冬荪（Phallus inpudicus L.ex.Pers.）为鬼笔科（Phallacea）鬼笔属（Phallus）真菌，又称白鬼笔，别称无裙荪、竹下菌、竹菌，是珍稀特色名贵食药用菌[1]。冬荪味道鲜美，口感松脆，有着极高的营养价值。同时，冬荪的菌柄、菌托和子实体可入药，药性为甘，淡、性温，有活血止痛、祛风除湿的功效，可用于治疗风湿痛[2]。现代药理研究发现，冬荪具有抗癌[3]、抗糖尿病[4]、抗凝血[5]、活血化瘀[6]等作用。多糖是冬荪中重要的活性物质，具有多种生物功能。Buko 等[7]发现，冬荪菌丝体多糖在体外和体内（链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠）均具有免疫调节作用；含有10% 白鬼笔多糖的软膏，能促进实验大鼠的皮肤创面愈合，促进肉芽组织的上皮形成、收缩和生长。冬荪及其多糖在医疗保健领域有很好的开发利用价值。然而在冬荪加工产业中，其资源并未得到充分利用。冬荪折干率仅为5%，子实体可用部位不足30%，菌托和孢子体常被作为废弃物丢弃，造成资源浪费和环境污染。目前，对冬荪的研究多集中在可食用部位，对菌托的研究较少。近年来冬荪在贵州省大面积种植，贵州省毕节市大方县的“大方冬荪”已获批国家地理标志产品，对冬荪资源进行充分开发和高值化利用具有重要意义。课题组前期研究发现，冬荪废弃物菌托中的多糖含量是子实体中多糖含量的4 倍[5]，如将废弃的菌托变废为宝，将对提高冬荪的附加值具有积极作用。
多糖因其具有良好的免疫调节作用而受到人们的广泛关注。人体的免疫系统可以抵御外来入侵，保护人体健康。当身体免疫功能受到抑制时，它会受到传染病、癌症和其他疾病的侵袭。研究发现，肠道菌群与宿主免疫密切相关，可通过触发免疫反应发挥促炎和抗炎作用，肠道微生物在免疫系统发育和维持中具有关键作用[8-9]。多糖通常是宿主难以消化的成分，短链脂肪酸（short-chain fatty acid，SCFAs）是肠道多糖的主要代谢产物，在调节免疫的多个方面发挥着重要作用。短链脂肪酸会影响T 细胞和树突状细胞，从而诱发免疫反应[10]。多糖对肠道菌群具有明显的调节作用，可以改善菌群失调，恢复到正常状态。
本研究结合冬荪在贵州省丰富的资源优势，以环磷酰胺（cyclophosphamide，CXT）致免疫低下的小鼠为模型，探究冬荪多糖对小鼠免疫力及肠道菌群稳态的影响，为冬荪资源的高值化利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 动物、材料与试剂
SPF 级昆明小鼠[雌雄各半，体质量（20±2）g，许可证号XSCXK（辽）2020-0001]：辽宁长生生物技术股份有限公司。
冬荪子实体及菌托干品：贵州省德江县绿通天麻发展有限公司露青种植基地。参照首坤秀[5]的方法分别制备得到冬荪菌托多糖（polysaccharides from P.inpudicu egg tray，PIT）和子实体多糖（polysaccharides from P.inpudicu fruiting body，PIF）。
注射用环磷酰胺：百特国际有限公司；肿瘤坏死因子α（tumor nerosis factor-α，TNF-α）酶联免疫法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒、白介素2（interleukin-2，IL-2）ELISA 试剂盒、白介素6（interleukin-6，IL-6）ELISA 试剂盒、干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）ELISA 试剂盒：博士德生物工程有限公司；过氧化氢酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）试剂盒：南京建成生物工程研究所。
1.2 主要仪器与设备
Centrifuge 5427 R 冷冻离心机：德国艾本德股份公司；JA2003 电子天平：上海菁海仪器有限公司；Varioskan LUX 酶标仪、902GP-ULTS-80 ℃超低温冰箱：美国赛默飞世尔科技公司。
1.3 方法
1.3.1 动物分组与处理
