乳酸菌是指一大类可以发酵碳水化合物产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌。早期乳酸菌常被人们认为与食品酿造有关，比如保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、植物乳杆菌等。然而随着研究的深入，有研究发现许多乳酸菌还是肠道菌群的成员，在维持肠道益生和宿主健康中发挥着举足轻重的作用，被认为是一类重要的益生菌[1]。当前，人们已经广泛认可利用食品基质向人体胃肠道输送乳酸菌的方式，这种方式在维持人体健康中发挥着重要作用[2]。相关报道也证实了口服乳酸菌可以增加人体内的益生菌群丰度，减少致病菌数量，调节患有肠道疾病人群的肠道菌群结构趋向健康人群，有效改善便秘和腹泻等症状[3-5]。
有研究报道某些碳水化合物（益生元）不被肠胃所消化吸收，但可被肠道中的益生菌利用，能提高肠道中益生菌群的数量，比如短链低聚果糖、低聚果糖和菊粉等益生元可以刺激肠道内源性乳酸菌（双歧杆菌、乳酸杆菌）的生长，只需要短暂的喂养就能在粪便中占主导地位[6-7]。常见的益生元包括低聚果糖、低聚半乳糖、菊粉等低聚糖类，但是多糖、多酚和多肽等有生物活性的物质也能够作为潜在益生元使用，魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）就是其中一种[8]。KGM 是源自于魔芋块茎的一种由葡萄糖和甘露糖以β-1，4-糖甘键连接而成的多糖，于1994年被美国食品药品管理局批准为可用于食品的添加剂，目前广泛用于制作面条、豆腐等食物[9]。除能够应用于食物，KGM 具有缓解便秘、预防肥胖、降血糖、抗癌等益生性作用，但存在聚合度高、黏度大、不易消化等问题，因而KGM 作为益生元使用有必要降低聚合度[10]。聚合度（degrees of polymerization，DP）是指聚合物大分子链上所含重复单元数目的平均值，是衡量聚合物分子大小的指标。聚合度对乳酸菌增殖的影响目前尚无定论，有研究认为DP≤10 的低聚糖对乳酸菌有较好的增殖效果[11]。然而，Ho 等[12]研究结果表明聚合度为4～64 的木聚糖中低聚合度（DP4～14）组分对粪便中双歧杆菌的益生效果较好，伹效果最佳的并不是DP4 的低聚木聚糖，而是DP14。Moniz 等[13]也发现用DP4～6 和DP9～21 的木聚糖混合物对双歧杆菌的增殖效果与DP2～6 的商业木聚糖相似。此外，不同聚合度的聚糖对不同种类乳酸菌增殖效果也有着差异性。Ito 等[14]探讨了菊粉果聚糖的聚合度与盲肠乳酸菌数量的关系，发现DP4、DP8 和DP16 的菊粉果聚糖中乳酸菌总数较高，而DP8、DP16 和DP23 的菊粉果聚糖中双歧杆菌较高。Ozturkoglu-Budak 等[15]研究高DP 值（DP≥23）和低DP值（DP≤10）菊粉对嗜酸乳杆菌La-5 和动物双歧杆菌Bb-12 活性的影响，发现两种菌株与任意DP 的菊粉一起使用时活力都得到提升。由此，推测DP>10 的聚糖也可能有较好的益生活性，但是该规律是否适用于KOGM，不同聚合度KOGM（DP>10）对乳酸菌的体外益生作用是否相同，以及聚合度相近的KOGM 对不同乳酸菌的体外益生作用是否存在差异等研究鲜见。
本研究通过β-甘露聚糖酶将KGM 酶解成聚合度不同的魔芋葡甘低聚糖（konjac oligoglucomannan，KOGM），通过红外和扫描电子显微镜等对KOGM 结构进行表征，然后将KOGM 作为唯一碳源培养乳酸菌，分别测定发酵液中乳酸菌光密度（optical density，OD）值、上清液pH 值和发酵消耗的总糖含量以及分析短链脂肪酸的产生情况，以期为系统解决上述问题、促进KOGM 科学应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料和试剂
青春双歧杆菌（ATCC15705）、长双歧杆菌（ATCC 15697）、干酪乳杆菌（ATCC15008）、植物乳杆菌（ACCC11095）、鼠李糖乳杆菌（ATCC7469）：湖北省襄阳市公共检验检测中心；魔芋精粉（食品级）：湖北强森魔芋科技有限公司；β-甘露聚糖酶（10 000 U/g）、乙酸、丙酸、正丁酸、2-乙基丁酸标准溶液、甲基叔丁基醚、正己烷（均为色谱级）：上海源叶生物技术有限公司；酿酒酵母：安琪酵母有限公司；牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、磷酸氢二钾、乙酸钠、柠檬酸三铵、硫酸镁、硫酸锰、吐温80、氢氧化钠、3，5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、苯酚、无水亚硫酸钠、浓硫酸、浓盐酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
乳酸细菌培养基（de Man，Rogosa and Sharpey medium，MRS）：蛋白胨10.0 g/L，牛肉浸出物5.0 g/L，酵母提取物4.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，磷酸氢二钾2.0 g/L，乙酸钠5.0 g/L，柠檬酸三铵2.0 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.05 g/L，吐温80 1.0 g/L，pH6.5。sMRS 培养基为不添加葡萄糖的MRS 培养基。
