酪蛋白酸钠-多糖复合物的物化特性及其乳液稳定性

蛋白质和多糖作为重要的功能性生物大分子，可以有效调控食品加工中乳液体系的微观结构和感官品质，特别是蛋白质与多糖通过静电相互作用所形成的复合物已经被研究作为乳化剂以制备各种结构化功能性乳液[1]。与蛋白质乳液相比，蛋白质-多糖复合物可以有效改善乳液界面的结构和流变特性，增大油-水界面的空间位阻和静电斥力，增加乳液体系的黏弹性，从而提高乳液的稳定性和对环境的适应性[2-3]。蛋白质-多糖在复合过程可受内、外环境的影响而形成具有不同微观结构和表面特性的复合产物，因此研究如何构建不同尺度和特定结构的复合物以调控乳状液的稳定性已经成为目前乳液体系研究的热点。基于此，需要系统研究不同类型蛋白质与多糖在不同环境条件下所形成复合物的特性及其对乳液稳定性的影响。

酪蛋白酸钠是酪蛋白经酸化与碱中和处理后所得钠盐，具有较高的表面活性并能够在油—水界面上快速吸附以稳定乳液，然而NaCas 乳液易于受到不利环境因素和酶解的影响而发生失稳现象。果胶与卡拉胶则是稳定乳液常用的两种阴离子多糖。果胶分为高甲氧基和低甲氧基果胶，带电基团主要为羧基，溶于水中后具有较好的黏度；相对于果胶的带电基团，卡拉胶则是一种硫酸阴离子多糖，根据硫酸基团的数量和分布，主要分为3 种类型，κ-、ι-卡拉胶和λ-卡拉胶，其中ι-卡拉胶含有两个硫酸盐基，且具有溶于水后可形成凝胶的特性。相关研究表明，通过调整果胶和卡拉胶的浓度或溶液的pH 值可以有效地调控NaCas 与二者的静电相互作用及其复合物溶液连续相的黏度，从而影响不同pH 值下NaCas-果胶、卡拉胶复合物乳液的稳定性[4-5]。但对于多糖在电荷密度与流变特性上的差异性如何影响其复合物的理化特性、界面特性及其乳液体系的稳定性等方面的研究，尚缺少相关的系统性分析。

本研究采用NaCas、高甲氧基果胶（high methoxyl pectin，HMP）、低甲氧基果胶（low methoxyl pectin，LMP）和ι-卡拉胶（ι-carrageenan）为原料，通过调控pH值形成具有不同形态和物化特性的复合物，并对复合物乳液的稳定性进行分析，同时通过研究复合物的相关结构、流变特性及界面特性来探究影响乳液稳定性的相关机制，以期为合理构建复合物颗粒以应用于活性物质乳液递送系统及稳定性食品乳液体系的制备提供理论支持。

1 材料和方法

1.1 主要材料与试剂

酪蛋白酸钠、卡拉胶（均为生物试剂）：阿拉丁试剂（上海）有限公司；高甲氧基果胶（生物试剂）：上海麦克林生化科技股份有限公司；低甲氧基果胶：内蒙古康斯特生物科技有限公司；盐酸、氢氧化钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器与设备

Zetasizer Nano ZS 纳米粒度分析仪、Kinexus Pro+马尔文流变仪：英国马尔文仪器有限公司；UV-6100 紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；IKA T18均质机：德国IKA 公司；Nano DeBEE 动态高压微射流：美国BEE 公司；F-4600 荧光分光光度计：日本日立公司；DSA30S 界面流变仪：德国KRÜSS 公司；Frontier傅里叶红外光谱仪：珀金埃尔默企业管理（上海）有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 酪蛋白酸钠与多糖溶液的配制

分别配制质量分数为2% 的NaCas 储备溶液和0.5%的多糖储备溶液，加入0.01%的叠氮化钠抑制微生物的生长，在磁力搅拌器上搅拌2 h 至溶解，放置4 ℃冰箱过夜保证充分水化。