将90 只SPF 级昆明小鼠适应性喂养一周后，取10 只做空白组（NC），其余80 只按70 mg/（kg·d）剂量腹腔注射环磷酰胺，连续注射5 d，建立免疫抑制小鼠模型。将建模小鼠随机分为模型组（MC）、冬荪子实体多糖低（PIFL）、中（PIFM）、高（PIFH）剂量组，冬荪菌托多糖低（PITL）、中（PITM）、高（PITH）剂量组，每组10 只。空白组和模型组按0.1 mL/10 g 剂量灌胃生理盐水；冬荪子实体多糖和菌托多糖低中高组分别按照100、200、400 mg/kg 剂量灌胃。连续灌胃14 d，期间每天观察小鼠精神、运动、饮食情况。
1.3.2 样品采集及处理
末次给药后，禁食12 h，称小鼠体质量，眼眶取血。取20 μL 血液白细胞计数，其余血样4 ℃静置4 h，4 ℃下35 000 r/min 离心10 min，取血清，存放于-20 ℃冰箱。颈椎处死，取胸腺、脾脏，脾脏保存于-80 ℃冰箱备用。收集小鼠盲肠内容物于无菌离心管，-80 ℃保存，备用。
1.3.3 全血白细胞数测定
取20 μL 小鼠全血与白细胞稀释液（蒸馏水98 mL、冰醋酸2 mL、10 g/mL 台盼蓝5 滴）0.38 mL 混匀，用低倍镜观察白细胞数，计数4 个大方格内的白细胞数（N），全血白细胞数（X）计算公式如下。
X=（N/20）×109
1.3.4 小鼠免疫器官指数测定
末次给药后，称量小鼠体质量（N，10 g），颈椎处死，解剖小鼠，取脾脏、胸腺（M，mg）称重，脏器指数（A，mg/10 g）计算公式如下。
A=M/N
1.3.5 小鼠血清中细胞因子水平和酶活力测定
取冻存的血清，采用ELISA 试剂盒测定IL-6、IL-2、TNF-α、IFN-γ 含量；按照试剂盒说明书测ACP、LDH活力。
1.3.6 抗氧化应激能力的测定
取脾脏组织约50 mg，放入2 mL 离心管中，剪碎后加9 倍体积生理盐水，冰浴条件下匀浆，4 ℃下2 500 r/min 离心10 min，取上清液，按照试剂盒说明书分别检测CAT 活力和MDA 含量。
1.3.7 脾组织形态学分析
小鼠脾脏用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗净，放入4%多聚甲醛溶液中，固定24 h，脱水，石蜡包埋，切片。苏木精-伊红染色（hematoxylineosin staining，H&E）5 min，脱水，用中性树胶封片，在光学显微镜下观察组织病理情况，并采集图片。
1.3.8 小鼠盲肠内容物中短链脂肪酸（SCFAs）含量测定
取50 mg 盲肠内容物于2 mL 离心管中，加入1 mL纯水，涡旋10 s；40 Hz 研磨仪处理4 min，冰水浴中超声5 min，重复3 次；盲肠内容物浆液4 ℃下5 000 r/min离心20 min；取0.8 mL 上清液于2 mL 离心管中，加入0.1 mL 50% H2SO4，0.8 mL 内标溶液（2-甲基戊酸，25 mg/L），涡旋混匀，振荡10 min，冰水浴中超声10 min；再将混合溶液4 ℃下10 000 r/min 离心15 min，-20 ℃静置30 min，取上清液用气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography-mas spectrometry，GC-MS）检测。
1.3.9 肠道菌群16S rRNA 测序
小鼠盲肠内容物提取样品总DNA 后，根据保守区设计得到引物，在引物末端加上测序接头，进行聚合酶链式反应扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用Illumina Novaseq 6000 进行测序。
1.4 数据统计分析
采用Graphpad Prism 软件（版本8.0.1）处理数据，统计分析采用单因素方差分析。采用Tukey 法进行组间多重比较，以确定差异是否显著。所有结果以平均值±标准差表示，P<0.05 被认为具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 冬荪多糖对免疫抑制小鼠全血中白细胞数的影响
冬荪多糖对小鼠全血中白细胞数的影响如图1所示。
