中国白酒拥有悠久的历史和独特的酿造方法，主要包括清香型、酱香型、浓香型及其他香型，是中国食品工业的重要组成部分[1-2]。传统白酒酿造体系是一个多微共存的发酵过程，微生物是白酒酿造的核心，不同微生物发酵代谢所产生的风味可赋予酒体不同的风格，进而决定了基酒的产量和品质。而在白酒酿造的过程中，酿造微生物将会面临诸如高温、发酵后期高浓度的酒精含量、酒醅高酸微环境等恶劣的生长条件的挑战，导致原料利用下降、发酵力不足、生产掉排以及基酒风味失衡等生产问题。因此，选育具有高耐受性的关键功能微生物以及开发与之配套的微生态调控技术有助于企业提高生产稳定性，提升基酒品质。
酵母是白酒酿造过程中的关键微生物之一，其可分为酿酒酵母和非酿酒酵母，在白酒生产中起到产酒、生香的关键作用。酵母的抗逆性和代谢性能直接影响酿造体系的稳定和演替变化，更对酒体风味和质量具有重要意义[3-4]。因此，筛选发酵性能优良且抗逆性强的酵母菌株对稳定白酒生产具有重大意义。目前利用测序技术从酱香型白酒酒醅中已分离鉴定出9 种酵母，分别为拜耳接合酵母、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、膜醭毕赤酵母、胶红酵母、哈萨克斯坦酵母、东方伊萨酵母、汉逊德巴利酵母和白地霉，均具有耐高温和耐酸的特征，其中酿酒酵母、毕赤酵母、粟酒裂殖酵母、拜耳接合酵母这4 种酵母是白酒发酵过程中的核心酵母[5]，并且拜耳接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）过去被认为是一种腐败酵母[6]，广泛存在于各种发酵食品中，如葡萄酒、茶和醋等[7]。Z.bailii 作为酱香型白酒中核心功能酵母，在堆积和窖池阶段均是优势菌群，所占酵母生物量比例可达70% 以上，是重要的乙醇生产者，并在乙酯类物质上有高水平生产，如乙酸乙酯[8]。尽管拜耳接合酵母在酱香型白酒酿造中发挥着重要作用，但是将拜耳接合酵母强化应用于白酒生产发酵过程的研究鲜见报道。因此，筛选具有良好耐受性能，且发酵性能优异的拜耳接合酵母，并开发基于强化菌剂的发酵调控技术对实现传统白酒酿造可控、高效、稳定生产具有重要的应用价值。
本研究通过温度、酸度双重胁迫条件从酱香型白酒中筛选出9 株拜耳接合酵母，对其耐高温、耐酸、耐乙醇性能进行检测，并利用模拟发酵试验对其发酵性能及风味物质的生成进行系统评估，最终确定以BM09菌株应用于酱香型白酒第7 轮次生产试验中，评价其应用于酱香型白酒酿造过程中的作用，以期为传统白酒发酵人工调控技术的开发提供新依据和新思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
高粱：酱香型白酒专用高粱，取自茅台镇某酒厂。
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培养基：20 g∕L 葡萄糖，20 g∕L 蛋白胨，10 g∕L 酵母浸粉，自然pH，121 ℃下灭菌20 min。
酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂（yeast peptone dextrose agar，YPD）培养基：在YEPD 培养基中加琼脂2%，自然pH，121 ℃下灭菌20 min。
WL 营养琼脂（wallerstein laboratory nutrient agar，WL）培养基、麦芽汁培养基：广东环凯微生物科技有限公司；葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、阿拉伯糖、木糖、半乳糖（均为分析纯）、磷酸缓冲盐溶液、尿素、硝酸铵、硝酸钾（均为生化试剂）：上海源叶生物科技有限公司；蛋白胨、酵母浸粉、琼脂粉（均为生化试剂）：天津市北方天医化学试剂公司；乳酸、乙酸、乳酸乙酯、乙酸乙酯、正丙醇、异戊醇、异丁醇、乙醛、糠醛、丙酸（均为色谱纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；无水乙醇、柠檬酸、戊二醛、叔丁醇（均为分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；耐高温α-淀粉酶（35 000～40 000 U∕mL）、糖化酶（140 000～150 000 U∕mL）：山东谦诺生物科技有限公司；酸性蛋白酶（50 000～10 000 U∕mL）：夏盛（北京）生物科技开发有限公司。
