虾青素（astaxanthin，AST）是一种脂溶性酮式类胡萝卜素，分子式为C40H52O4，含有11 个共轭双键、2 个β-紫罗兰酮环和羟基[1]，纯品为浅紫红色晶体物质[2]，属于极疏水的脂溶性物质，易溶于氯仿、二氯甲烷等有机溶剂。在自然界中，AST 广泛存在于微生物、藻类、植物和水生动物中，其中，最常见的来源是雨生红球藻和红法夫酵母[3]。AST 因其着色能力强[4]且具有抗氧化[5]、抗炎[6]、抗癌[7]、神经保护[8]、增强免疫力和抗衰老[9-10]等多种生理活性功效，被广泛应用于食品、饲料和医药领域。
AST 水溶性较差，被吸收进入人体的循环效率较低，且极不稳定，易受到不利环境因素的影响，在高温、辐射、氧气、碱性或酸性溶液条件下易被破坏[11]，这大大降低了其生物利用度，严重制约了其在功能性食品、医药产品、化妆品等行业的应用。有研究采用脂质体[12]、乳液[13]、微胶囊化[14]、纳米包封技术[15]等稳态化运载体系来改善AST 的水溶性和稳定性。然而，这些方法大多操作繁琐、制备条件严苛且受到制备过程中材料的生物相容性、生物可降解性等问题制约。对AST 的分子结构进行适当的修饰不仅有助于提高其水溶性、稳定性以及结合蛋白的能力，且过程简单、生物相容性好。
对AST 进行结构修饰的方式主要有化学结构异构、与亲水性脂肪酸、两亲分子或极性基团偶联等，其中最常见的修饰手段是酯化修饰。Pechinskii 等[16]利用Novozym 435 脂肪酶分别催化叶黄素、AST 与苯甲酸、4-甲基苯甲酸、烟碱酸和扁桃酸等有机酸酯化，通过分子对接验证了叶黄素苯甲酸酯和叶黄素烟碱酸酯与视网膜蛋白的结合能力要强于游离型叶黄素，从而有望提高叶黄素治疗年龄相关性黄斑营养不良的生理活性；Yang 等[17]利用碳二亚胺盐酸盐和4-二甲基氨基吡啶（4-dimethylaminopyridine，DMAP）作为催化剂催化合成了14 种连有不同碳链长度和饱和度有机酸的虾青素酯，以消化模型实验和血清中AST 浓度作为评价手段，证明虾青素酯的结构可显著影响其稳定性和生物利用度；Lockwood 等[18]和Gross 等[19]以DMAP 为催化剂合成虾青素二琥珀酸二钠盐（CardaxTM），研究表明该衍生物的水溶性和在心脏保护方面的生理活性均优于游离形式虾青素；Fukami 等[20]和Nakao 等[21]采用化学法和生物酶法催化合成虾青素正辛酸酯，研究表明，虾青素正辛酸酯的吸收利用度高于游离虾青素，除此之外，研究还发现虾青素正辛酸二酯有助于增加碳水化合物摄入的分解代谢，降低血糖水平和缓解胰岛素抵抗[22]。Qiao 等[23]利用AST 和琥珀酸酐合成了虾青素琥珀酸二酯，研究表明虾青素琥珀酸二酯比未酯化的AST 具有更高的热稳定性。在此研究基础上，采用化学催化法将虾青素琥珀酸二酯与极性基团聚乙二醇通过酯键连接，形成的虾青素聚乙二醇琥珀酸酯偶联物的亲水性得到了显著提升[24-25]。目前，对AST 进行酯化修饰的研究多采用化学法，相对绿色温和的生物酶未能在该领域得到充分利用；采用新型的酰基供体对AST 酯化修饰的报道较少，且大多未能进一步对AST 衍生物的合成条件进行优化。
戊二酸酐（glutaric anhydride，GA）是一种具有六元环状结构、化学活性较高的二元羧酸酐，相比已用于AST 酯化修饰的琥珀酸酐更加稳定，且更加绿色环保[26]。目前通过GA 酯化修饰AST 的相关研究较少。本研究为提高虾青素的水溶性，以前期挖掘的酯酶Est3-14为生物催化剂，催化GA 和AST 的酯化反应，制备了一种新型虾青素衍生物——虾青素戊二酸酯（astaxanthin glutarates，AG），通过单因素试验优化确定AG 酶法合成的最优条件，并验证其水溶性优势，以期为通过分子修饰法改善AST 的水溶性和稳定性提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
BL21/Est3-14 菌株：海洋食品生物技术实验室保藏；游离虾青素、戊二酸酐：北京索莱宝科技有限公司；4-硝基苯酚丁酸酯（p-nitrophenol butyrate，p-NPB，≥98%）：美国Sigma 化学公司；甲醇（色谱级）：上海麦克林生化科技股份有限公司；三氯甲烷、二甲基亚砜、石油醚、正己烷、N，N-二甲基甲酰胺、十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；薄层层析硅胶板（GF254）：德国默克公司。