图1 冬荪多糖对小鼠全血中白细胞数的影响
Fig.1 Effects of polysaccharides from P.inpudicu on total white blood cell count in mice
与NC 组相比，*表示差异显著（P<0.05），**表示差异极显著（P<0.01），***表示差异高度显著（P<0.001）；与MC 组相比，##表示差异极显著（P<0.01），###表示差异高度显著（P<0.001）。
由图1 可知，MC 组的白细胞数高度显著低于NC组（P<0.001），说明造模成功。与MC 组相比，PIFL、PIFM、PIFH、PITL、PITM 和PITH 组的白细胞数极显著升高（P<0.01），PITM、PITH 组与NC 组相比无显著差异，说明各给药组可通过增加白细胞数增强小鼠免疫功能。
2.2 冬荪多糖对小鼠免疫器官指数的影响
胸腺和脾脏是重要的免疫器官，其功能可通过胸腺指数和脾脏指数来反映[11]。冬荪多糖对小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响如图2所示。
图2 冬荪多糖对小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响
Fig.2 Effects of polysaccharides from P.inpudicu on thymus index and spleen index of mice
与NC 组相比，*表示差异显著（P<0.05）；与MC 组相比，#表示差异显著（P<0.05），##表示差异极显著（P<0.01）。A.胸腺指数；B.脾脏指数。
由图2 可知，MC 组的胸腺指数和脾脏指数显著低于NC 组（P<0.05），说明环磷酰胺能诱导小鼠免疫低下。与MC 组相比，PIFH 组胸腺指数显著升高（P<0.05），其余各组显著不差异（P>0.05）；与MC 组相比，PIFL、PIFM、PIFH、PITL 和PITM 组脾脏指数显著升高（P<0.05 或P<0.01）。
2.3 冬荪多糖对免疫抑制小鼠血清中细胞因子水平和酶活力的影响
IL-2 是辅助性T 淋巴细胞分泌的重要免疫因子，可促进T 细胞的生长和分化，并诱导杀伤细胞分化[12]。IL-6 是最重要的免疫和炎症介质之一，可调节T 细胞和B 细胞的免疫应答[13]。IFN-γ 具有广泛的生物效应，是主要的免疫调节分子之一，促进T 细胞分化，作用于巨噬细胞，增强抗微生物免疫[14]。TNF-α 是免疫应答的重要细胞因子，由巨噬细胞分泌、能够直接杀死肿瘤的细胞因子[15]。冬荪多糖对免疫抑制小鼠血清中细胞因子水平和酶活力的影响如图3所示。
图3 冬荪多糖对血清中细胞因子水平和酶活力的影响
Fig.3 Effects of polysaccharides from P.inpudicu on the cytokine levels and enzyme activities in serum
A.IL-2 含量；B.IL-6 含量；C.TNF-α 含量；D.IFN-γ 含量；E.LDH 活力；F.ACP 活力。与NC 组相比，*表示差异显著（P<0.05），**表示差异极显著（P<0.01）；与MC 组相比，#表示差异显著（P<0.05），##表示差异极显著（P<0.01），###表示差异高度显著（P<0.001）。
由图3 可知，与NC 组相比，MC 组小鼠血清中细胞因子IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ 含量和LDH、ACP 活力均显著下降（P<0.05 或P<0.01），说明免疫抑制小鼠模型构建成功。图3A 显示，与MC 组相比，PITL 和PITH 组能极显著上调IL-2 含量（P<0.01），而其余各组差异不显著；图3B 显示，与MC 组相比，PIFM 和PITM组能显著上调IL-6 含量（P<0.05 或P<0.01），而其余各组差异不显著；从图3C 中可看出，除PITM 组外，其余各组均能显著增加TNF-α 含量（P<0.05 或P<0.01）；图3D 显示，除PITM 组外，其余各组均能显著增加IFN-γ含量（P<0.05，P<0.01 或P<0.001）。说明PIF 和PIT可促进免疫抑制小鼠分泌细胞因子，增强小鼠的免疫功能。
