青稞（Hordeum vulgare L.var.nudum Hook.f）是禾本科大麦属的变种，因其成熟时籽粒与内外颖壳相互分离，使籽粒裸露在外，故也被称为无壳大麦、元麦或裸大麦[1]，青稞属于杂粮，具有“三高两低”的营养组成特点[2]，同时，青稞也含有丰富的生物活性物质如γ-氨基丁酸，不仅营养全面而且容易被人体吸收，是一种良好的γ-氨基丁酸补充原料。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一种四碳非蛋白质氨基酸[3]，在植物的根、茎、叶等各组织中均有分布，在哺乳动物中，GABA 主要作为抑制性神经递质存在[4]，具有对人体失眠、抑郁、癫痫、阿尔兹海默症等一系列神经退行性症状的缓解功效，并且可以使大脑的记忆功能在一定程度上得到改善[5]，外源GABA 可以通过人体口服的方式被摄入[6]，从而对人体起到各种积极效用，因此，可以通过采取植物发芽法富集GABA，得到对人体有益的食物原料。
谷物萌芽后，种子中的生物大分子被内源酶分解为小分子[7]，GABA、酚类化合物等生物活性物质大量提升，适口性和营养价值均得到改善[8]，因此相比于化学合成法、生物发酵法等其他制备GABA 的方式，植物发芽法更加绿色健康且经济易行。目前，萌芽富集GABA 的方法包括盐胁迫、低温胁迫、低氧胁迫、机械损伤、热刺激等。胁迫萌芽可以大幅提高谷物GABA含量，如尹永祺等[9]采用低温胁迫结合解冻的方式，使萌芽玉米籽粒GABA 含量高达157 mg/100 g，然而关于低温对萌芽青稞GABA 富集影响的研究却较为少见。
γ-氨基丁酸在谷物中通过GABA 支路及多胺降解两种途径进行合成，其中GABA 支路途经关键合成调控酶为谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase，GAD），L-谷氨酸在GAD 的作用下合成GABA，随后GABA 在γ-氨基丁酸转氨酶（γ-aminobutyric acid transaminase，GABA-T）的作用下分解成琥珀酸半醛，进入三羧酸循环[10]；多胺降解途径中主要合成调控酶为二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）和多胺氧化酶（polyamine oxidases，PAO），在低温胁迫对于青稞GABA 诱导合成的过程中，哪条途径起主要调控作用的报道鲜见。
本试验以‘柴青一号’青稞为原料，采用低温胁迫萌芽的方式，探究低温胁迫萌芽过程中不同因素对青稞GABA 富集的影响，并利用响应面试验优化胁迫萌芽富集青稞GABA 的工艺参数，进一步通过对GAD、PAO、DAO 3 种酶活性的变化，揭示其调控作用，以期为高GABA 含量青稞原料的生产研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂
青稞：西藏桑珠孜区德琴3900 庄园有限公司；γ-氨基丁酸（≥99.9%）：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；次氯酸钠、苯酚、无水乙醇（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；硼酸（分析纯）：天津市光复科技发展有限公司；四硼酸钠（分析纯）：上海陆都化学试剂厂；谷氨酸脱羧酶测试盒、多胺氧化酶测试盒、二胺氧化酶测试盒：上海酶联生物科技有限公司。
1.2 主要仪器与设备
紫外可见光分光光度计（UV-2800）：尤尼柯（上海）仪器有限公司；圆形验粉筛（PPS-308）：杭州佩克昂科技有限公司；锤式实验室旋风磨（LM3100 型）：波通瑞华科学仪器（北京）有限公司；电热鼓风干燥箱（DHG-9420A）、恒温恒湿箱（LHS-250HC-Ⅱ）：上海一恒科学仪器有限公司；电子分析天平（ME204）：梅特勒托利多科技（中国）有限公司；全波长酶标仪（Multiskan Sky-High）、台式离心机（ST16R）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；电热恒温水浴锅（HHS 型）：上海博迅实业有限公司医疗设备厂。