1.3.2 酪蛋白酸钠-多糖复合溶液的制备

将NaCas 与多糖按照不同物质的质量比（4∶1、3∶1、2∶1）混合，控制混合后总生物聚合物的质量分数为1%，搅拌1 h 后在85 ℃下水浴加热30 min，然后迅速冷却至室温，将不同质量比下蛋白-多糖溶液的pH值调至2.0～7.0，然后置于磁力搅拌器上混合均匀，制备出不同质量比pH 值下的蛋白-多糖复合物溶液。

1.3.3 酪蛋白酸钠-多糖混合体系浊度的测定

浊度采用紫外可见分光光度计对混合溶液的浊度进行测定，在波长600 nm 下采用1 cm 光程的比色皿测定样品的吸光度，浊度（T）的计算公式如下[6]。

式中：A 为稀释溶液在600 nm 处的吸光度；V 为稀释倍数；I 为光程，1 cm。

1.3.4 酪蛋白酸钠-多糖混合体系粒径及Zeta 电位的测定

将制备好的复合物溶液稀释至生物聚合物的质量浓度为0.1%，利用纳米粒度分析仪测量复合物溶液的粒径和电位，所有测量均在25 ℃下进行并重复3 次。

1.3.5 酪蛋白酸钠-多糖复合物乳液的制备

将不同的复合物溶液与玉米油以9∶1 的质量比进行混合，采用均质机在10 000 r/min 下分散2 min 得到粗乳液，然后采用动态高压微射流在68.95 MPa 的压力下均质3 次得到水包油乳液。

1.3.6 乳液稳定性指数的测定

利用高速离心法测定乳液的稳定性指数，该方法通过离心来加速乳液体系中油滴的上浮，以达到快速分析乳液稳定性的目的。将2 mL 乳液加入离心管中，在3 000×g 下离心10 min，在距离心管底部1 cm 处取样，用紫外可见分光光度计测定其在500 nm 下的吸光度，乳液稳定性指数（S）计算公式如下。

式中：A0 为离心前乳状液吸光度；At 为离心后乳状液的吸光度。

1.3.7 酪蛋白酸钠-多糖复合物的红外光谱

不同复合物的红外光谱参考Dai 等[7]的方法并稍作修改进行测定。将配制好的NaCas-果胶（NaCas-果胶的质量比为2∶1，pH 值为5.0）与NaCas-卡拉胶（NaCas 与卡拉胶的质量比为2∶1，pH 值为6.0）两种复合物溶液进行冷冻干燥，研钵磨细处理后，每份样品称取2.0 mg，然后与200 mg 溴化钾纯品混合研磨、压片。将压至透明状的样品取出夹好并放入傅里叶红外光谱仪的样品室中，以空气为空白对照，在4 000～500 cm-1范围内扫描。红外光谱的分辨率为4 cm-1，测量过程中累计扫描32 次信号得到样品的红外光谱图。

1.3.8 酪蛋白酸钠-多糖复合物的内源荧光光谱的测定

将质量比为2∶1、pH5.0 下的NaCas-果胶和pH6.0下的NaCas-卡拉胶两种复合物溶液在25 ℃、5 000×g的条件下离心10 min 后取上清液，测定上清液中蛋白浓度，将蛋白浓度稀释至0.5 mg/mL。参考Wang 等[8]的方法并稍作修改，以超纯水为空白对照，使用荧光分光光度计记录荧光强度，设置激发波长为280 nm，发射波长为300～500 nm，扫描速度为1 200 nm/s，狭缝宽度为5 nm。

1.3.9 酪蛋白酸钠-多糖复合物的表面张力

NaCas-多糖复合物的动态界面张力利用界面流变仪的悬滴法测定表面张力随时间的变化。采用微量注射针吸取一定体积，调节样品台的高度，针头插入盛有玉米油的透明玻璃凹槽内并滴出约48 μL 的复合物溶液。通过高速摄像系统持续采集液滴在静置3 600 s 期间的图像并进行数字化处理，然后根据Young-Laplace方程计算液滴的表面张力。