高粱水解液：取高粱1 kg，过20 目筛，按照高粱粉与水料液比为1∶3（g∕mL）加入3 L 60～70 ℃的自来水，在60 ℃下糊化30 min，然后于恒温水浴锅中，加热至90 ℃后添加1 mL 的耐高温α-淀粉酶进行液化20 min，液化结束后，在121 ℃下加热煮沸20 min，之后补水至原体积，立即冷却降温到60 ℃，加入2 mL 糖化酶糖化作用4 h。待糖化结束后迅速降温至40 ℃，添加1 mL 的酸性蛋白酶在40 ℃下水浴作用2 h。冷却至室温并使用4 层纱布过滤获得清液，将糖度调整至8、12、16°Bx，备用。
种子培养基：在糖度为8°Bx 和12°Bx 的水解液中各加入0.5%的酵母浸粉，作为一级种子培养基和二级种子培养基，121 ℃下高温灭菌20 min 备用。
液态发酵培养基：以糖度为16°Bx 的水解液作为液态发酵培养基，121 ℃下高温灭菌20 min 备用。
1.2 仪器与设备
MS204S 分析天平：上海诚铭科技有限公司；UV-5100B 紫外分光光度计：上海元析仪器有限公司；Agilent 7890B 气相色谱仪、1200SL 液相色谱仪：美国Agilent 公司；SJ511C 立式压力蒸汽灭菌器、IN613C 恒温培养箱：雅马拓科技贸易（上海）有限公司；Stab M1T 可叠加式全温振荡培养箱：上海润度生物科技有限公司；SIEMAN M-100 生物传感仪：深圳西尔曼科技有限公司；PCT-200 型聚合酶链式反应基因扩增仪：德国Eppendorf 公司；Syngene GeneGenius 全自动凝胶成像系统：美国SYNGENE 公司；S-9288 显微镜：深圳纽荷尔科技有限公司；SU1510 扫描电子显微镜：国仪量子技术（合肥）股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 高耐受性酵母的筛选
取酱香型白酒酒醅10 g 和90 mL 无菌生理盐水置于250 mL 无菌三角瓶中充分混合，在30 ℃、180 r∕min 条件下振荡1 h，吸取1 mL 菌悬液至麦芽汁培养基中，30 ℃静止培养48 h，稀释涂布于含8%无水乙醇且pH 值为2.0 的YPD 平板上，30 ℃倒置培养4～5 d，挑取长势良好的单菌落进行纯化，并保存于4 ℃备用。
1.3.2 高耐受性酵母菌株的鉴定
1.3.2.1 形态学观察及生理生化试验
菌落形态观察：将纯化后的菌株以划线的方式在WL 培养基上培养，30 ℃培养2～3 d 后观察，记录菌落形态特征；显微镜观察：利用美兰染色法在显微镜下观察细胞形态；扫描电子显微镜观察：菌株摇床培养至稳定期，取5 mL 菌液加入50 mL 离心管，7 000 r∕min 离心2 min，倒掉上清液；加入20 mL 5% 固定液戊二醛溶液，涡旋振荡后静置，固定2 h；加入20 mL 磷酸缓冲盐溶液，7 000 r∕min 离心5 min，重复洗涤3 次；分别再用50%、70%、95% 乙醇溶液依次洗涤1 次，无水乙醇洗涤两次，7 000 r∕min 离心20 min 后加入叔丁醇洗涤3 次，4 000 r∕min 离心15 min。所得样品冷冻干燥后形态观察采用扫描电子显微镜。
生理生化试验：参考《酵母菌的特征与鉴定手册》进行生理生化试验[9]，包括糖发酵试验、碳源同化试验、氮源同化试验。
1.3.2.2 菌株分子生物学鉴定
参考赵雪平等[10]的方法进行菌种鉴定，测序引物序列如表1 所示。
表1 测序引物序列
Table 1 Sequence of the primers