1.3 试验方法
1.3.1 萌芽工艺
青稞经过挑选、除杂后，用去离子水洗净，称取20 g青稞籽粒放置于发芽盒中，加入100 mL 去离子水，保持青稞与水的比例为1∶5（g/mL），青稞经浸泡后，取出，平铺于有4 层湿纱布的发芽盒中，放置于恒温恒湿箱中进行萌芽培养，控制温度和湿度，萌芽结束后，将萌芽青稞移入65 ℃的烘箱中烘干2 h，以达到终止发芽的目的，用锤式旋风磨将萌芽青稞粉碎，过筛，装入密封袋中，于4 ℃保存备用。
1.3.2 单因素试验
1.3.2.1 不同浸泡时间对青稞富集GABA 的影响
青稞籽粒经预处理后进行浸泡，控制浸泡时间分别为4、6、8、10、12 h，浸泡温度为15 ℃，萌芽时间为16 h，萌芽温度为15 ℃，并进行GABA 含量及酶活性测定，探究不同浸泡时间对萌芽青稞GABA 合成的影响。
1.3.2.2 不同萌芽时间对青稞富集GABA 的影响
青稞籽粒经预处理后进行浸泡，控制浸泡温度为15 ℃，浸泡时间8 h，萌芽温度为15 ℃，萌芽时间分别为14、16、18、20、22 h，以0 h 萌芽处理为对照组，并进行GABA 含量及酶活性测定，探究不同萌芽时间对萌芽青稞GABA 合成的影响。
1.3.2.3 不同培养温度对青稞富集GABA 的影响
在青稞浸泡时进行低温胁迫处理，浸泡时间为8 h，控制浸泡和萌芽温度分别为-5、0、5、10、15 ℃，萌芽时间为16 h，以25 ℃萌芽处理为对照组，并进行GABA含量及酶活性测定，探究不同培养温度对萌芽青稞GABA 合成的影响。
1.3.3 响应面优化试验
以单因素试验结果为基础，选择Box-Behnken 设计进一步优化青稞萌芽富集GABA 的培养条件，分别以浸泡时间、培养温度、萌芽时间三个因素的三个水平为自变量，以GABA 含量为响应值进行响应面试验，通过Design Expert 8.0.6 软件对试验数据进行分析，并预测富集GABA 的最佳工艺条件。试验因素及水平如表1所示。
表1 Box-Behnken 试验因素及水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment
水平-1因素A 浸泡时间/h C 培养温度/℃-5 0 1 4 6 8 B 萌芽时间/h 14 16 18 0 5
1.3.4 GABA 含量的测定
参照Zhang 等[11]的方法稍作修改。分别称取1.0 g萌芽青稞粉样品，移入50 mL 离心管中，加入10 mL 去离子水，于30 ℃、150 r/min 条件下摇床振荡2 h，然后4 000 r/min 离心10 min，静置。取0.5 mL 上清液，加入0.2 mL 0.2 mol/L pH9.0 的硼酸盐缓冲液、1 mL 6%苯酚和0.4 mL 9% 次氯酸钠溶液。振荡混匀后，放入沸水中10 min，然后立即放入冰浴，静置20 min 后取出，待溶液颜色稳定，加入2 mL 60% 乙醇，振荡混匀后静置，于645 nm 波长检测样品，记录吸光度。
GABA 标准曲线的绘制：精确称取20 mg GABA标准试剂，将其移入100 mL 容量瓶中，用去离子水定容至100 mL，摇匀。从中分别取0、2、4、6、8、10 mL 溶液，分别移入10 mL 容量瓶中，并加入去离子水定容至10 mL，配制的GABA 标准溶液浓度分别为0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL。随后按照上述方法测定其吸光度，以GABA 浓度为横坐标（x），吸光度为纵坐标（y）建立回归方程，绘制标准曲线，得到线性回归方程为y=5.7614x-0.032，R²=0.992。
1.3.5 GAD、PAO、DAO 活性的测定
3 种酶活性均按照试剂盒说明方法进行测定。
1.4 数据处理
试验均重复3 次，结果数据以平均值±标准差形式表示。采用IBM SPSS Statistics 25 软件进行单因素方差分析，使用Origin Pro 2023 b 软件作图，Design-Expert 8.0.6 软件进行Box-Behnken 试验设计及处理。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果与分析