1.3.10 酪蛋白酸钠-多糖复合物的剪切黏度

根据Cai 等[9]的方法，采用流变仪测定NaCas 和NaCas-多糖复合物溶液的剪切流变特性，具体参数：直径40 mm 的平板、板间距为1 mm、测定温度为25 ℃、剪切速率为0～200 s-1。

1.4 数据统计与分析

试验数据采用Origin 2018 软件作图，结果表示为平均值±标准差，SPSS 软件Duncan 检验法进行差异显著性分析（P<0.05）所有试验均重复3 次。

2 结果与分析

2.1 浊度的分析

浊度的测定可以有效直观地检验复合物的形成[10]，NaCas 与多糖复合物溶液的浊度在不同质量比条件下随pH 值变化曲线见图1。

如图1所示，在3 种NaCas 与多糖质量比条件下，当pH 值为6.0 和7.0 时浊度均较低，体系均保持澄清透明状态，这说明所形成静电复合物较少。当pH 值降至5.0 时，复合物溶液体系的浊度开始增大，这主要是因为带负电的多糖与蛋白质链上的局部正电荷之间产生静电相互作用形成可溶性复合物[11]。随着复合物溶液的pH 值降至4.0，3 种复合物溶液的浊度均有明显增大并且观察到不溶物的产生，这与接近NaCas 的等电点有关[5]。对于NaCas-果胶复合物，当pH 值为3.0时显示其浊度达到最大值，这主要是由于此时NaCas与果胶之间的静电作用较强而形成较大粒径的胶体颗粒，并且通过观察可以发现体系此时发生了相分离；当pH 值进一步降低至2.0 时，溶液的浊度降低[12]，这是由于体系的pH 值低于果胶的解离常数（pKa），果胶发生质子化，部分NaCas-果胶的静电复合物发生解离[13-14]。但对于NaCas-卡拉胶复合物而言，可能是由于卡拉胶的pKa 低于果胶，因此NaCas-卡拉胶复合物的浊度值在pH 值2.0 下达到最大值。由图1 可知，NaCas-多糖的质量比及多糖种类均对浊度有明显的影响，当Na-Cas-多糖的质量比为4∶1，pH 值在NaCas 等电点（pH4.6）附近时其复合物溶液的浊度值均较大，这是由于此时NaCas 分子间发生聚集作用且由于多糖浓度较低不能完全覆盖蛋白质表面，易于发生桥接絮凝，但随着多糖质量比的增大，体系的浊度则有不同程度的降低，这是由于更多的多糖分子与NaCas 通过静电相互作用以抑制蛋白的聚集行为以及大颗粒复合物的形成[15]。对于卡拉胶而言，可能由于卡拉胶的分子量较大并且蛋白质的NH3+基团对—OSO3-—基团的分子吸引力要比—COO-—基团强[16]，所以在相同的质量比及pH值下，NaCas-卡拉胶复合物体系表现出较高的浊度值。由图1 可知，当pH 值在4.0～7.0 时，NaCas 可以与多糖形成可溶性复合物，已经可以满足后续相关乳液体系的研究，因此后面主要研究该pH 值范围下复合物溶液的相关理化特性和乳液稳定性。对于卡拉胶而言，研究发现在pH4.0 下NaCas-卡拉胶复合物容易形成凝胶而不利于溶液的制备，因此在后面的研究中排除了pH 值在4.0 下NaCas-卡拉胶复合物。

2.2 酪蛋白酸钠-多糖混合体系Zeta 电位及粒径的分析

蛋白-多糖混合体系的pH 值及质量比对蛋白质-多糖复合物的形成及其理化特性有着重要影响。NaCas-多糖不同质量比pH 值条件下复合物溶液的Zeta 电位见表1。