名称NL1 NL4序列5′→3′GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG GGTCCGTGTTTCAAGACGG扩增序列PCR 长度∕bp 26S rDNA 600
1.3.3 菌株耐受性能评估
1.3.3.1 耐温性能评估
采用点板试验法检测菌株的温度耐受性，将测试菌株挑取至3 mL YEPD 培养基中，30 ℃培养12～16 h，将菌液OD600 调整至0.5，吸取2µL 菌液分别滴加至YPD 平板上，将其置于不同温度（30、35、37、40 ℃）培养箱中倒置培养1～2 d，每隔12 h 观察菌株生长情况。
1.3.3.2 耐酸性能评估
与耐温性能评估方法类似，在含有不同乳酸（90、100、110 g∕L）和乙酸（14、15、16 g∕L）的YPD 平板上进行点板试验，观察菌株生长情况。
1.3.3.3 耐乙醇性能评估
与耐温性能评估方法类似，在含有不同乙醇浓度（12%、13%、14%）的YPD 培养基上进行点板试验，观察菌株生长情况。
1.3.4 菌株发酵性能检测
一级种子培养：从YPD 培养基中挑取这9 株单菌落和对照菌酿酒酵母AY12 接种至一级种子培养基，装液量6 mL∕15 mL，30 ℃静置培养24 h。
二级种子培养：将一级种子按照10%的比例接种至二级种子培养基，装液量60 mL∕150 mL，30 ℃静置培养24 h。
发酵接种：将二级种子液以10%比例接种至液态发酵培养基中，装液量150 mL∕250 mL，30 ℃静置培养，以CO2 排放量来代表发酵的进程及发酵能力，每隔12 h 称重1 次，当两次失重小于或等于0.1 g 时，发酵结束。
1.3.5 原位发酵试验
从平板挑取单菌落接种于200 mL YEPD 培养基中，在30 ℃、200 r∕min 条件下培养48 h，用无菌生理盐水进行洗菌后重悬，将酵母菌剂以106 CFU∕g 的接种量加入20 kg 六轮次摊凉拌曲后的酒醅中，对照组为等体积的无菌生理盐水，混合后将其平均装入2 个纯棉纱布袋中，放置在不同位置进行堆积发酵，具体位置如图1a 所示，待堆积发酵结束后，取样进行理化检测，然后将样品进行翻拌，模拟移堆操作，然后再分装至纱布袋中，在窖池原位环境中继续发酵，具体位置如图1b 所示。发酵结束后，取酒醅进行理化指标检测。
图1 原位堆积发酵和窖池发酵样品位置示意图
Fig.1 Location diagram of samples during in-situ stacking fermentation and pit fermentation
a.堆积阶段；b.窖池阶段。
1.3.6 乙醇及风味物质检测
发酵代谢物检测：发酵结束后，取100 mL 发酵液与100 mL 蒸馏水混合均匀，蒸馏并收集100 mL 馏出液，并用0.22µm 滤膜过滤，分别利用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法和气相色谱（gas chromatography，GC）法检测乙醇含量和风味物质含量。
原位发酵酒醅代谢物检测：取50 g 酒醅与200 mL 5% 乙醇混合均匀，蒸馏并收集100 mL 馏出液，并用0.22µm 滤膜过滤，分别利用液相法和气相法测定乙醇含量和风味物质含量。
液相检测条件：检测器为示差折光检测器（refractive index detector，RID）；色谱柱为GH0830078H（300 mm×7.8 mm）；流动相为5 mmol∕L 的稀硫酸，流速为0.6 mL∕min；检测器温度为45 ℃，柱温为65 ℃，进样量为20µL。
气相检测条件：火焰离子化检测器（flame ionization detector，FID），毛细管色谱柱HP-INNOWAX（50 m×320µm×1.0µm）；载气为纯度为99.99% 的高纯氮气；分流比为1∶10；进样口温度200 ℃；进样量1µL；检测器温度200 ℃。升温程序为：50 ℃保持8 min，升温速率为5 ℃∕min，升温至180 ℃，保持15 min，每个样品处理时间43 min。