1.2 仪器与设备
紫外可见分光光度计（TU1900）：北京普析通用仪器有限责任公司；冷冻干燥机（Christ alpha 1-2 LD plus）：德国Marin Christ 公司；静态流变仪（R/S plus）：美国博勒飞公司；傅里叶红外光谱仪（IR-960）：天津瑞岸科技有限公司；扫描电子显微镜（VEGA3）：泰思肯（中国）有限公司；气相色谱质谱联用仪（EXPEC5231）：杭州谱育科技发展有限公司；集热式恒温加热磁力搅拌器（DF-101S）：上海科升仪器有限公司；pH 计（PB-10）：德国赛多利斯集团公司。
1.3 试验方法
1.3.1 不同聚合度KOGM 的制备
参考常晓艳[16]的方法进行适当修改。取4 g 魔芋精粉缓慢溶于200 mL、50 ℃纯水中，200 r/min 搅拌5 min 制成魔芋葡甘聚糖溶液。利用集热式恒温加热磁力搅拌器将200 mL 魔芋葡甘聚糖溶液加热至65 ℃，加入底物质量的0.1%的β-甘露聚糖酶，200 r/min开始酶解反应。分别于0、1、24 h 取样，标记为KGM、KOGM-M、KOGM-L1。将酶解样品立即煮沸15 min，10 000 r/min 离心10 min，取上清分别用3，5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法和苯酚硫酸法测定还原糖和总糖含量。为保证魔芋葡甘聚糖能被充分酶解，另取200 mL 魔芋葡甘聚糖溶液在相同条件下加入底物质量的10% 的β-甘露聚糖酶，200 r/min 开始酶解反应，24 h 取样（标记为KOGM-L2）测定还原糖和总糖含量，计算酶解液的聚合度。还原糖标准曲线方程y=1.064x-0.018，浓度范围为0～0.5 mg/mL；总糖标准曲线方程y=1.514x+0.025，浓度范围为0～0.5 mg/mL。KGM、KOGM-M、KOGM-L1、KOGM-L2 中加入0.5% 的活化酿酒酵母液，28 ℃、200 r/min 培养，分别于0、6、12、18、24 h 测发酵液中还原糖含量，待还原糖稳定后停止发酵，得到魔芋葡甘低聚糖溶液。将经过酵母发酵除单糖后的发酵液于7 000 r/min 离心10 min，取上清液，121 ℃灭菌15 min。灭菌液经冷冻干燥机冻干，即得到不同聚合度的魔芋葡甘低聚糖，将低聚糖装入真空袋中抽真空备用。平均聚合度计算公式如下。
D=ST/SR
式中：D 为平均聚合度；ST 为总糖含量，mg；SR 为还原糖含量，mg。
1.3.2 不同聚合度KOGM 的结构表征
1.3.2.1 黏度的测定
将样品KGM、KOGM-M、KOGM-L1、KOGM-L2 冻干粉末按照2% 的质量浓度进行配制，在室温（25±1）℃下，采用静态流变仪测量黏度，采用RCT 50-1 平板转子，平板与底座间距0.1 mm，剪切速率0.6 s-1。
1.3.2.2 红外光谱分析
分别称取样品KGM、KOGM-M、KOGM-L1、KOGML2 粉末约5 mg，与干燥KBr 于研钵中研碎后压片处理，利用傅里叶红外光谱仪在4 000～400 cm-1 范围内扫描，记录扫描光谱数据。
1.3.2.3 扫描电镜分析
采用扫描电子显微镜观察低聚糖表面结构。将样品粉末均匀附着于样品台上，真空镀金，扫描样品，分别于30×和500×放大倍数下观察样品表面形态。
1.3.3 不同聚合度KOGM 的体外益生功能评价
1.3.3.1 促进乳酸菌生长
将5 株乳酸菌分别按质量比1% 接入MRS 培养基，充分混匀后，于厌氧条件下37 ℃静置培养24 h 进行菌种活化。将KGM、KOGM-M、KOGM-L1、KOGM-L2作为唯一碳源添加到sMRS 培养基中，使质量浓度达到1%，然后按0.5%的接种量分别接入5 种活化好的乳酸菌，37 ℃静置培养24 h 后测定发酵液OD600 值。以相同浓度的菊糖和葡萄糖作为阳性对照。
1.3.3.2 pH 值和总糖含量的测定
取发酵液于7 000 r/min 离心10 min，取上清液用pH 计测pH 值，用苯酚硫酸法测总糖含量。
1.3.3.3 发酵液短链脂肪酸含量测定
短链脂肪酸的测定参照文献[17-18]的方法进行并适当修改。吸取0.1 mL 发酵液，先加入100 mg/L 2-乙基丁酸（内标）0.1 mL，再加入0.1 mL 5 mol/L 盐酸酸化，然后加入体积比为1∶1 的甲基叔丁基醚和正己烷的第一萃取液0.4 mL，涡旋振荡混匀，继续加入正己烷0.3 mL，再次涡旋振荡混匀。混合液于4 ℃、10 000 r/min 离心5 min，取上清液加入少量无水硫酸钠去除水分，过0.22 μm 有机滤膜上机。
取乙酸、丙酸、正丁酸分别配制5～200 μg/ mL 的混标，加入内标2-乙基丁酸，至终浓度为10 μg/mL。以短链脂肪酸浓度为横坐标，以短链脂肪酸与内标峰面积比值为纵坐标绘制标准曲线，得到标准曲线方程见表1。
表1 短链脂肪酸标准曲线方程
Table 1 Standard curve equation of short-chain fatty acids