如表1所示，随着pH 值的降低，复合物溶液的Zeta 电位绝对值也在降低，这是由于当pH 值降低时NaCas 所带正电荷量增加，可以使其与带负电荷的多糖发生更强的静电相互作用，因此导致所形成复合物的净电荷减少，同时也导致静电排斥力减弱，从而体系易发生聚集而产生凝聚和沉淀，这与浊度的结果一致[17-18]。另外由表1 可知，在相同pH 值下随着多糖质量比的增加，更多的多糖与蛋白质发生静电相互作用而使得Zeta 电位绝对值增大，这也将使得液滴之间的斥力越大，增加体系的稳定性[19]。由于3 种多糖所带电荷密度不同，其中卡拉胶和低甲氧基果胶因所带电荷密度较大，其与NaCas 的静电结合作用较强，也易于使得NaCas 分子在静电作用下展开，因此在相同pH值和质量比下这两种复合物所呈现的Zeta 电位绝对值较高，意味着其所形成的乳液稳定性较好。

不同NaCas-多糖质量比和pH 值下复合物溶液粒径见表2。

由表2 可知，在同一复合物质量比下，随着pH 值的降低，NaCas-多糖混合物的水合粒径逐渐增大。在pH 值为6.0 和7.0 的条件下，蛋白与多糖间的静电相互作用较弱，不利于复合物的形成，此时蛋白与多糖以共溶的状态存在于体系中，但pH 值降低至5.0 时，蛋白与多糖间的静电相互作用增强，形成紧密的复合物，粒径显著增大，但随着pH 值的进一步降低，由于净电荷的减少NaCas 会发生聚集并产生沉淀从而导致粒径的增加[18]。对于NaCas-果胶两种复合物溶液而言，在pH5.0 下，随着果胶含量的增加，吸附于NaCas 表面的果胶增多，因此静电排斥和空间位阻增大，从而使得粒径降低；但在pH4.0 下，NaCas-果胶两种复合物粒径先减少后增大，这是因为该pH 值下NaCas 表面正电荷较多，在NaCas-多糖质量比为2∶1 时其表面吸附的多糖较多，外层的果胶分子交联使得粒径增大。另外还可以明显发现，随着卡拉胶含量的增加，相同pH 值下NaCas-卡拉胶复合物体系的粒径均增大，这是因为卡拉胶的电荷密度大，其与NaCas 之间的相互作用较强，且卡拉胶易于形成凝胶颗粒，因此使得复合物的粒径急剧增大，这也与浊度的结果相一致。

2.3 乳液稳定性指数的分析

乳液的稳定性是其被应用于功能性食品加工中的重要指标，NaCas-多糖不同质量比及pH 值条件下乳液的稳定性指数见表3。

由表3 可知，对于NaCas-果胶复合物，当pH 值为5.0 时，乳液的稳定性最好。这可能是由于在该pH 值下，两种果胶与NaCas 之间的静电相互作用相对较强，可以在乳液的界面处形成更加致密的界面层从而阻止液滴间的絮凝聚集[20]。但在pH 值为4.0 的条件下，乳液则出现了聚集体，这种现象归因于NaCas 的溶解性降低以及桥接絮凝作用[21]。而对于NaCas-卡拉胶复合物而言，当pH 值为6.0 时其乳液的稳定性最好且稳定性指数在所有复合物乳液中最大，这与此时复合物的Zeta 电位绝对值较大有关外，还与卡拉胶较高的黏度有关。另外可能是因为在pH5.0 下NaCas-卡拉胶易于发生分子聚集而黏度增加，不利于NaCas 分子在界面的吸附而影响乳液的稳定性，因此黏度作为影响乳液稳定性的重要因素，在制备乳液时需要综合考虑。