2.1.1 浸泡时间对青稞萌芽中GABA 合成的影响
不同浸泡时间对青稞萌芽富集GABA 的影响如图1所示。
图1 不同浸泡时间对青稞萌芽富集GABA 的影响
Fig.1 Effect of different soaking times on GABA enrichment in highland barley germination
不同小写字母表示差异显著，P<0.05。
由图1 可知，GABA 含量随浸泡时间的延长呈先降低后上升趋势，在浸泡时间4 h 时，萌芽青稞GABA含量最高可达（76.37±0.17）mg/100 g，显著高于其他处理组（P<0.05），在浸泡时间10 h 时，萌芽青稞合成的GABA 最低，含量为（68.18±0.56）mg/100 g，在浸泡时间为12 h 时，GABA 含量却得到了一定程度的提高。Hussain 等[12]的研究同样发现，浸泡时间的延长降低了发芽糙米中GABA 的含量；在凌志洲等[13]对萌芽青稞的研究中，GABA 含量变化随着浸泡时间的增长表现为先增加后降低，其萌芽青稞最高GABA 含量的条件为浸泡24 h，这一结果与本试验存在差异，可能是由于浸麦工艺及温度不同所造成。
2.1.2 不同培养温度对青稞萌芽中GABA 合成的影响不同培养温度对青稞萌芽富集GABA 的影响如图2所示。
图2 不同培养温度对青稞萌芽富集GABA 的影响
Fig.2 Effect of different temperatures on GABA enrichment in highland barley germination
不同小写字母表示差异显著，P<0.05。
由图2 可知，萌芽青稞中GABA 含量随着培养温度升高而逐渐降低，温度为-5～5 ℃时，萌芽青稞中GABA 含量高于其他处理组（P<0.05），且低温处理组GABA 含量均显著高于25 ℃对照组（P<0.05），其中，-5 ℃条件下青稞萌芽富集GABA 的含量可达（81.29±1.66）mg/100 g，是对照组的1.81 倍。由此可见，低温胁迫萌芽能够促使青稞大量富集GABA[14]，在大麦和小麦中也存在相同情况，当处于低温或冷冻条件下，谷氨酸大量转化为γ-氨基丁酸，并且其转化量与低温胁迫程度呈现正比关系[15]；马丽等[16]在低温胁迫发芽糙米试验中发现，当胁迫温度从0 ℃升高至10 ℃时，GABA 含量逐渐下降，这与本研究的结果相似，因此推测原因可能是当谷物处于10～15 ℃的胁迫条件下，其自身具备一定抗寒能力，能够缓解部分低温胁迫压力。
2.1.3 萌芽时间对青稞萌芽中GABA 合成的影响
不同萌芽时间对青稞萌芽富集GABA 的影响如图3所示。
图3 不同萌芽时间对青稞萌芽富集GABA 的影响
Fig.3 Effect of different germination times on GABA enrichment in highland barley germination
不同小写字母表示差异显著，P<0.05。
由图3 可知，对照组青稞籽粒GABA 含量为（66.19±0.10）mg/100 g，显著低于萌芽处理组（P<0.05），当萌芽时间为14 h 时，萌芽青稞的GABA 含量高达（77.68±1.44）mg/100 g，随着时间延长，GABA 含量呈现略微下降的势态，可能原因是GABA 合成与降解反应均持续进行，内源物质被不断消耗，GABA 合成所需底物谷氨酸含量逐渐下降，导致萌芽青稞的GABA 含量降低。王斌[17]研究萌芽稻谷时发现，经浸泡未萌芽处理的稻谷中GABA 含量显著低于其余萌芽样品，表明萌芽过程能够促使GABA 合成，仅依靠浸泡处理不能达到富集GABA 的目的。
研究发现，过长的萌芽时间会影响青稞本身的感官和营养品质，使青稞产生霉变，发出不愉快气味，因此，需要严格控制青稞的萌芽时间，避免出现青稞品质变差的情况。
2.2 响应面优化低温胁迫萌芽富集青稞GABA 工艺
2.2.1 Box-Behnken 试验结果