短链脂肪酸乙酸丙酸正丁酸保留时间/min 7.82 9.64 11.59定量离子43 73 73标准曲线方程y=0.046 9x+0.250 5 y=0.033 4x+0.100 7 y=0.050 5x+0.287 8 R2 0.998 0 0.994 8 0.996 8
气相色谱质谱联用仪采用ZKAT-FFAP 毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），进样口温度230 ℃，进样量1 μL，分流比10∶1；载气为高纯氦气，柱流量1 mL/min；色谱柱初始温度90 ℃维持2 min，以5 ℃/min速率升温至180 ℃维持1 min，再以30 ℃/min 升温至230 ℃。质谱采用单四极杆质谱，单离子检测扫描（single ion monitoring，SIM）采集模式，电子电离源（electron ionization，EI），离子化电压为70 eV，离子源温度200 ℃，气相色谱（gas chromatography，GC）接口温度240 ℃，溶剂延迟7 min。
1.4 数据分析
试验中所有处理均采用3 个重复，采用Minitab 14软件进行单因素方差分析，以P<0.05 表示差异显著，以P<0.01 表示差异极显著。
2 结果与分析
2.1 酶解后制备工艺对KOGM 聚合度的影响
为考察酶解后的制备工艺过程对KOGM 聚合度的影响，分别测试酶解后、去除单糖后、离心后和灭菌后酶解液的聚合度，结果见表2。
表2 制备工艺过程对KOGM 聚合度的影响
Table 2 Effect of preparation process on the polymerization degree of KOGM
样品KGM酵母发酵KOGM-M KOGM-L1 KOGM-L2酶解27.13±1.03 17.89±0.43 12.89±0.36 11.13±0.36 6 h 26.46±0.96 17.52±0.34 13.20±0.52 11.70±0.35 12 h 26.79±1.05 17.71±0.45 13.26±0.47 11.83±0.47 18 h 26.37±0.91 17.63±0.22 13.12±0.48 11.90±0.47 24 h 26.14±0.89 17.88±0.73 13.39±0.41 11.87±0.48离心27.24±1.03 17.56±0.42 13.52±0.36 11.81±0.43灭菌25.16±0.80 16.74±0.60 12.74±0.42 11.13±0.43
由表2 可知，各组样品经过酵母发酵去除单糖、离心和灭菌处理后的平均聚合度与对照组（KGM）没有明显差异，说明酵母去单糖、离心和灭菌处理对KOGM聚合度的影响不大，可以采用该制备过程来制备KOGM。张琳[19]用酵母发酵法去除了魔芋葡甘菊糖酶解液中的单糖，成功地制备了魔芋葡甘低聚糖。本试验测定的KGM 和3 种KOGM 聚合度分别为25.16±0.80、16.74±0.60、12.74±0.42、11.13±0.43，符合试验设计要求。
2.2 不同聚合度KOGM 的黏度
不同聚合度KOGM 黏度结果见图1。
图1 不同聚合度KOGM 黏度
Fig.1 Viscosity of KOGM with different degrees of polymerization
不同字母表示差异显著，P<0.05。
由图1 可知，与高聚合度KGM 相比，聚合度越小，黏度越低。KOGM-M 的黏度为KGM 黏度的61.7%，黏度差异显著（P<0.05），说明当聚合度为16.74 时KGM原有的凝胶体系被破坏，黏度下降，与前期的酶解试验观察到酶解处理1 h 溶液呈现液化的试验现象一致。KOGM-L1 和KOGM-L2 的黏度为KGM 的10%，说明经过酶解后KOGM 分子解聚，黏度减小，与阙凤等[20]的研究结果一致。由于试验设计中KOGM-L2 处理设定为充分酶解（酶/底物质量比为10%，酶解24 h），测试结果显示KOGM-L1 和KOGM-L2 的黏度并没有显著性差异（P>0.05），推测KOGM-L1 的酶解也较为充分，可以认为KOGM 的聚合度在11～12 酶解充分。
2.3 不同聚合度KOGM 红外结构
KGM、KOGM-M、KOGM-L1 和KOGM-L2 的傅里叶红外光谱结果见图2。
图2 不同聚合度KOGM 红外光谱
Fig.2 Infrared spectra of KOGM with different degrees of polymerization
由图2 可知，KGM 及不同聚合度KOGM 均检测到葡聚糖分子的特定化学键。3 500～3 000 cm-1范围内有宽的吸收峰表示糖类羟基（—OH）的存在。2 953 cm-1附近的吸收峰表示C—H 拉伸，1 664 cm-1 附近的吸收表示
伸展。在1 200～900 cm-1 的“指纹区”中1 120～980 cm-1 区域的吸收带为吡喃糖环中醇羟基中的C—O 键的伸缩振动。1 080 cm-1 的吸收带是C—1—H 的弯曲振动，1 030 cm-1 吸收带表示C—4—OH 振动。1 400～1 200 cm-1 表示—CH2 变形振动[21]。KGM 和3 种不同聚合度KOGM 的近红外光谱一致显示，他们的基本单元和主要结构没有呈现明显的差异，产生光谱吸收的不同可能主要是由糖苷键断裂所致。