1.2 仪器与设备
电子天平（PL203）：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；生化培养箱（SPX）：宁波市科技园区新江南仪器有限公司；高压灭菌锅（JI80TW）：致微（厦门）仪器有限公司；生物净化台（BCM-1000）：苏州净化设备有限公司；恒温摇床（QYC2112）：上海福玛实验设备有限公司；恒温水浴锅（DK-98-1）：天津市泰斯特仪器有限公司；冷冻离心机（5804R）：德国艾本德股份公司；超声破碎仪（SCIENTZ-IID）：宁波新芝生物科技股份有限公司；高效液相色谱仪（LC-20A）：日本岛津公司；涡旋振荡器（MX-S）：大龙兴创实验仪器（北京）股份公司；全波长酶标仪（Multiskan FC）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；真空冷冻干燥机（FD5-3）：阿自倍尔泰事达机电设备（上海）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 虾青素戊二酸酯的合成
1.3.1.1 酯酶Est3-14 粗酶粉的制备
根据参考文献[27]中酯酶Est3-14 粗酶粉的制备方法，发酵、离心（8 000 r/min、4 ℃、20 min）后收集菌体，加水重悬后超声破碎直至菌体破裂，离心（8 000 r/min、4 ℃、20 min）除去细胞碎片后将破碎上清液在真空冷冻干燥机中进行冻干得到粗酶粉。
1.3.1.2 酯酶Est3-14 粗酶粉活性测定
使用p-NPB 对Est3-14 粗酶粉进行酶活测定。取一定量的粗酶粉加水复溶，得到已知浓度的粗酶液。向反应后体系中加入10 μL 粗酶液、490 μL pH8.0 的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐[tris（hydroxymethyl）aminomethane hydrochloride，Tris-HCl]缓冲液和20 μL p-NPB，40 ℃反应5 min，使用480 μL 1%的SDS 终止反应。取200 μL 反应液于96 孔板中，在405 nm 测定吸光度。根据对硝基苯酚（p-nitrophenol，p-NP）标准曲线计算酶活。
酯酶酶活单位（U）的定义：在一定的反应条件下，每分钟水解底物释放1 μmol p-NP 所需的酶量定义为一个酶活单位，即1 U。
1.3.1.3 虾青素戊二酸酯的酯化合成体系
向棕色具塞三角瓶中添加0.5 mg AST，按照AST 与GA 摩尔比为1∶2 000 的比例添加GA，加入2 mL 反应溶剂，充入氮气后立即密封，并在瓶口处缠绕一圈封口膜密封以隔绝空气，40 ℃、200 r/min 条件下反应12 h。
1.3.2 虾青素戊二酸酯的检测
1.3.2.1 薄层层析色谱（thin layer chromatography，TLC）检测
采用氮吹的方式浓缩样品，以三氯甲烷∶甲醇∶水（85∶10∶1，体积比）作为展开剂，通过薄层层析色谱分析生成的虾青素酯衍生物。
各个衍生物的保留因子（retention factor,Rf）为衍生物的迁移距离（起始线至斑点的垂直距离）与起始线至溶剂前端的垂直距离之比，计算公式如下。
式中：R 为保留因子；la 为衍生物的迁移距离，cm；l0 为起始线至溶剂前端垂直距离，cm。
1.3.2.2 高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）检测
流动相：甲醇；色谱柱：Sepachrom-TCM C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；检测器：紫外检测器，检测波长475 nm；流速：1 mL/min；柱温：35 ℃；样品用等体积甲醇稀释一倍，进样量设置为10 μL。AST 酯化率（Z，%）、虾青素戊二酸单酯（astaxanthin glutarate monoester，AGM）产率（CM，%）、虾青素戊二酸二酯（astaxanthin glutarate diester AGD）产率（CD，%）计算公式如下。
