鸡蛋清中含有种类丰富的蛋白质[1]，其中卵黏蛋白含量可达3.5%[2]，卵黏蛋白含有α-亚基和β-亚基，是一种高度糖基化的糖蛋白[3]，卵黏蛋白的物理形态呈纤维状，在蛋清液及溶液中均具有较高的黏性，是使浓厚蛋白得以维持组织状态的主要因素[4]，具有防止蛋液起泡、抗菌、抑制肿瘤细胞、增殖及降低胆固醇等多种作用[5]，在食品加工行业具有较高的实用价值。卵黏蛋白的分离方法有盐析沉淀法、凝胶电泳法、离子交换色谱法以及等电点沉淀法等[6]，其中等电点沉淀法较为常用[7]，卵黏蛋白的等电点（pI）在4.5～5.1 之间[8]，该性质可用以分离纯化卵黏蛋白，但是卵黏蛋白与卵白蛋白在pI=5 处有交叉[9-10]，仅通过等电点沉淀的方式在分离过程中易有其他杂蛋白的混入，得到的卵黏蛋白纯度较低。卵黏蛋白分子质量高（α1-卵黏蛋白、α2-卵黏蛋白和β-卵黏蛋白的分子量分别为150、220 ku 和400 ku）[11]，适宜在加入盐溶液沉淀后用离心沉淀法分离，故可以通过在分离提纯过程中添加一定量的无机盐溶液来降低卵黏蛋白的溶解度，以使其凝聚析出[12]，达到提高卵黏蛋白提取率的目的。本试验以鸡蛋清为原料，将传统盐析沉淀法与等电点法结合，研究不同NaCl 溶液浓度、蛋清与NaCl 溶液体积比、pH 值及离心时间对卵黏蛋白提取率的影响，以期为卵黏蛋白的生产提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
新鲜鸡蛋：邯郸市复兴标准化养鸡场；氯化钠：鼎盛鑫化工有限公司；氢氧化钠：金汇太亚化学试剂有限公司；盐酸溶液：永华化学股份有限公司；乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）标准溶液（0.2 mol∕L）：镇江市联丰环保化工有限公司；碳酸氢钠：无锡市晶科化工有限公司；透析袋（MD44-14000）：美国杰普乐公司；cw2307 蛋白marker：康为世纪生物科技股份有限公司；BSA 标准品（4 mg∕mL）：北京普利莱基因技术有限公司；考马斯亮蓝G250：迪信泰检测科技（北京）有限公司。本试验所用试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
JJG-1036-2008 电子天平：东阳市英衡智能设备有限公司；ZNCL-BS180 恒温磁力搅拌器：上海越众仪器设备有限公司；PHS-3C 酸度计：杭州齐威仪器有限公司；LC-LR55C 冷冻离心机：湖南力辰仪器科技有限公司；YTLG-18E 真空冷冻干燥机：南京昕仪科技有限公司；NH16-8 酶联免疫分析仪：安徽宁怀仪器有限公司；DYCZ-28B 电泳仪：北京东南仪诚实验室设备有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 卵黏蛋白提取工艺
将新鲜鸡蛋洗净、晾干，打开鸡蛋，用分蛋器使蛋清和蛋黄分开，取蛋清称重，备用。配制不同浓度的氯化钠溶液，按照不同比例分别加入到蛋清中，搅拌均匀。分别取100 mL 混合液于烧杯中，调节混合液pH值。在室温下用磁力搅拌器低速搅拌1.5 h，并置于透析袋内透析24 h，在4 ℃、3 500×g 条件下离心40 min，离心后得到沉淀A，将沉淀重悬于0.5 mol∕L 的盐溶液中，4 ℃条件下静置过夜，在4 ℃、3 500×g 离心条件下离心40 min，得到沉淀，用蒸馏水洗3 次，每次清洗后相同条件离心，将沉淀收集即为沉淀B，冷冻干燥后得到白色干粉即为卵黏蛋白。
1.3.2 蛋白质含量的测定
用BSA 蛋白标准液在595 nm 波长处测得的吸光值绘制标准曲线。标准方程为y=0.010 4x+0.021 8（R2=0.995 9）。将不同条件下分离得到的沉淀B 在595 nm波长下测吸光值，通过标准曲线计算其中蛋白质的含量[13-14]。
1.3.3 蛋白质纯度的测定
采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）凝胶电泳法[15]测定卵黏蛋白纯度。使用ImageJ 软件[16]分析电泳图可得到反映各蛋白质条带密度的灰度曲线图，通过软件计算，转化曲线围成的面积得到对应蛋白质的纯度。
1.3.4 卵黏蛋白提取率的计算
称量所得干粉质量，按下式计算卵黏蛋白的提取率（X，%）。