酸性磷酸酶（ACP）是重要的溶酶体酶，参与体液免疫反应，是经典的巨噬细胞溶酶体标记物[16]，在细胞代谢中发挥重要作用，催化磷酸蛋白的水解和磷酸基的转移。乳酸脱氢酶（LDH）是一种可溶性胞质酶，它可以反映细胞、组织和器官的损伤[17]。LDH 和ACP 能够直观的反映巨噬细胞的激活程度。如图3E所示，PIFL、PIFM、PIFH 和PITM 组LDH 活力显著高于MC组（P<0.05，P<0.01 或P<0.001）；图3F 显示，PIFL、PIFM、PITM 和PITH 组能显著增加ACP 活力（P<0.05或P<0.01）。说明PIF 和PIT 可上调小鼠体内的LDH和ACP 活力，增强小鼠巨噬细胞活性。
2.4 冬荪多糖对免疫抑制小鼠脾脏抗氧化应激能力的影响
环磷酰胺可引起机体氧化应激，CAT 和MDA 与人体的抗氧化防御系统密切相关[18]。当抗氧化系统受损时，会产生过量的脂质过氧化物，如MDA，从而造成细胞损伤。在细胞中，过氧化氢被CAT 催化分解成H2O 和O2。冬荪多糖对免疫抑制小鼠脾脏抗氧化应激能力的影响如图4所示。
图4 冬荪多糖对免疫抑制小鼠脾脏抗氧化应激能力的影响
Fig.4 Effects of polysaccharides from P.inpudicu on antioxidative stress ability of spleen in immunosuppressed mice
A.MDA 含量；B.CAT 活力。与NC 组相比，*表示差异显著（P<0.05），**表示差异极显著（P<0.01），***表示差异高度显著（P<0.001）；与MC 组相比，#表示差异显著（P<0.05），##表示差异极显著（P<0.01），###表示差异高度显著（P<0.001）。
由图4 可知，与NC 组相比，MC 组MDA 含量高度显著升高（P<0.001），CAT 活力高度显著下降（P<0.001），说明免疫抑制小鼠模型构建成功。与MC 组相比，PIFL、PIFM、PIFH、PITL、PITM 和PITH 组MDA含量显著下降（P<0.05 或P<0.001），CAT 活力均显著升高（P<0.01 或P<0.001）。
2.5 冬荪多糖对免疫抑制小鼠脾损伤的影响
H&E 染色病理结果如图5所示。
图5 冬荪多糖对小鼠脾脏形态结构的影响（200×）
Fig.5 Effects of polysaccharides from P.inpudicu on the morphological structure of mice spleen（200×）
由图5 可知，NC 组小鼠脾脏结构清晰，淋巴细胞排列紧密，红髓和白髓结构完整。MC 组白髓模糊，淋巴细胞排列不整齐，数量减少。给药后PIT 和PIF 组小鼠脾脏组织中淋巴细胞明显高于MC 组，且淋巴细胞排列紧密，淋巴细胞增多，表明PIT 和PIF 能有效改善脾损伤。
2.6 冬荪多糖对小鼠盲肠内容物中SCFAs 含量的影响
肠道菌群与宿主免疫息息相关。SCFAs 含量作为复合碳水化合物肠道微生物发酵的主要终产物，在调节免疫反应、维持上皮屏障功能、抑制肿瘤等方面发挥着有效作用[19]。它们主要包括乙酸、丙酸、丁酸和戊酸。乙酸可增强活性氧的产生和吞噬，诱导细胞凋亡，调节中性粒细胞的招募[20]。丁酸是肠上皮细胞的主要能量来源，具有调节上皮细胞生长和免疫应答、保护肠相关疾病的作用[21]。冬荪多糖对小鼠盲肠内容物中SCFAs 含量的影响如图6所示。
图6 冬荪多糖对小鼠盲肠内容物中SCFAs 含量的影响
Fig.6 Effects of polysaccharides from P.inpudicu on the SCFAs content in cecal contents of mice
与NC 组相比，*表示差异显著（P<0.05），**表示差异极显著（P<0.01）；与MC 组相比，#表示差异显著（P<0.05），##表示差异极显著（P<0.01）。