式中：AAST 表示游离虾青素的峰面积；AAGM 表示虾青素戊二酸单酯的峰面积；AAGD 表示虾青素戊二酸二酯的峰面积。
1.3.2.3 质谱（mass spectrum，MS）条件
电喷雾检测器（electrospray ionization detector，ESI）；正离子扫描模式；干燥气温度350 ℃；干燥气流速5 L/min；蒸发室温度400 ℃；雾化气压力2.76×105 Pa；毛细管电压4 500 V；流速1 mL/min；质谱采集范围m/z 100～1 200。
1.3.3 虾青素戊二酸酯水溶性成分检测
首先按照1.3.1.3 的体系发生反应。反应结束后，向反应液中加入等体积的水，以溶解反应液中的酶粉和剩余未参加反应的底物GA，反应混合液在8 000 r/min下离心分层，收集含有底物AST 及产物AG 的有机相，氮吹除去溶剂，得到AG 粗提物。精确称取0.5 mg 的AG 粗提物和等质量的游离AST 粉末于离心管中，加入500 μL 去离子水，振荡混匀后在室温下静置，观察游离AST 与AG 在水中的溶解情况，除去不溶性物质后用HPLC 分别检测可溶性组分。
1.3.4 Est3-14 催化合成虾青素戊二酸酯条件优化
为探究Est3-14 催化合成AG 的最优条件，对反应溶剂（二甲基甲酰胺、正己烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、丙酮、石油醚）、反应温度（30～60 ℃，每隔5 ℃设置一个梯度）、底物摩尔比（AST 与GA 摩尔比=1∶2 000～1∶10 000，每隔1∶1 000 设置一个梯度）、加酶量（20～120 U，每隔20 U 设置一个梯度）、反应时间（0～48 h，间隔取样）进行优化，确定AG 酶法合成的最优条件。
1.4 数据处理
每组数据至少采用3 组平行，数据表示为平均值±标准差，采用Origin 2018 软件进行数据统计和图片处理。
2 结果与分析
2.1 虾青素戊二酸酯的合成结果
根据底物AST 和GA 的结构特点，推测酯化路径如图1所示。
图1 AG 的酶法合成路径
Fig.1 Enzymatic synthesis route of astaxanthin glutarates
由图1 可知，GA 的环状结构被打开并在两端形成羧基，即形成戊二酸，其上的羧基通过酯化作用与AST末端六元环上的活性羟基耦合，由此形成虾青素酯。若一分子AST 上结合一分子的戊二酸则形成AGM，若一分子虾青素两端各结合上一分子的戊二酸则形成AGD。
2.2 虾青素戊二酸酯的检测分析
2.2.1 TLC 检测
酯化反应前后的薄层层析色谱图见图2。
图2 酯化反应前后的薄层层析色谱图
Fig.2 Thin-layer chromatography before and after esterification
A.游离虾青素；B.Est3-14 酯化后粗提物。
由图2 可知，发生酯化反应后，Rf 值为0.8 的游离AST 斑点变淡，而出现了Rf 值在0.64 左右且很相近的两个斑点。根据底物的结构特点分析，初步判断这两个斑点可能是游离AST 与GA 酯化生成的AGM 和AGD，TLC 结果显示这两种物质的极性较游离AST 更大，极性增大的原因可能是游离AST 连接GA 后，GA解链暴露出羧基端[28]，因此，进一步推断AGD 的极性大于AGM，斑点中靠下的斑点为AGD。
2.2.2 HPLC 检测结果
Est3-14 催化虾青素和戊二酸酐酯化反应产物的高效液相色谱检测结果如图3所示。
图3 Est3-14 催化虾青素和戊二酸酐酯化反应产物的高效液相色谱检测
Fig.3 Detection of esterification products of astaxanthin and glutaric anhydride catalyzed by Est3-14 by high performance liquid chromatography
由图3 可知，AST 的保留时间是4.63 min，经过酶制剂的催化后部分转化为在3.90 min 出峰的AGM 和在3.32 min 出峰的AGD，极性增大，与TLC 得出的结论一致，产物中也存在一些未验证的峰，可能反应过程中产生副产物虾红素或异构化虾青素等杂质。
