14s.lib 谱库进行比较，相似度高于85%予以保留，鉴定出的挥发性物质种类的数量和质量浓度结果如图7、图8所示。

由图7、图8 可知，1 号、2 号和3 号醋分别鉴定出54、55 种和47 种挥发性化合物，3 种果醋的酯类、酸类和醇类均高于其他类别化合物，是重要的挥发性物质。从种类的数量来看，1 号醋的酯类、萜类比其他两种果醋多，其中，酯类化合物的质量浓度最高，为131 378.41 μg/L，比2 号醋高出36%，比3 号醋高出63%；酚类化合物的数量与2 号醋相同；酸类、醇类、醛类、酮类和其他类型化合物的数量与3 号醋相同。从总质量浓度来看，1 号醋的酯类、醛类化合物远高于其他两种果醋，酸类、酮类、酚类和烷烃类化合物均低于其他两种果醋。

3种果醋挥发性成分鉴定结果见表3。

由表3 可知，多种挥发性物质构成菠萝和菠萝蜜复合果醋的独特风味，含量越高的挥发性物质对风味的影响越大。1 号醋中酯类物质含量较多的是3-羟基丁酸乙酯、乙酸异戊酯；酸类物质含量最多的是乙酸，但较2 号、3 号醋少；醇类物质含量较多的是异戊醇、苯乙醇和异丁醇；此外，苯甲醛、2，4-二叔丁基酚、芳樟醇、环辛四烯等物质的含量也较多。

酯类化合物具有呈香功能，是衡量果醋香气的重要指标之一，由醇和酸的酯化作用形成，阈值低，可增加果醋的芳香气味，如甜香、果香、花香[20]。3-羟基丁酸乙酯是菠萝和菠萝蜜复合果醋中含量最高的挥发性化合物，其由乙酰乙酸乙酯还原而成，而乙酰乙酸乙酯可由乙酸乙酯自缩合反应而成[21]，呈果香、葡萄酒香[22]。由此推测，1 号醋乙酸乙酯含量低于2 号、3 号醋的原因之一是乙酸乙酯变成了乙酰乙酸乙酯，而乙酰乙酸乙酯在酶的催化下转化成3-羟基丁酸乙酯。添加植物乳杆菌与酵母菌、醋酸菌共同发酵果醋能明显提高该酯类的合成能力。辛明等[23]的研究表明3-羟基丁酸乙酯与果汁中的氢过氧化物裂解酶（hydroperoxide lyse，HPL）呈显著正相关。另外，乙酰乙酸乙酯、乙酸己酯、3-羟基丁酸乙酯、异戊酸乙酯、琥珀酸单乙酯仅在1 号醋中检出，异戊酸乙酯呈现菠萝香、甜香；贺书珍等[24]的研究表明，异戊酸乙酯是菠萝蜜的特征香气物质之一；乙酸异戊酯是1 号醋中含量第二多的酯类，具有水果味、香蕉味、青味。乙酸苯乙酯具有玫瑰花香和草莓水果香气；乙偶姻赋予果醋奶油香气和脂香[22]。这些酯类多为乙酯，可能是植物乳杆菌在发酵过程中产生较多有机酸，而有机酸是乙酯的前体物质之一[25]，由此推测，植物乳杆菌的添加对果醋风味的提高有促进作用。

酸类化合物是果醋中重要的化合物，所有酸类均被认为会影响果醋风味[26]，是酯类物质形成的前体物质之一。含量最高的是乙酸，乙酸具有强烈刺激酸味，余味短，且1 号醋的乙酸含量比2 号、3 号醋少；辛酸、己酸和癸酸也是主要的挥发性酸，辛酸属于中链脂肪酸，有水果香气，可作为食用香料。3-甲基戊酸属于属于食用香料之一，具有青香，1 号醋中的3-甲基戊酸高于2 号醋，而在3 号醋未检出。

醇类化合物也是果醋中含量最多的挥发性物质之一，赋予果醋重要风味，可被氧化成醛类、酸类等物质，也是酯类化合物的前体物质之一[27]，醇类物质中含量最多的是异戊醇、苯乙醇、异丁醇，与何宇宁等[15]、Zhang 等[28]的研究结果一致。异戊醇具有干邑香、果香、香蕉味，异丁醇具有威士忌香，苯乙醇具有典型的玫瑰香和蜂蜜香[22]。其中，添加植物乳杆菌发酵的1 号、2 号醋中异戊醇、异丁醇的含量均比3 号醋高。1 号、3 号醋中的2，3-丁二醇含量高于2 号醋，由此说明该物质来源于菠萝蜜本身的果香。