2.4 不同聚合度KOGM 扫描电子显微镜分析
将不同聚合度KOGM 冻干样品喷金处理后分别于扫描电子显微镜下观察，结果见图3。
图3 不同聚合度KOGM 表面微观结构
Fig.3 Surface microstructure of KOGM with different degrees of polymerization
由图3 可知，高聚合度KGM 表面整体性完好，结构致密，表面和边缘光滑。与KGM 相比，中聚合度KOGM-M 表面破裂，有明显的浅坑状凹陷，但仍能保持整体结构且片层边缘仍较光滑。低聚合度KOGML1 的碎片化进一步明显，碎片边缘尖锐，表面出现明显的小孔。KOGM-L2 严重破碎，碎片表面出现非常明显的大孔，能够看到丝状结构。综上所述，中高聚合度的KGM 和KOGM-M 表面结构相近，更类似凝胶胶体，而低聚合度的KOGM-L1 和KOGM-L2 的表面结构相似，呈现粉末化特征。研究发现扫描电镜也能观察到低聚合度KOGM 具有更多的碎片化和碎屑状结构[22]。试验发现随着聚合度的减小，KOGM 表面破碎增多，微观结构中孔洞数量增多，孔洞尺寸增大，推测该现象与β-甘露聚糖酶酶解有关，聚合度越小，酶解越充分，微观孔洞数量越多，尺寸越大。Zhang 等[23]认为氢键的解离或酶解过程中大分子链的降解是造成微观孔洞的主要原因。
2.5 不同聚合度KOGM 对乳酸菌增殖作用
为考察不同聚合度KOGM 对5 种乳酸菌的增殖效果，以无菌水为阴性对照，菊糖和葡萄糖作为阳性对照，在sMRS 培养基中添加不同聚合度的KOGM 为唯一碳源，进行乳酸菌厌氧培养，测定24 h 时发酵液的OD600 值，结果见图4。
图4 不同聚合度KOGM 对乳酸菌增殖
Fig.4 Proliferation of lactic acid bacteria by KOGM with different polymerization degrees
相同菌株不同字母表示差异显著，P<0.05。
由图4 可知，KGM 和KOGM-M 对所有菌株增殖效果均显著低于KOGM-L1 和KOGM-L2（P<0.05），说明随着KOGM 聚合度降低，所有的乳酸菌增殖作用都有不同程度增强。Rossi 等[24]研究双歧杆菌对菊糖的利用情况时也发现类似规律。KOGM-L1 和KOGM-L2 之间增殖效果对比无明显差异（P>0.05），说明相近聚合度的KOGM 对乳酸菌增殖效果接近。5 株乳酸菌对不同聚合度的KOGM 生长响应有明显差异。低聚合度的KOGM 对鼠李糖乳杆菌增殖倍数最高，增殖效果最明显，KOGM-L1（OD600=1.37±0.06）和KOGM-L2（OD600=1.33±0.07）的菌数值是KGM（OD600=0.26±0.02）和KOGM-M（OD600=0.29±0.03）的4～5 倍，是相同质量聚糖（OD600=0.34±0.06）的4 倍，说明低聚合度的KOGM能够有效地促进鼠李糖乳杆菌增殖，增殖效果强于中聚合度的KOGM 和菊糖。低聚合度的KOGM 对长双歧杆菌增殖也有较好的效果，KOGM-L1（OD600=2.12±0.02）和KOGM-L2（OD600=2.13±0.02）分别是菊糖（OD600=1.52±0.02）的1.39 倍和1.40 倍，分别是葡萄糖（OD600=2.37±0.03）的89%和90%，说明KOGM-L1 和KOGM-L2对于鼠李糖乳杆菌和长双歧杆菌是一种优于菊糖的益生元。与其他乳酸菌不同，长双歧杆菌对不同聚合度的KOGM 均有着较好的广谱性利用。Ho 等[12]报道双歧杆菌对不同聚合度木聚糖也有相似的结果。
2.6 乳酸菌发酵不同聚合度KOGM 消耗的总糖含量及发酵液pH 值
将不同乳酸菌发酵液进行离心后，取上清液测残留的总糖含量，对比加入的总糖含量能够得到乳酸菌发酵过程中的总糖消耗量，反映乳酸菌对不同聚合度KOGM 的利用情况，结果见图5。
图5 乳酸菌发酵不同聚合度KOGM 的总糖消耗量
Fig.5 Total sugar consumption of KOGM with different polymerization degrees in lactic acid bacteria fermentation
相同菌株不同字母表示差异显著，P<0.05。
由图5 可知，添加有KOGM-L1 和KOGM-L2 的乳酸菌发酵液中总糖消耗量与KGM 和KOGM-M 有显著性差异（P<0.05），说明低聚合度的KOGM 更容易被乳酸菌降解利用，导致发酵液中残留的总糖降低。这一结论与乳酸菌增殖结果一致。Ho 等[12]采用不同聚合度的木聚糖替代碳源进行体外益生试验时也发现聚合度更低的木聚糖能有效促进粪便中双歧杆菌的生长和有机酸产生。除植物乳杆菌外，青春双歧杆菌、长双歧杆菌、干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌发酵KOGM-L1 和KOGM-L2 消耗的总糖量多于菊糖，且有着显著性差异（P<0.05），说明多数乳酸菌对低聚合度KOGM 的利用性比菊糖更好。试验发现，长双歧杆菌对各种KOGM 的利用效果较好，KGM、KOGM-M、KOGM-L1 和KOGM-L2的总糖消耗量分别为18.02、21.43、46.41、52.55 mg/mL，是菊糖总糖消耗量的1.30、1.55、3.35、3.79 倍。