另外，随着多糖质量比的增加，乳液的稳定性指数增加，当NaCas 与多糖的质量比为2∶1 时，乳液的稳定性最好。这是因为多糖的增加可以使液滴之间的静电排斥力和空间位阻作用增大，从而阻止液滴的絮凝聚集作用。同时，NaCas 与多糖复合后能够改善NaCas 的溶解度以及诱导构象变化以提高分子在界面上的吸附能力，从而提高乳液的保护层以防止液滴的聚集，而当多糖的质量比较低时，多糖浓度不足以完全覆盖蛋白质包被的液滴表面，反而可能通过多糖分子在液滴间发生桥接絮凝[22]。

2.4 复合物的结构分析

根据上述2.3 对NaCas-多糖复合物乳液稳定性的研究分析，选取不同NaCas-多糖质量比条件下具有较好乳液稳定性所对应的复合物进行相关的结构分析，即选择NaCas-果胶质量比为2∶1、pH5.0 的复合物，以及NaCas-卡拉胶质量比2∶1、pH6.0 的复合物进行后续试验，以便更好地解析复合物影响乳液稳定性的相关机制。

2.4.1 傅里叶红外光谱分析

傅里叶红外光谱可以用来研究NaCas 与多糖在形成复合物时分子间潜在的相互作用。NaCas 与不同多糖及其复合物的红外光谱图见图2。

如图2所示，红外谱图中的酰胺I 带和酰胺Ⅱ带分别对应1 700～1 600 cm-1和1 600～1 500 cm-1[23]。NaCas在1 658、1 513、1 438 cm-1 处的峰分别由

伸缩振动、N—H 弯曲振动和C—N 伸缩振动产生。当形成复合物时，其酰胺I 带和酰胺Ⅱ带均发生位移，可以说明NaCas 与多糖间形成复合物时存在静电相互作用[24]，且表明多糖的加入对NaCas 的二级结构、C—N伸缩振动和N—H 弯曲振动有影响。1 658 cm-1 出现吸收峰的改变可能是因为通过静电作用和氢键作用形成的NaCas-多糖复合物对NaCas 的α-螺旋结构产生的影响[25]。1 234 cm-1 对应的酰胺Ⅲ带中—C—NH2 的伸缩振动，随着多糖的加入谱带也发生了偏移，表明NaCas 中的—NH3+基团和多糖中的—COO-和硫酸根基团发生静电作用，这一现象说明NaCas 和多糖之间存在静电相互作用和疏水相互作用。这些二级结构上的变化会影响到乳液的稳定性。

2.4.2 内源荧光光谱的分析

蛋白质的内源荧光特性可以用来反应蛋白结构的变化从而反映出其与多糖的相互作用。NaCas-多糖复合物的内源荧光光谱见图3。

如图3所示，可以发现随着多糖的添加，其荧光强度有不同程度的降低，其最大吸收波长也发生了不同程度的蓝移。这可能是由于多糖分子的羟基与NaCas裸露的活性基团发生相互作用，形成空间位阻效应以阻断信号荧光残基[26]。因为NaCas 与多糖复合后，NaCas发生折叠导致结构变得更紧凑，分子间形成聚集体，将荧光发色基团包裹在内部更加疏水的环境中，从而使得最大吸收波长发生蓝移和荧光强度降低[27]。NaCas-果胶复合物发生蓝移及荧光强度降低的程度明显高于NaCas-卡拉胶复合物，说明与果胶复合后，NaCas 发生聚集的程度更大，这是因为NaCas-果胶复合物在pH5.0 的条件下静电相互作用更强，故蛋白折叠聚集程度更大。蛋白质的聚集程度可能会影响分子在界面上的吸附速率和界面吸附量从而进一步影响乳液的稳定性。

2.4.3 界面张力的分析

界面张力可以反映乳化剂的界面活性，可以用来表征其在乳液界面上所发生的吸附和置换行为，也可以用来评估乳液形成能力和乳液的稳定性。NaCas 以及其多糖复合物吸附于油-水界面后的界面张力（γ）随时间的变化见图4。