醛类、酮类化合物较少，适量醛类化合物可以提高果醋的香气，3 种果醋中的苯甲醛含量均最高，且1 号醋高于2 号、3 号醋，该物质具有宜人的坚果香[22]。1 号醋的其他醛类、酮类物质的含量比2 号、3 号醋少。

果醋中还检测出酚类化合物、芳烃类、萜类和烷烃类等其他含量较少的挥发性化合物，甘菊环具有芳香风味，而萜品则带来苦味，ɑ-松油醇、香茅醇、橙花叔醇和芳樟醇等萜类化合物具有酸香、果香[29]，虽然这些挥发性物质含量较少，但是与其他风味物质协同，对总体香气具有辅助作用，为果醋带来更丰富的香气。

3 结论

为进一步丰富复合果醋的种类，提升果醋的香气，对混合原料和混合菌种2 个方面进行研究。以菠萝和菠萝蜜为原料，以植物乳杆菌、酿酒酵母、醋酸菌为发酵菌种，采用单因素和正交试验对复合果醋进行发酵工艺优化，利用HS-SPME-GC-MS 测定分析菠萝和菠萝蜜复合果醋的挥发性物质。结果表明，最优工艺条件为菠萝与菠萝蜜体积比6∶4，在醋酸发酵阶段，初始pH4.5、乙醇体积分数6%、醋酸菌接种量11%、发酵温度28 ℃，发酵8 d 后的总酸含量（以乙酸计）达到31.92 g/L。进一步对挥发性物质进行分析，菠萝和菠萝蜜复合果醋中共检测出54 种挥发性物质，主要挥发性物质有乙酸、3-羟基丁酸乙酯、乙酸异戊酯、异戊醇、苯乙醇和苯甲醛等。与单菠萝醋、不添加植物乳杆菌的菠萝和菠萝蜜复合果醋进行比较，添加植物乳杆菌的菠萝和菠萝蜜复合果醋含有更多的醛类和酯类，并且挥发性酸类有所降低。对菠萝和菠萝蜜复合果醋的发酵工艺和挥发性物质进行研究，为复合果醋的开发提供参考依据。

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Fermentation Technology and Volatile Substances of Compound Vinegar of Pineapple and Jackfruit

YAN Shaobo1，HUANG He1，2*，CHEN Ju1
（1.College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，Guangdong，China；2.Guangdong Provincial Science and Technology Innovation Center for Subtropical Fruit and Vegetable Processing，Zhanjiang 524088，Guangdong，China）

Abstract：To further enrich the types of compound fruit vinegar and enhance the aroma of fruit vinegar，pineapple and jackfruit were used as raw materials for multi-strain mixed fermentation.With total acidity and the sensory score of vinegar as indicators，single-factor and orthogonal experiments were used to optimize the fermentation conditions，and headspace solid-phase microextraction（HS-SPME）combined with gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）was used to analyze the volatile substances of compound vinegar of pineapple and jackfruit.The results showed that the optimal process conditions were as follows：the volume ratio of pineapple to jackfruit of 6∶4，the initial pH of 4.5，the volume fraction of ethanol of 6%，the inoculum of acetic acid bacteria of 11%，and the fermentation temperature of 28 ℃in the acetic acid fermentation stage.After 8 days of fermentation under these conditions，the total acidity（in acetic acid）of the final pineapple-jackfruit compound vinegar was 31.92 g/L.The volatile substances were further identified and a total of 54 volatile substances were detected，including acetic acid，ethyl 3-hydroxybutyrate，isopentyl acetate，isoamyl alcohol，phenethyl alcohol，and benzaldehyde.The fermentation process and volatile substances of compound vinegar of pineapple and jackfruit were investigated to provide a reference for the development of the compound fruit vinegar.

Keywords：pineapple；jackfruit；compound vinegar；optimization of fermentation process；headspace solidphase microextraction（HS-SPME）；gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）

DOI：10.12161/j.issn.1005-6521.2024.11.018

基金项目：广东省科技计划项目（2015A020209165）

作者简介：颜韶波（1997—），女（汉），硕士研究生，研究方向：食品加工与安全。

*通信作者：黄和（1962—），男（汉），教授。

引文格式：颜韶波，黄和，陈菊.菠萝和菠萝蜜复合果醋发酵工艺及挥发性物质分析[J].食品研究与开发，2024，45（11）：143-151.

YAN Shaobo，HUANG He，CHEN Ju.Fermentation Technology and Volatile Substances of Compound Vinegar of Pineapple and Jackfruit[J].Food Research and Development，2024，45（11）：143-151.

加工编辑：张昱

收稿日期：2022-12-21