根据单因素试验结果，选取浸泡时间（A）、萌芽时间（B）、培养温度（C）三因素三水平，以GABA 含量为响应值进行响应面优化试验，设计方案及结果如表2所示。
表2 Box-Behnken 试验结果
Table 2 Results of Box-Behnken experiment
试验号A 浸泡时间/h C 培养温度/℃1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 0 0 0-5-5 5 5-5-5 11 12 13 14 15 16 17 4 8 4 8 4 8 4 8 6 6 6 6 6 6 6 6 6 B 萌芽时间/h 14 14 18 18 16 16 16 16 14 18 14 18 16 16 16 16 16 5 5 0 0 0 0 0 GABA 含量/（mg/100 g）64.39±0.58 72.78±1.97 71.23±0.61 72.55±0.83 68.92±1.18 79.74±1.46 74.90±1.84 76.76±2.26 62.98±2.19 71.20±2.50 70.41±1.85 70.02±1.79 79.41±2.58 79.89±2.88 81.32±1.60 79.67±2.46 79.67±2.95
通过Design-Expert 8.0.6 软件建立预测模型，对响应面数据进行多元线性回归及拟合分析，得到回归方程如下。
Y=-518.03+13.48A+68.27B+5.02C-0.44AB-0.22AC-0.22BC-0.42A2-2.02B2-0.13C2
2.2.2 回归模型显著性分析
验证回归模型的拟合度，并进行方差分析，其结果如表3所示。
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
注：**表示影响极显著，P<0.01；***表示影响高度显著，P<0.001。
方差来源模型自由度A B C AB AC BC A2 B2 C2 F 值79.74 89.02 37.00 15.14 17.83 28.47 26.35 16.55 391.34 63.07 P 值<0.000 1<0.000 1 0.000 5 0.006 0 0.003 9 0.001 1 0.001 3 0.004 8<0.000 1<0.000 1***0.342 7不显著显著性**********************残差项失拟项纯误差项总误差项R2 R2Adj平方和505.29 62.67 26.05 10.66 12.55 20.04 18.55 11.65 275.51 44.40 4.93 2.61 2.32 510.21 0.990 3 0.977 9 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 16均方56.14 62.67 26.05 10.66 12.55 20.04 18.55 11.65 275.51 44.40 0.70 0.87 0.58 1.50
由表3 可知，回归模型的F 值为79.74（P<0.001），表明该模型总体高度显著，其预测值与真实值具有相关性；决定系数R2 为0.990 3，失拟项不显著（P>0.05），表明该方程对试验拟合程度高，且误差较小，因此可以使用该模型分析和预测萌芽条件对GABA 含量富集程度的影响[18]。
一次项浸泡时间（A）和萌芽时间（B）对GABA 含量的影响均为高度显著（P<0.001），培养温度（C）对GABA 含量的影响为极显著水平（P<0.01）；二次项中A2 的影响为极显著水平（P<0.01），B2 及C2 的影响均为高度显著（P<0.001）；交互项中AB、AC、BC 的影响均为极显著（P<0.01）。根据回归方程中一次项F 值的大小可知各因素对GABA 含量影响程度为浸泡时间（A）>萌芽时间（B）>培养温度（C）。
2.2.3 响应面交互作用分析
根据响应面图的曲面陡度可以直观地判断出不同自变量对响应值的影响程度，图形曲面陡度越大，表明变量的影响越大，反之则影响越小；等高线图投影呈椭圆形表明交互作用越显著，趋近圆形则交互作用越弱[19]。图4 为不同因素交互作用的三维响应曲面图及等高线图。