式中：W1 为干燥后沉淀B 的质量，mg；W2 为蛋清原料质量，mg；A 为沉淀B 中蛋白含量，mg；C 为沉淀B中卵黏蛋白纯度，mg；D 为原料蛋清液中卵黏蛋白的含量，mg。
1.3.5 单因素试验设计
在预试验基础上，分别选取NaCl 溶液浓度、蛋清与NaCl 溶液体积比、pH 值、离心时间为试验因素，以卵黏蛋白提取率为判断指标，研究不同因素对卵黏蛋白提取率的影响。称取10 mL 蛋清至烧杯中，初始试验条件为蛋清与NaCl 溶液体积比1∶4、离心时间40 min、pH5.5。单因素试验设计如表1 所示。
表1 单因素试验水平
Table 1 Factors and levels of single factor experiment
因素水平12345 NaCl 溶液浓度∕（mol∕L）0.5 1.0 1.5 2.0 2.5离心时间∕min 10 20 30 40 50蛋清与NaCl溶液体积比1∶1 1∶2 1∶3 1∶4 1∶5 pH 值4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
1.3.6 响应面法优化鸡蛋清卵黏蛋白提取试验设计
在单因素的基础上，以pH 值、NaCl 溶液浓度、蛋清与NaCl 溶液体积比和离心时间为试验因素，以卵黏蛋白提取率为响应值，进行响应面优化试验。采用Design-Expert 软件，进行Box-Behnken 设计及响应面分析试验。试验因素水平见表2。
表2 Box-Behnken 试验因素及水平
Table 2 Factors and levels of Box-Behnken design
因素水平-1 01 A NaCl 溶液浓度∕（mol∕L）1.0 1.5 2.0 B pH 值5.0 5.5 6.0 C 蛋清与NaCl溶液体积比1∶2 1∶4 1∶6 D 离心时间∕min 30 40 50
1.4 数据处理
所有试验均重复3 次，将所得试验数据通过SPSS20 软件进行统计计算，采用Origin2018 软件绘图，运用Design-Expert 进行方案设计及结果分析。
2 结果与分析
2.1 NaCl 溶液浓度对卵黏蛋白提取率的影响
NaCl 溶液浓度对卵黏蛋白提取率的影响见图1。
图1 NaCl 溶液浓度对卵黏蛋白提取率的影响
Fig.1 Effect of NaCl concentration on the extraction rate of ovalbumin
由图1 可知，添加NaCl 溶液浓度的增加，卵黏蛋白的提取率也逐渐增大，当加入NaCl 溶液的浓度超过1.5 mol∕L，卵黏蛋白的提取率逐渐趋于平缓，NaCl 溶液浓度继续增加，提取率不再明显增加，卵白蛋白和溶菌酶是目标蛋白质以外的最主要杂蛋白[17]，高浓度的NaCl 会导致目标蛋白以外的杂蛋白沉淀，这是因为随着NaCl 溶液浓度的提高，离子间的静电相互作用减弱，卵白蛋白易与卵黏蛋白共同沉淀[18]，从而导致最终产物中含有较多杂蛋白，因而综合考虑，1.5 mol∕L 为提取卵黏蛋白的最佳NaCl 浓度。
2.2 pH 值对卵黏蛋白提取率的影响
pH 值对卵黏蛋白提取率的影响如图2 所示。
图2 pH 值对卵黏蛋白提取率的影响
Fig.2 Effect of pH on the extraction rate of ovalbumin
由图2 可知，随着pH 值的增加，卵黏蛋白的提取率逐渐增大，当pH 值达到5.5 时，卵黏蛋白的提取率最高，之后再增加溶液的pH 值，卵黏蛋白的提取率呈下降的趋势。在卵黏蛋白分离过程中，pH 值比较高时，卵黏蛋白胶体之间的静电斥力降低，溶剂与蛋白质的相互作用降低，蛋白质表面的疏水基团出现，蛋白质分子周围水分子减少，卵黏蛋白沉淀析出[19]。卵黏蛋白的等电点在4.5～5.0 之间，pH 值大于5 的环境可以使得卵黏蛋白充分沉淀，而蛋清中的溶菌酶以及卵转铁蛋白的等电点均在6.5 以上[20]，在pH 值为6.5 以下的环境中难以沉淀。过高的pH 值在提升蛋白质沉淀效果的同时会导致最终产物中杂质的增加。因此综合考虑，pH5.5 为提取卵黏蛋白的最佳参数。
2.3 蛋清与NaCl 溶液体积比对卵黏蛋白提取率的影响
蛋清与NaCl 溶液体积比对卵黏蛋白提取率的影响如图3 所示。
图3 蛋清与NaCl 溶液体积比对卵黏蛋白提取率的影响