2.2.3 （ESI）MS 检测虾青素戊二酸酯
为验证生成的虾青素衍生物的结构，研究通过（ESI）MS 进一步鉴定两种衍生物的结构，结果如图4所示。
图4 虾青素戊二酸单酯和虾青素戊二酸二酯的质谱图谱
Fig.4 Mass spectrometry of astaxanthin glutarate monoester and astaxanthin glutarate diester
由图4 可知，m/z 711.424 6 为AGM 质子化准分子离子峰，m/z 728.467 2 为（[C45H58O7]+NH4）+，即AGM结合一个铵根离子所得到的离子峰，证明AGM 成功合成；m/z 825.457 3 为AGD 质子化准分子离子峰，m/z 842.453 9 为（[C50H64O10]+NH4）+，即AGD 结合一个铵根离子所得到的离子峰，证明AGD 成功合成。
2.3 虾青素戊二酸酯水溶性验证
AST 与AG 水溶性观察和HPLC 检测见图5。
图5 AST 与AG 水溶性观察和HPLC 检测
Fig.5 Water solubility and high performance liquid chromatography of astaxanthin and astaxanthin glutarates
（a）水溶性观察；（b）HPLC 检测。
由图5（a）可知，游离AST 粉末在水中不溶解，呈现出粉末颗粒状，分散不均匀。相同质量的反应混合物在水中分散均匀，呈现出淡红色，不溶性固体状物质基本消失。这证明GA 结合在AST 上显著提高了其在水中的溶解度。采用HPLC 进一步检测AST 和AG 水溶液上清液中的物质组分，如图5（b）所示，溶解游离AST 粉末的上清液中没有AST 的特征峰存在。溶解反应粗提物的上清液中可以清楚地看到AGD、AGM的特征峰，同时存在一些未验证的峰，可能是较高温度下产生的反应副产物虾红素或异构化虾青素等杂质[29]。由此可证明AG 的水溶性显著强于AST。
2.4 虾青素戊二酸酯合成反应条件优化
为了进一步拓宽后续对AG 的研究和应用，对AG的合成条件进行考察，从而确定合成AG 的最佳工艺条件。研究表明酶法催化合成虾青素酯受反应温度、底物摩尔比、加酶量、反应时间等多种因素的影响[21]，因此，本研究采用单因素试验对AG 的合成条件进行优化，提升AG 的产率。
2.4.1 反应溶剂对虾青素戊二酸酯合成的影响
选择合适的有机溶剂作为反应溶剂不仅可以促进底物AST 和GA 的分散，使底物之间反应更充分，还能增强脂肪酶的刚性构象，提高脂肪酶耐热性并最大限度保留其催化活力[30]。选用二甲基甲酰胺、正己烷、三氯甲烷、丙酮、二甲基亚砜和石油醚作为反应溶剂，以HPLC 结果显示的AGM 和AGD 总酯峰面积作为衡量指标，比较不同有机溶剂作为反应溶剂时，产物AG 的产量变化，结果如表1所示。
表1 反应溶剂对AG 合成的影响
Table 1 Effect of reaction solvent on synthesis of astaxanthin glutarates
溶剂二甲基甲酰胺正己烷三氯甲烷丙酮二甲基亚砜石油醚总酯峰面积/mAU 930 500±105 110 0 2 656 100±291 360 290 230±780 2 191 280±110 320 0
由表1 可知，以三氯甲烷作为反应溶剂时，AG 的产量最高，以正己烷和石油醚作为反应溶剂时，AG 的合成反应不能正常进行。Yang 等[25]在合成聚乙二醇羧甲基虾青素单酯时也得出了相似的结论，即以氯仿作为反应溶剂时催化效率最高，且合成反应不能在正己烷溶剂中进行。因此，选用三氯甲烷用作AG 的反应溶剂。
2.4.2 反应温度对虾青素戊二酸酯合成的影响
反应温度对虾青素戊二酸酯合成的影响见图6。
图6 反应温度对AG 合成的影响
Fig.6 Effect of temperature on synthesis of astaxanthin glutarates
由图6 可知，反应12 h 所生成的主要产物为AGM，而AGD 产量较低。已知Est3-14 水解p-NPB 的最适温度为60 ℃[27]，当温度低于50 ℃时，随着反应温度的升高，AG 的产量逐渐提高，这可能是由于酶制剂的活性以及反应底物的溶解度随着温度的升高而提高[31]，在50 ℃时AG 的产量达到最高。而当反应温度在50～60 ℃时，由于反应温度过高，AST 可能出现部分降解和异构化，致使AG 产量下降。因此，50 ℃为AG合成的最适反应温度。