图4 各因素交互作用对GABA 富集影响的响应面图及等高线图
Fig.4 Response surface diagrams and contour plots of the interaction effect of various factors on GABA enrichment
c.萌芽时间与培养温度
由图4 可知，可以发现浸泡时间（A）和萌芽时间（B）两因素对GABA 含量的影响呈现逐渐增大的趋势，响应面存在极大值点。在低温环境下，为了抵抗低温带来的不利影响，青稞在萌芽期不断合成抗逆性物质GABA，由于浸泡时间的增长，青稞吸收水分逐渐增多，体内各种代谢不断增强，GABA 合成的速度逐渐加快，当水分吸收饱和时，萌芽活动减缓，GABA 合成速率便不再有明显变化。从图4b、图4c 可以看出等高线呈椭圆形，表明图中两因素对GABA 含量的交互效应显著，这一结果与表3 的方差分析结论相符。当固定浸泡时间（A）和萌芽时间（B）两因素的情况下，0 ℃时GABA 含量出现极值，原因可能是在此温度下，水分处于冰水混合物状态，冰晶的形成破坏了青稞内部的细胞结构[20]，而液态水能够为青稞的萌芽提供条件，所以为了抵抗冷害对细胞的影响，萌芽过程中开始迅速合成GABA，以缓解环境压力。
2.2.4 工艺条件的优化及验证
通过回归模型预测青稞萌芽的最优工艺条件是浸泡时间7.85 h、萌芽时间16.06 h、培养温度为-0.76 ℃，此条件预测萌芽青稞的GABA 含量为81.23 mg/100 g。考虑到试验的可操作性，优化了低温胁迫青稞萌芽的工艺条件为浸泡时间8 h、萌芽时间16 h 和培养温度0 ℃。采用此最优萌芽工艺进行3 次验证，得到萌芽青稞GABA 含量实际值为（78.70±1.73）mg/100 g，实际值与模型预测值的相对误差为3.1%（<5%），说明该模型可以预测不同萌芽条件下青稞GABA 含量的变化，并优化最佳工艺参数，具有实际可行性。
2.3 低温胁迫对GABA 关键酶活性的影响
不同浸泡时间对GAD、DAO 活性的影响如图5所示。
图5 不同浸泡时间对GABA 合成途径相关酶活性的影响
Fig.5 Effect of different soaking times on the activity of enzymes related to the GABA synthesis pathway
由图5 可知，在浸泡4 h 时，青稞籽粒的GAD 活性最为活跃（35.80±0.94）U/g，随后GAD 活性明显下降，DAO 活性则随着浸泡时间的延长呈现先升后降的趋势，在浸泡时间8 h 时，DAO 活性提高至（1.32±0.52）U/g。结合图1 可知，GAD 活性与GABA 含量最高值均出现在浸泡4 h 时，而DAO 活性在8 h 时最高，说明可能GAD 活性对GABA 合成的影响较为明显。在Liao 等[21]对茶叶的缺氧胁迫研究中发现了相似规律，茶叶在浸泡0～4 h 时GAD 活性不断升高，在4 h 表达最高值，随后逐渐下降，而DAO 活性则随着浸泡时间的延长不断增加，表明植物可对外界环境不利变化迅速作出反应，使GAD 活性急剧提高，产生GABA 以维持正常生长发育。
不同培养温度对GAD、DAO 活性的影响如图6所示。
图6 不同培养温度对GABA 合成途径相关酶活性的影响
Fig.6 Effect of different temperatures on the activity of enzymes related to the GABA synthesis pathway