由图6 可知，MC 组盲肠内容物中SCFAs 含量较NC 组显著降低（P<0.05 或P<0.01）；与MC 组相比，PIFL、PIFM、PIFH、PITL、PITM 和PITH 干预后，小鼠盲肠内容物中各种酸和总短链脂肪酸得到不同程度的提高，PIFL 效果尤为突出（P<0.01）。
2.7 冬荪多糖对免疫抑制小鼠肠道菌群的调节作用2.7.1 肠道菌群多样性分析
肠道菌群由数万亿的细菌组成，它们与宿主有无数的相互作用，并通过细菌成分和代谢物在调节宿主免疫系统中发挥重要作用[22]。将收集的小鼠盲肠内容物样品进行16S rRNA 测序，共获得2 880 267 对Reads，双端Reads 质控、拼接后共产生2 873 943 条Clean Reads，每个样品至少产生79 419 条Clean Reads，平均产79 832 条Clean Reads。根据97%的成对一致性阈值定义操作分类单元（operational taxonomic units，OTUs）。Chao1 指数和ACE 指数衡量物种丰度即物种数量的多少。Shannon 指数和Simpson 指数用于衡量物种多样性，受样品群落中物种丰度和物种均匀度的影响。相同物种丰度的情况下，群落中各物种具有越大的均匀度，则认为群落具有越大的多样性，Shannon指数值越大，Simpson 指数值越大，说明样品的物种多样性越高。各组肠道菌群OTUs 和α-多样性指数如表1所示。
表1 各组肠道菌群OTUs 和α-多样性指数
Table 1 OTUs and α-diversity indices of gut microbiota in various groups
注：与NC 组相比，*表示差异显著（P<0.05）。
组别NC Shannon 6.05±0.46 MC 5.51±0.47 PIFL PIFM 4.57±1.12*6.56±0.35 PIFH 5.92±1.15 PITL 6.34±0.33 PITM 6.08±0.74 PITH OTUs 214.67±44.27 155.33±41.28 175.67±6.03 226.33±16.44 190.33±81.08 231.67±23.12 216.67±59.52 190.67±27.54 Simpson 0.96±0.02 0.95±0.15 0.85±0.11 0.98±0.01 0.96±0.03 0.97±0.14 0.96±0.20 0.90±0.43 Chao1 214.67±44.29 155.83±40.85 176.00±6.00 226.50±16.35 190.67±80.90 231.83±23.25 217.00±59.53 190.67±27.54 ACE 214.78±44.36 156.25±40.85 175.93±6.00 226.68±16.25 190.69±81.22 232.07±23.45 217.12±59.69 190.80±27.56 5.18±0.71
由表1 可知，与MC 组相比，PC、PIFL、PIFM、PIFH、PITL、PITM 和PITH 组OTUs 数量有所增加，但无显著差异。β 多样性分析结果如图7所示。
图7 β 多样性分析
Fig.7 β-diversity index analysis
A.PCA；B.层次聚类分析。
由图7 可知，MC 组和其他给药组干预明显影响肠道菌群组成，NC、PIFL、PIFM、PIFH、PITL、PITM 和PITH 组样本间的距离表明，PIF 和PIT 干预可以逆转环磷酰胺引起小鼠肠道菌群组成的改变，使肠道菌群组成趋于正常。
2.7.2 肠道菌群组成分析
肠道菌群门水平上的相对丰度分布和主要门的相对丰度如图8所示。
图8 肠道菌群门水平上的相对丰度分布和主要门的相对丰度
Fig.8 The relative abundance on gut microbiota in the phylum level and the relative abundances of Bacteroides，Firmicutes，Proteobacteria and Deferribacteres in significant phylum level