Fig.3 Effect of egg white-NaCl ratio on the extraction rate of ovalbumin
由图3 可知，随着NaCl 溶液体积占比的增加，卵黏蛋白的提取率逐渐增大，当蛋清与NaCl 溶液体积比达到1∶4 时，卵黏蛋白的提取率达到最大，之后继续增加NaCl 溶液体积占比，卵黏蛋白的提取率有下降的趋势。在卵黏蛋白沉淀分离过程中，过低的NaCl 溶液体积占比易使反应体系达到饱和状态，这是由溶剂减少、反应物的浓度过高导致[21]，此时不利于卵黏蛋白的有效分离，因为蛋清液具有较明显的凝胶性，随着蛋清液中水分含量的增多（即蛋清与NaCl 溶液体积比的增大）及空气的进入，整个体系的起泡性也会随之增强[22]，从而影响到反应的进行并使反应时间延长。因此，刚开始时卵黏蛋白的提取率随着NaCl 溶液体积占比的增加而增加但趋势较缓。NaCl 溶液体积占比太大会在增加成本的同时导致其余杂蛋白的析出。因此综合考虑，蛋清与NaCl 溶液体积比1∶4 为提取卵黏蛋白的最佳参数。
2.4 离心时间对卵黏蛋白提取率的影响
离心时间对卵黏蛋白提取率的影响如图4 所示。
图4 离心时间对卵黏蛋白提取率的影响
Fig.4 Effect of centrifugation time on the extraction rate of ovalbumin
由图4 可知，随着离心时间的延长，卵黏蛋白的提取率逐渐增大，当离心时间达到40 min 时，卵黏蛋白的提取率达到较高值，之后再延长离心时间，卵黏蛋白的提取率增加趋势逐渐平缓。根据试验结果可知，离心时间延长，卵黏蛋白的分离效果会随之变好，但是综合考虑到成本问题，离心时间控制在40 min 为最佳。
2.5 响应面分析
2.5.1 模型的建立及显著性检验
Box-Behnken 试验设计方案及结果见表3。
表3 Box-Behnken 试验设计及结果
Table 3 Box-Behnken design and results
试验号A 1234567891 0-1-1 B0-1000000-1001-1-1 D001011-10-11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 1000011-1 C10000001100-1-1 0-1 1001-1-1-1 10-100000-10100010000-1000-1-1 101001-11100 00101 10000-1 0010010000-1-1 000提取率∕%43.85 45.73 45.24 54.32 45.56 46.54 44.40 46.96 46.91 46.15 54.49 47.11 44.52 48.25 43.22 46.48 45.85 47.51 44.73 44.53 54.51 54.61 43.84 46.13 46.41 45.54 46.22 54.44 45.63
利用Design-Expert 软件对表3 试验数据进行二次多元回归拟合，得到鸡蛋清中卵黏蛋白提取率（Y）与NaCl 溶液浓度（A）、pH 值（B）、蛋清与NaCl 溶液体积比（C）、离心时间（D）4 个因素的二次多项式回归模型为Y=54.48-0.34A+0.662B-0.13C-0.1D+0.27AB+1.73AC+0.065AD+0.9BC-1.21BD-1.24CD-4.59A2-4.19B2-4.62C2-4.1D2。方差分析见表4。
表4 响应面试验方差分析
Table 4 Analysis of variance for response surface methodology
注：**表示影响极显著，P<0.01。
变异来源自由度ABCDA B显著性****AC AD BC BD CD**A2B2 C2D2模型残差失拟项纯误差总和平方和1.38 4.56 0.2 0.12 0.29 11.97 0.017 3.28 5.83 6.18 136.78 113.92 138.57 109.08 352.57 0.48 0.43 0.045 353.05 111111111111111 4 F 值40.44 133.67 5.86 3.52 8.38 350.67 0.5 95.96 170.84 180.89 4 006.48 3 336.9 4 059 3 195.11 737.68 P 值<0.000 1<0.000 1 0.029 6 0.081 8 0.011 7<0.000 1 0.493 2<0.000 1<0.000 1<0.000 1<0.000 1<0.000 1<0.000 1<0.000 1<0.000 1****************14 10 4 28均方1.38 4.56 0.2 0.12 0.29 11.97 0.017 3.28 5.83 6.18 136.78 113.92 138.57 109.08 25.18 0.034 0.043 0.011 3.86 0.102 6