由图6 可知，15 ℃萌芽的青稞籽粒GAD 活性最高为（29.43±0.76）U/g，当温度低于0 ℃时，GAD 活性明显降低，25 ℃对照组的GAD 活性低至（20.62±0.23）U/g，表明温度降低至5～15 ℃之间时能够促进GAD 活性提高，但是当谷物在低于0 ℃条件下，其细胞内水分逐渐结冰，破坏细胞结构，对生长代谢造成限制，造成GAD代谢活性降低[22-23]。DAO 活性则随着温度的升高呈先升高后降低再升高趋势，然而在10 ℃时未检出DAO活性，25 ℃对照组DAO 活性高于其他处理组，表明低温抑制了DAO 活性。结合图2 可知，随着温度降低至0 ℃及以下，GABA 含量增加，而GAD 活性降低，推测原因可能是在0 ℃以下时青稞籽粒的生长发育受到抑制，与此同时，低温可能对GABA 降解酶的抑制作用更加明显，在周沫霖[24]对低温处理龙眼的GABA 代谢研究中发现，低温能够降低分解酶GABA-T 的活性，且-1 ℃处理组的GABA-T 活性低于4 ℃处理，表明当温度低于0 ℃时，GABA-T 活性被抑制，所以GAD 仍保持一定活性，而GABA-T 活性降低，最终导致GABA的不断积累提高。
不同萌芽时间对GAD、DAO 活性的影响如图7所示。
图7 不同萌芽时间对GABA 合成途径相关酶活性的影响
Fig.7 Effect of different germination times on the activity of enzymes related to the GABA synthesis pathway
由图7 可知，GAD 活性随着萌芽时间延长整体不断提高，在22 h 时，GAD 活性高达（71.29±3.19）U/g。DAO 活性则先上升后下降，萌芽18 h 时DAO 活性最高，为（1.32±0.52）U/g，22 h 萌芽处理组的DAO 活性未检出。对照组中GAD、DAO 活性均为0，表明萌芽过程使青稞体内开始进行生长代谢，激活各种酶活性，但是随着萌芽的进行，DAO 活性逐渐下降为0，可能代表多胺降解途径合成GABA 作用减弱。
低温胁迫中不同因素（萌芽时间、浸泡时间、培养温度）对PAO 活性的影响如表4所示。
表4 不同因素对萌芽青稞PAO 活性的影响
Table 4 Effect of different factors on PAO activity of sprouting highland barley
注：同列相同字母表示不同样品之间差异不显著（P<0.05），NA 表示该样品未检出活性，-表示未进行检测。
PAO 活性/（U/g）萌芽时间/h PAO 活性/（U/g）浸泡时间/h培养温度/℃PAO 活性/（U/g）NA 1.10±1.10a NA 1.04±1.04a 1.07±1.07a NA 0 14 16 18 20 22 1.07±1.07a 3.19±3.19a NA 1.07±1.07a 2.20±1.91a 2.16±1.87a 4 6 8 10-5 0 5 10 12-2.17±1.09a 3.32±1.92a 1.07±1.07a 2.15±1.08a 1.04±1.04a-15 25
由表4 可知，在不同处理组中PAO 活性均普遍较低，甚至在多组样品中并未检测到其活性，而且不同样品间PAO 活性并无显著性差异（P>0.05），表明在青稞萌芽时PAO 发挥的作用较小，对GABA 含量变化的影响不明显。
综上所述，可以得知在低温胁迫青稞萌芽的过程中，GABA 支路的关键合成酶GAD 活性与GABA 含量的关系最为密切，多胺降解途径的DAO 活性在0～2 U/g之间，PAO 活性在0～4 U/g 之间，这两种酶活性不高且变化不明显，在部分样品中未检出，表明低温富集青稞GABA 的主要调控途径为GABA 支路，多胺降解途径为次要方式。
3 结论
本文在单因素基础上利用响应面试验建立了低温胁迫萌芽富集青稞GABA 的模型，对此模型进行优化与分析，得到低温萌芽富集青稞GABA 的最佳工艺参数为浸泡时间8 h、萌芽时间16 h、培养温度0 ℃，在此工艺条件下制得的萌芽青稞中GABA 含量高达（78.70±1.73）mg/100 g，是青稞原料中所含GABA 的1.74 倍，且富集工艺条件简单、成本较低。并进一步揭示了GABA 合成酶活性与GABA 富集量存在一定相关性，多胺氧化酶对GABA 合成影响较小，GABA 支路途经是低温胁迫青稞GABA 合成的主要途径，但是后续仍需通过测定GABA 降解途径关键酶的活性，统一全面地分析胁迫萌芽过程GABA 合成的动态变化。
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