鼠李糖乳杆菌很难发酵利用KGM、KOGM-M 和菊糖，对应的总糖消耗量分别为2.58、3.63、5.40 mg/mL。研究发现并非所有的低聚糖都能有效促进鼠李糖乳杆菌的生长，李雅丽等[25]报道鼠李糖乳杆菌几乎无法利用低聚木糖、菊粉和低聚果糖。但是鼠李糖乳杆菌能够很好地发酵利用低聚合度KOGM-L1 和KOGM-L2，总糖消耗量分别为43.80 mg/mL 和43.71 mg/mL，是菊糖的8.11 倍和8.09 倍。推测该现象可能与低聚合度KOGM 中含有一定数量的小分子糖有关。Mäkeläinen 等[26]发现鼠李糖乳杆菌降解低聚半乳糖需要小分子单糖或双糖的参与，缺乏小分子糖时鼠李糖乳杆菌无法在低聚半乳糖（DP3～5）培养基上生长。
碳源作为生长因子可以促进乳酸菌生长及代谢产酸，pH 值能反映乳酸菌利用不同聚合度KOGM 产酸情况，结果见图6。
图6 乳酸菌发酵不同聚合度KOGM 的pH 值
Fig.6 pH values of KOGM with different polymerization degrees in lactic acid bacteria fermentation
相同菌株不同字母表示差异显著，P<0.05。
由图6 可知，乳酸菌发酵不同碳源后溶液pH 值有显著性差异（P<0.05）。总体上KGM 和KOGM-M 对应发酵液的pH 值显著性高于KOGM-L1 和KOGM-L2（P<0.05），说明聚合度低的KOGM 有助于促进乳酸菌产酸，与菌体增殖和总糖消耗量反映的规律相符。长双歧杆菌对不同聚合度KOGM 的利用可以明显分为两类：KGM 和KOGM-M 的pH 值分别为5.06、5.01，而KOGM-L1 和KOGM-L2 的pH 值分别为4.73 和4.68，说明长双歧杆菌对低聚合度KOGM 的利用优于中聚合度KOGM 和高聚合度KGM，但长双歧杆菌都能利用不同聚合度KOGM。然而，pH 值数据显示鼠李糖乳杆菌对碳源有选择性，KOGM-L1 和KOGM-L2 的pH 值分别为5.51 和4.45，KGM、KOGM-M 和菊糖的pH 值分别为6.41、6.42 和6.32，说明鼠李糖乳杆菌更偏好聚合度更低的KOGM，基本不利用中聚合度KOGM、高聚合度KGM 和菊糖。与王苗等[27]的研究结论一致。
2.7 不同聚合度KOGM 的乳酸菌发酵液短链脂肪酸（short-chain fatty acid，SCFAs）含量
乳酸杆菌、双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌等均可代谢产生SCFAs，但不同菌株的SCFAs 的产量和组成有很大不同[28]。研究长双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌不同聚合度KOGM 对乳酸菌产SCFAs 的影响，总SCFAs 含量结果见图7。
图7 长双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌代谢不同碳源的总SCFAs 含量
Fig.7 Total SCFAs of Bifidobacterium longum and Lactobacillus rhamnosus metabolizing different carbon sources
相同菌株不同字母表示差异显著，P<0.05。
由图7 可知，KOGM-L1 和KOGM-L2 的总SCFAs含量显著大于KGM 和KOGM-M（P<0.05），说明低聚合度的KOGM 代谢生成的总SCFAs 含量高于中聚合度KOGM 和高聚合度KGM。张宁等[29]在研究不同聚合度大蒜果菊糖也得到相似的结论。长双歧杆菌代谢KOGM-L2 产生的总SCFAs 含量为783.32 μg/mL，是相同添加量菊糖总SCFAs 含量的1.15 倍，说明KOGML2 在促进长双歧杆菌产生SCFAs 优于菊糖。KOGML2 促进鼠李糖乳杆菌产生SCFAs 是菊糖的1.69 倍，说明在促进SCFAs 产生方面，在鼠李糖乳杆菌中添加KOGM-L2 比添加菊糖的效果更好。
长双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌代谢不同碳源产生的乙酸、丙酸和正丁酸含量见表3。
表3 长双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌发酵不同碳源的SCFAs 组分
Table 3 SCFAs components in Bifidobacterium longum and Lactobacillus rhamnosus fermentation with different carbon sources μg/mL
注：*表示与对照组（KGM）相比，差异显著（P<0.05）；**表示与对照组（KGM）相比，差异极显著（P<0.01）。