A.门水平上的相对丰度分布；B～E.主要门的相对丰度；与NC 组相比，*表示差异显著（P<0.05）；与MC 组相比，#表示差异显著（P<0.05）。
由图8 可知，在门水平上，小鼠的肠道微生物主要由厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）组成，占比超过90%。Firmicutes 和Bacteroidetes 可在碳水化合物活性酶的基础上处理和清除膳食多糖，其中Bacteroidetes 是复合碳水化合物发酵中主要的糖化菌，而Firmicutes 更喜欢低聚糖[23]。Bacteroidetes 比Firmicutes 编码更多的酶来降解不可消化的多糖，这个过程中，不同的多糖被肠道特定微生物利用，导致SCFAs和乳酸的产生，对宿主的健康产生有益的影响[24]。与MC 组相比，PIF 和PIT 能够显著增加Bacteroidetes 相对丰度（P<0.05），同时减少Firmicutes 相对丰度，表明PIF 和PIT 可降低Firmicutes/Bacteroidetes（F/B）比例。
肠道菌群科水平上肠道微生物的比较分析结果如图9所示。
图9 肠道菌群科水平上肠道微生物的比较分析
Fig.9 Comparative analysis of intestinal microbes in the family level of gut microbiota
A.科水平上的相对丰度分布；B～G.主要科Deferribacteraceae、Desulfovibrionaceae、Lachnospiraceae、Muribaculaceae、Prevotellaceae、Ruminococcaceae 的相对丰度。与NC 组相比，*表示差异显著（P<0.05），**表示差异极显著（P<0.01）；与MC 组相比，#表示差异显著（P<0.05），##表示差异极显著（P<0.01），###表示差异高度显著（P<0.001）。
由图9 可知，在科水平上，检测出小鼠肠道菌群主要由10 个菌科组成其中，Muribaculaceae 的相对丰度最高。与NC 组相比，MC 组小鼠肠道菌群中有益菌Muribaculaceae、Prevotellaceae 的相对丰度显著降低（P<0.05），有害菌Lachnospiraceae、Ruminococcaceae、Desulfovibrionaceae、Deferribacteraceae 的相对丰度显著增加（P<0.05）。PIF 和PIT 干预后可增加有益菌Muribaculaceae、Prevotellaceae 的相对丰度，同时抑制有害菌Lachnospiraceae、 Ruminococcaceae、 Desulfovibrionaceae、Deferribacteraceae 相对丰度。PIF 和PIT 可调节免疫抑制小鼠肠道菌群的组成与多样性，从而维持良好的肠道微生态环境。
3 结论
为提高冬荪的高值化利用，探究其免疫活性。研究表明，从冬荪子实体和菌托中提取的多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制具有保护作用。冬荪菌托多糖和子实体多糖均能提高环磷酰胺处理小鼠的脾脏指数、胸腺指数、白细胞数，具有抗氧化应激能力，能促进小鼠血清中细胞因子TNF-α、IL-2、IL-6 和IFN-γ 的分泌，增强血清中ACP、LDH 和脾脏组织中的CAT 活力，降低MDA 含量，促进短链脂肪酸（SCFAs）生成，改变免疫抑制小鼠肠道菌群的组成，增加拟杆菌门（Bacteroidetes）相对丰度，减少厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度，从而发挥免疫调节作用。并且从对细胞因子IL-2、IL-6，ACP、LDH 的影响中发现，冬荪菌托多糖效果优于子实体多糖。冬荪菌托多糖提取率约是子实体的4 倍，表明冬荪菌托是获取多糖很好的来源。综上，冬荪多糖有免疫调节作用，其可能成为一种有效的免疫调节剂，用于增强免疫功能和调节肠道菌群，但免疫调节作用机制有待进一步研究。
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