如图4所示，γ 值随着吸附时间的延长而逐渐降低，表明NaCas 分子或NaCas-多糖复合物逐渐吸附到了油-水界面上，且γ 值在前期降低速度较快，之后逐渐达到准平衡状态，这是由于分子量较大的表面活性物质在界面上的吸附过程较为缓慢[28]。界面张力降低的程度取决于界面上所吸附的乳化剂分子的数量，由图4 可知，对比其他样品，NaCas-果胶复合物可以有效降低油-水界面张力，这是因为在pH5.0 的条件下，果胶使得NaCas 的亲水性增加而有利于其在界面的扩散吸附，同时在该pH 值下果胶与NaCas 间存在一定静电斥力及热力学不相容特性，这可能也促进了NaCas分子在界面的吸附[15]。而对于卡拉胶而言，由于NaCas-卡拉胶复合物的粒径较大，此分子运动受阻而导致其界面张力较大[29]。因此从界面张力的结果来分析，NaCas-果胶的乳化能力和乳液稳定性要优于NaCas 和NaCas-卡拉胶复合物样品，但由于溶液体系的黏度也对乳液稳定性有较大影响，因此结合复合物溶液的剪切黏度进行分析可以更好地推测出不同复合物下影响其乳液稳定性的主要因素。

2.4.4 NaCa-多糖复合物的剪切黏度分析

NaCas 及NaCas-多糖复合物的剪切黏度见图5。

如图5所示，NaCas 及NaCas-多糖复合物的剪切黏度都呈现剪切稀化现象，即均属于假塑性非牛顿流体，这是因为复合体系的空间结构会因为剪切速率的增加被破坏，分子间相互缠绕的链被解开，剪切阻力变小导致黏度降低[25]。同时可以看出NaCas-多糖复合物溶液的黏度明显高于NaCas 溶液，一方面是因为多糖自身的增稠效果，并且由于卡拉胶的水溶液具有较好的黏弹性，可以形成凝胶网络结构，故NaCas-卡拉胶的复合物溶液剪切黏度高于NaCas-果胶复合物溶液。另一方面是二者间由于静电吸引及疏水相互作用增大了分子间的相互作用，从而使得复合物溶液具有更高的黏度[30]。黏度的增加有利于增强乳液的稳定性，但同时也要考虑在均质过程中对NaCas 吸附与界面即乳化能力的影响，因此，适当的溶液黏度也是维持乳液稳定性的关键。

3 结论

本研究对比分析了NaCas-HMP、NaCas-LMP 和NaCas-卡拉胶等复合物在不同蛋白质-多糖质量比和pH 值下的浊度、粒径、Zeta 电位的物化性质及其乳液的稳定性。研究表明pH 值和NaCas-多糖质量比可以通过改变电荷量、静电斥力以及空间位阻作用从而显著影响NaCas 与多糖之间的相互作用，当pH 值为6.0和5.0 时开始形成可溶性复合物且随着多糖含量增加有利于复合物的形成。同时还发现由于3 种多糖所带电荷密度及分子量的不同，使其与NaCas 的相互作用强度不同，所形成复合物在粒径，Zeta 电位上存在差异。通过对NaCas-多糖复合物乳液稳定性进行分析发现，当NaCas-多糖质量比为2∶1、pH5.0 时NaCas-果胶复合物稳定乳液的性质较好，而NaCas-卡拉胶复合物则在质量比为2∶1、pH6.0 下所制备的乳液具有最好的稳定性。最后对可制备稳定乳液的3 种NaCas-多糖复合物进一步进行傅里叶红外光谱、荧光光谱、界面张力以及流变特性的研究分析，以探讨复合物影响乳液稳定性的机制，结果表明NaCas 与多糖间的相互作用主要为静电相互作用、疏水相互作用及氢键，并通过上述的相互作用使得蛋白质的三级结构发生改变。同时多糖的加入显著改善了分子在界面上的吸附，并增大了体系的黏度从而有利于改善乳液的稳定性。该试验结果为蛋白-多糖复合物稳定乳液提供理论基础，同时为复合物稳定乳液应用于食品领域提供参考。

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