碳源KGM KOGM-M KOGM-L1 KOGM-L2菊糖长双歧杆菌鼠李糖乳杆菌乙酸含量366.21±33.85 371.56±20.81 720.21±26.00**754.59±45.33**635.82±32.90**丙酸含量3.86±1.03 4.1±0.97 6.25±1.22 7.12±0.96*9.2±1.76**正丁酸含量4.35±0.46 4.25±1.21 6.71±1.11 8.86±1.80*11.95±2.29**乙酸含量347.18±16.20 387.28±38.73 453.25±21.89**633.35±13.30**361.58±18.12丙酸含量2.86±0.26 4.83±0.35**4.79±0.28**6.69±0.40**3.08±0.45正丁酸含量4.89±0.18 6.09±0.34**10.1±0.44**8.63±0.13**1.62±0.26**
由表3 可知，在乳酸菌代谢所有碳源产生的SC-FAs 中乙酸占比均超过95%以上，说明乙酸是乳酸菌产SCFAs 的主要成分。研究证实乳酸菌产生的短链脂肪酸中乙酸、丙酸和丁酸占总SCFAs 的90%，且其中绝大多数是乙酸[28]。长双歧杆菌代谢KOGM-L1 和KOGM-L2 产生乙酸含量分别为（720.21±26.00）μg/mL和（754.59±45.33）μg/mL，与对照组KGM（366.21±33.85）μg/mL 有极显著性差异（P<0.01），说明低聚合度KOGM 有助于长双歧杆菌代谢产生乙酸。鼠李糖乳杆菌结果也是如此。试验同时发现KOGM-L1 和KOGM-L2 促进鼠李糖乳杆菌代谢产生乙酸分别为菊糖的1.25 倍和1.75 倍，说明低聚合度KOGM 促进鼠李糖乳杆菌代谢产生乙酸效果明显好于菊糖。丙酸和正丁酸都是SCFAs 重要的成分，尽管乳酸菌本身不是肠道重要的丙酸和丁酸产生菌，但是数据显示KOGML2 在长双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌产生丙酸和正丁酸方面与KGM 具有显著性差异（P<0.05），说明低聚合度KOGM 有利于丙酸和正丁酸的产生。
3 结论
乳酸菌和益生元是胃肠道保健品的两种主要成分，占据着当前保健品市场的主要份额。目前魔芋葡甘聚糖作为益生元的研究多关注小分子量的低聚糖（DP≤10），然而小分子量的低聚糖分离纯化操作复杂，成本昂贵，产量有限。相对而言，DP>10 的魔芋葡甘聚糖制备相对简单，但很少有研究报道。本研究以魔芋葡甘聚糖和β-甘露聚糖酶为原料，探讨不同聚合度对魔芋葡甘低聚糖的体外益生功能的影响。采用酶解的方法分别得到不同聚合度的魔芋甘露聚糖KOGM-M、KOGM-L1 和KOGM-L2，聚合度分别为16.74、12.74、11.13。利用静态流变仪、红外光谱和扫描电镜对KOGM-M、KOGM-L1 和KOGM-L2 的黏度、红外结构和微观结构与原料KGM 进行比对。结果表明：黏度随着聚合度的降低而减小，低聚合度（DP12.74 和11.13）的黏度为高聚合度KGM（DP25.16）的10%。聚合度KOGM-M（DP16.74）与高聚合度KGM 微观结构相似，而低聚合度KOGM-L1 和KOGM-L2 的结构相似。将KGM 和各聚合度KOGM 作为唯一碳源与5 种乳酸菌共培养，发现KGM 和中聚合度的KOGM-M 增殖效果明显小于低聚合度KOGM，而低聚合度KOGM 之间的增殖效果没有显著性差异。低聚合度KOGM-L2与长双歧杆菌共培养的总菌数最高，OD600 为2.13；KOGM-L1对鼠李糖乳杆菌促进（增殖倍数）最明显，是中高聚合度的4～5 倍，是菊糖的4 倍。pH 值和总糖消耗含量与菌体增殖基本吻合。长双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌代谢低聚合度KOGM 产生的总SCFAs 多于中高聚合度KOGM 和菊糖，但是鼠李糖乳杆菌利用两种低聚合度的KOGM 代谢的总SCFAs 产量上有显著性差异。与中高聚合度KOGM 相比，低聚合度KOGM 更有助于长双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌代谢产生SCFAs，聚合度11～13的KOGM 依然是一种优质的益生元。
[1]LIU Z J,XU C,TIAN R,et al.Screening beneficial bacteriostatic lactic acid bacteria in the intestine and studies of bacteriostatic substances[J].Journal of Zhejiang University Science B,2021,22(7):533-547.
[2]MARCO M L,HEENEY D,BINDA S,et al.Health benefits of fermented foods:Microbiota and beyond[J].Current Opinion in Biotechnology,2017,44:94-102.
[3]DAHIYA D,NIGAM P S.The gut microbiota influenced by the intake of probiotics and functional foods with prebiotics can sustain wellness and alleviate certain ailments like gut-inflammation and colon-cancer[J].Microorganisms,2022,10(3):665.