2.4.3 底物摩尔比对虾青素戊二酸酯合成的影响
底物摩尔比对虾青素戊二酸酯合成的影响见图7。
图7 AST 与GA 摩尔比对AG 合成的影响
Fig.7 Effect of mole ratio on synthesis of astaxanthin glutarates
底物摩尔比是影响虾青素转化率的关键因素。由于AST 价格昂贵，为节约成本，酯化反应过程中，应提高GA 的添加，从而最大限度地提高AG 的产量。由图7 可知，当底物摩尔比介于1∶2 000 和1∶4 000 时，AG 的产量随GA 添加量的增加而升高，当摩尔比达到1∶4 000 时，AG 产量达到最高，而后随着GA 添加量的继续增加，AG 的产量降低，这可能是因为随着戊二酸酐的占比的增加，反应体系酸性增强，抑制了Est3-14的酶活，反应效率降低。AG 的组成也受摩尔比的影响，GA 添加量较低时，产物以AGM 为主，GA 添加量较高条件下，AGD 才会实现较多的积累。尹春华等[32]在研究酶法合成虾青素琥珀酸酯时有相似的发现，即底物摩尔比在1∶40～1∶100 时产物为均一的虾青素琥珀酸单酯，当底物摩尔比为1∶150 以上时才有双酯产生，并且随琥珀酸占比的增加，产物组成中双酯含量增多。这表明AG 的合成过程可能是一个串联反应过程，AST 末端羟基先与一分子GA 结合生成AGM，在过量GA 作用下另一端的羟基继续与一分子GA 酯化，最终形成AGD。AST 与GA 最优摩尔比为1∶4 000。
2.4.4 加酶量和反应时间对虾青素戊二酸酯合成的影响
反应进程会随加酶量和反应时间的变化而变化，研究其变化规律有利于提升产物合成效率，从而以最短的时间合成尽可能多的产物，用于工业生产时可有效减少资源的浪费、提高生产效率。加酶量和反应时间对虾青素戊二酸酯合成的影响见图8、图9。
图8 酯化率随加酶量和反应时间变化
Fig.8 Effect of enzyme dosage and reaction time on esterification
图9 加酶量为100 U 时酯化反应随反应时间变化
Fig.9 Effect of reaction time on esterification with the enzyme addition of 100 U
如图8所示，当加酶量为20～80 U 时，酯化速率较低，AST 酯化率随着时间的延长缓慢增长。当加酶量达到100 U 时，底物与酶粉充分接触，初始酯化速率大大提高，当反应时间超过24 h 时，酯化率趋于稳定。当加酶量进一步增加，达到120 U 时，AST 酯化率无明显提升，这可能是因为过量的酶粉在反应体系中分散性不好，不能进一步参与底物的催化。综合考虑成本因素，最优加酶量为100 U。
如图9所示，加酶量为100 U 时，随着反应的进行，酯化率以及AGD 的产率整体呈现出先上升后逐渐稳定的趋势，AGM 的产率整体呈先升高后降低的趋势，这可能是因为反应初始阶段，AST 先与一分子GA合成AGM，AGM 含量逐渐增多，随着反应的进行，AGM 与一分子GA 进一步酯化形成AGD，AGM 减少，而AGD 产率和酯化率呈现出上升趋势。最终在反应时间为48 h 时，AST 酯化率可达75.8%，其中AGM 和AGD 的产率分别为29.9%、45.9%。
3 结论
本研究采用酯酶Est3-14 粗酶粉在有机溶剂介质中催化AST 与GA 发生酯化反应，成功合成了一种新型亲水性虾青素衍生物——AG。相比于常见的化学催化法，本研究采用的生物酶法具有绿色、温和的特点，有助于保护虾青素的结构和色泽，开发前景较好。研究采用色谱和质谱手段验证了AG 的结构，证明了AG 暴露的羧基端可显著提高虾青素的水溶性。采用单因素试验优化了AG 的合成条件，使AG 的产率达到75.8%，提供了高效合成AG 的技术手段，有助于进一步研究该衍生物的生物利用度和生理活性。本研究合成的AG 有待进一步提纯，其生物利用度和生物活性也有待进一步探究。
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