由表4 可以看出，模型P<0.01，表明回归模型达到极显著水平，失拟项P=0.102 6>0.05，表明模型失拟项不显著。模型的R2=0.998 6，表明该模型与实际拟合较好，可以用此模型来分析和预测盐析沉淀法提取蛋清中卵黏蛋白的工艺参数。方差分析结果显示，A、B、AC、BC、BD、CD、A2、B2、C2、D2 达到极显著水平，由F 值可知，各因素对卵黏蛋白提取率的影响次序为pH 值>NaCl 溶液浓度>蛋清与NaCl 溶液体积比>离心时间。
2.5.2 各因素的交互作用对卵黏蛋白提取率的影响
各因素交互作用的响应曲面及等高线图见图5。
图5 两因素交互作用的响应曲面及等高线
Fig.5 Response surface and contour plots of interaction between factors
f.蛋清与NaCl 溶液体积比和离心时间的交互作用响应面与等高线
通过Design Expert 软件分析得到，盐析沉淀法提取鸡蛋清中卵黏蛋白的最佳工艺条件为NaCl 溶液浓度1.48 mol∕L、蛋清与NaCl 溶液体积比1∶3.98、pH5.54、离心时间39.78 min，该最佳工艺条件下，卵黏蛋白提取率的预测值为54.51%。
2.5.3 验证试验
考虑到实际生产及可操作性，将最优工艺参数调整为NaCl 溶液浓度1.5 mol∕L、蛋清与NaCl 溶液体积比1∶4、pH5.5、离心时间40 min。为了验证预测结果，按优化后工艺参数进行3 次重复验证试验，计算提取率平均值，结果表明在此条件下，卵黏蛋白的提取率为54.48%，与预测值54.51% 基本相符，拟合度较好，相对误差为0.06%（<5%），表明响应面法得到的卵黏蛋白工艺参数较为准确，具有较高的可靠性。
2.5.4 卵黏蛋白纯度测定结果分析
对分离后的沉淀B 进行SDS-PAGE，结果如图6 所示。
图6 沉淀B SDS-PAGE 图谱
Fig.6 SDS-PAGE of the precipitate B
M.蛋白marker；1.第1 次验证试验样品；2.第2 次验证试验样品；3.第3 次验证试验样品。
由图6 可知，泳道1、2、3 中均含有4 条可见条带，其中3 条较为明显，对比蛋白分子量marker 可知，3 条明显条带所对应的蛋白质与目前已知的卵黏蛋白分子量大小一致（β-卵黏蛋白为400 ku，α2-卵黏蛋白为220 ku，α1-卵黏蛋白为150 ku），因此可以判断较为明显的3 条条带分别为α1-卵黏蛋白、α2-卵黏蛋白与β-卵黏蛋白，而较为不明显的条带分子量在45 ku 左右，判断为卵白蛋白[23]，这是因为pH5.5 的环境下导致了少量卵白蛋白的沉淀。
使用ImageJ 软件分析，通过蛋白质条带所在位置的曲线围成的面积得出其密度值，根据密度值来计算，3 次验证试验所得到的卵黏蛋白的平均纯度为94.26%。因此，采用盐析和等电点法相结合的方法能从蛋清中提取高纯度的卵黏蛋白。
3 结论
本试验采用Box-Behnken 设计，建立盐析法与等电点沉淀法结合提取鸡蛋清中卵黏蛋白工艺参数的二次多项式数学模型，经检验该模型具备合理性，能够较好地预测卵黏蛋白的提取率。在利用该方法提取鸡蛋清中卵黏蛋白的过程中，各因素对卵黏蛋白提取率影响主次顺序依次为pH 值>NaCl 溶液浓度>蛋清与NaCl 溶液体积比>离心时间。在pH5.5、NaCl 溶液浓度1.5 mol∕L、蛋清与NaCl 溶液体积比1∶4、离心时间40 min 的条件下，卵黏蛋白的提取率为54.48%，纯度为94.26%。试验证明，本方法操作条件温和、简便易实施、成本低，适用于卵黏蛋白的分离提取。
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