[4]TANG H,HUANG W Q,YAO Y F.The metabolites of lactic acid bacteria:Classification,biosynthesis and modulation of gut microbiota[J].Microbial Cell,2023,10(3):49-62.
[5]臧凯丽,江岩,孙勇,等.益生菌剂调整肠道疾病人群菌群结构丰度水平的研究[J].食品科学,2018,39(13):133-143.ZANG Kaili,JIANG Yan,SUN Yong,et al.Probiotics modulate the structure and abundance of gut mircrobiota in populations with intestinal diseases[J].Food Science,2018,39(13):133-143.
[6]GIBSON G R,ROBERFROID M B.Dietary modulation of the human colonic microbiota:Introducing the concept of prebiotics[J].The Journal of Nutrition,1995,125(6):1401-1412.
[7]HUGHES R L,ALVARADO D A,SWANSON K S,et al.The prebiotic potential of inulin-type fructans:A systematic review[J].Advances in Nutrition,2022,13(2):492-529.
[8]刘波,刘通通,张祥奎,等.益生元及其应用研究进展[J].食品与药品,2021,23(5):485-492.LIU Bo,LIU Tongtong,ZHANG Xiangkui,et al.Research progress of prebiotics and their application[J].Food and Drug,2021,23(5):485-492.
[9]VUKSAN V,JENKINS D J,SPADAFORA P,et al.Konjac-mannan(glucomannan) improves glycemia and other associated risk factors for coronary heart disease in type 2 diabetes.A randomized controlled metabolic trial[J].Diabetes Care,1999,22(6):913-919.
[10]BEHERA S S,RAY R C.Konjac glucomannan,a promising polysaccharide of Amorphophallus konjac K.Koch in health care[J].International Journal of Biological Macromolecules,2016,92:942-956.
[11]MOURA P,CABANAS S,LOURENÇO P,et al.In vitro fermentation of selected xylo-oligosaccharides by piglet intestinal microbiota[J].LWT-Food Science and Technology,2008,41(10):1952-1961.
[12]HO A L,KOSIK O,LOVEGROVE A,et al.In vitro fermentability of xylo-oligosaccharide and xylo-polysaccharide fractions with different molecular weights by human faecal bacteria[J].Carbohydrate Polymers,2018,179:50-58.
[13]MONIZ P,HO A L,DUARTE L C,et al.Assessment of the bifidogenic effect of substituted xylo-oligosaccharides obtained from corn straw[J].Carbohydrate Polymers,2016,136:466-473.
[14]ITO H,TAKEMURA N,SONOYAMA K,et al.Degree of polymerization of inulin-type fructans differentially affects number of lactic acid bacteria,intestinal immune functions,and immunoglobulin A secretion in the rat cecum[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2011,59(10):5771-5778.
[15]OZTURKOGLU-BUDAK S,AKAL H C,BURAN İ,et al.Effect of inulin polymerization degree on various properties of synbiotic fermented milk including Lactobacillus acidophilus La-5 and Bifidobacterium animalis Bb-12[J].Journal of Dairy Science,2019,102(8):6901-6913.
[16]常晓艳.不同酶降解魔芋葡甘露聚糖对大鼠肠道菌群及便秘作用的比较研究[D].南京:南京中医药大学,2022.CHANG Xiaoyan.Comparative study on effects of different enzymatic hydrolysates of konjac glucomannan on gut flora and constipation rats[D].Nanjing:Nanjing Universtiy of Chinese Medicine,2022.
[17]李操,韩金润,秦为辉,等.基于GC-MS 或GC-MS/MS 测定粪便、血浆和尿液样本中短链脂肪酸含量的方法:CN114740107A[P].2022-07-12.LI Cao,HAN Jinrun,QIN Weihui,et al.Method for determining content of short-chain fatty acid in excrement,plasma and urine samples based on GC-MS (gas chromatography-mass spectrometry)or GC-MS/MS (gas chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry):CN114740107A[P].2022-07-12.
[18]王跃飞,江振作,朱彦,等.乳品中短链脂肪酸的检测方法:CN104807933B[P].2016-05-25.WANG Yuefei,JIANG Zhenzuo,ZHU yan,et al.Method for detecting short-chain fatty acid in milk product:CN104807933B[P].2016-05-25.
[19]张琳.魔芋低聚糖的制备及其性质研究[D].长春:吉林大学,2013.ZHANG Lin.The research on the preparation and properties of konjac oligosaccharide[D].Changchun:Jilin University,2013.
[20]阙凤,夏雨婷,高天麒,等.β-葡聚糖酶降解魔芋葡甘聚糖产物的制备及结构表征[J].食品科学,2023,44(8):9-15.QUE Feng,XIA Yuting,GAO Tianqi,et al.Preparation and structural characterization of β-dextranase hydrolytic products of konjac glucomannan[J].Food Science,2023,44(8):9-15.
[21]JANA U K,KANGO N.Characteristics and bioactive properties of mannooligosaccharides derived from agro-waste mannans[J].International Journal of Biological Macromolecules,2020,149:931-940.
[22]李煜.魔芋葡甘聚糖的微波和酶法降解制备及其益生元活性[D].南昌:南昌大学,2021.LI Yu.Study on the structure and probiotics activity of konjac glucomannan degraded by microwave and enzyme process[D].Nanchang:Nanchang University,2021.
[23]ZHANG Y,ZHAO Y,YANG W F,et al.Structural complexity of konjac glucomannan and its derivatives governs the diversity and outputs of gut microbiota[J].Carbohydrate Polymers,2022,292:119639.
[24]ROSSI M,CORRADINI C,AMARETTI A,et al.Fermentation of fructooligosaccharides and inulin by bifidobacteria:A comparative study of pure and fecal cultures[J].Applied and Environmental Microbiology,2005,71(10):6150-6158.
[25]李雅丽,王默涵,周志桥.6 种低聚糖对肠道益生菌生长情况的影响及代谢产物分析[J].食品科技,2021,46(3):7-13.LI Yali,WANG Mohan,ZHOU Zhiqiao.Effects of six oligosaccharides on the growth of intestinal probiotics and analysis of metabolites[J].Food Science and Technology,2021,46(3):7-13.
[26]MÄKELÄINEN H,SAARINEN M,STOWELL J,et al.Xylo-oligosaccharides and lactitol promote the growth of Bifidobacterium lactis and Lactobacillus species in pure cultures[J].Beneficial Microbes,2010,1(2):139-148.
[27]王苗,蒋敏,李恒,等.乳酸菌对魔芋甘露低聚糖的降解与利用[J].食品与发酵工业,2016,42(11):20-24.WANG Miao,JIANG Min,LI Heng,et al.Investigation on the regular patterns of mannan oligosaccharides degradation and utilization by lactic acid bacteria[J].Food and Fermentation Industries,2016,42(11):20-24.
[28]LEBLANC J G,CHAIN F,MARTÍN R,et al.Beneficial effects on host energy metabolism of short-chain fatty acids and vitamins produced by commensal and probiotic bacteria[J].Microbial Cell Factories,2017,16(1):79.
[29]张宁,曾艳华,吴希阳,等.中性大蒜果聚糖体外发酵产短链脂肪酸[J].食品与发酵工业,2013,39(1):51-54.ZHANG Ning,ZENG Yanhua,WU Xiyang,et al.Effect of neutral garlic fructans on short-chain fatty acids by human fecal bacteria in vitro[J].Food and Fermentation Industries,2013,39(1):51-54.