1.3.7 残淀粉的测定
样品中的残余淀粉含量利用酸水解法滴定检测，具体方法参考T∕CBJ 004—2018《固态发酵酒醅通用分析方法》。
1.4 数据处理
所有试验数据均重复3 次，数据以平均值±标准差表示；利用GraphPad Prism 9 和Excel 进行图标绘制，利用SPSS26.0 进行数据分析。
2 结果与分析
2.1 高耐性菌株的分离纯化
经过8%无水乙醇和pH2.0 的双压力胁迫条件下从酒醅中分离纯化出9 株菌株，命名为BM01～BM09，并利用真菌26S rDNA 序列同源相似性分析进行菌种鉴定，琼脂糖凝胶电泳图见图2，菌株测序比对结果见表2。
图2 菌株26S rDNA 序列扩增的琼脂糖凝胶电泳图
Fig.2 Agarose gel electrophoresis of strain 26S rDNA sequence amplification
M.DL2000 DNA marker。
表2 菌株测序结果
Table 2 Sequencing results of strains
编号BM01 BM02 BM03 BM04 BM05 BM06 BM07 BM08 BM09相似菌株（序列ID）Zygosaccharomyces bailii（KM055467.1）Zygosaccharomyces bailii（KM055467.1）Zygosaccharomyces bailii（KM055467.1）Zygosaccharomyces bailii（KM055467.1）Zygosaccharomyces bailii（KM055467.1）Zygosaccharomyces bailii（KM055467.1）Zygosaccharomyces bailii（KM055467.1）Zygosaccharomyces bailii（KM055467.1）Zygosaccharomyces bailii（KM055467.1）相似度∕%100.00 99.83 100.00 99.83 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00
由图2 可知，9 株菌的序列长度为600 bp 左右。由表2 可知，对这9 株菌进行测序比对表明，与Z.bailii（KM055467.1）同源相似度在99.83%～100.00% 之间，由此可以确定这9 株菌均为拜耳接合酵母。
生理生化试验结果如表3 所示。
表3 菌株的生理生化试验结果
Table 3 Physiological and biochemical tests of strains
注：+表示阳性，-表示阴性。
发酵糖类葡萄糖蔗糖麦芽糖淀粉生长情况生长情况生长情况+---碳源同化阿拉伯糖木糖半乳糖乙醇乙酸乳酸柠檬酸--++-+-氮源同化尿素硝酸钾硫酸铵+-+
由表3 可知，9 株菌在生理生化试验中结果表现一致，发酵糖类试验中检测了葡萄糖、蔗糖、麦芽糖及淀粉，其中发酵糖只有葡萄糖，而蔗糖、麦芽糖和淀粉均无法发酵；碳源同化试验检测了阿拉伯糖、木糖、半乳糖、乙醇、乙酸、乳酸及柠檬酸，其中能够被菌株利用的是半乳糖、乙醇和乳酸，阿拉伯糖、木糖、乙酸及柠檬酸不能被利用；氮源同化试验检测了尿素、硝酸钾及硫酸铵，其中能够被菌株利用的是尿素和硫酸铵，硝酸钾不能被利用。
菌株BM09 的菌落及细胞形态见图3。
图3 菌株BM09 的菌落及细胞形态
Fig.3 Colony and cell morphology of strain BM09
（a）在WL 培养基上菌落形态特征；（b）显微镜下细胞形态特征（40×油镜）；（c）扫描电子显微镜下细胞形态特征。
由图3 可知，BM09 的菌落呈圆形，凸起，颜色为乳白色，边缘整齐，不透明，质地均匀易挑起；显微镜和电子显微镜下观察，大多为球形或椭圆形的单细胞，生殖方式为出芽繁殖，是典型的酵母特征。
2.2 菌株的耐受性评价
2.2.1 温度耐受性
白酒酿造过程中温度是影响微生物的生长繁殖关键因素之一[11]。在不同轮次堆积酒醅温度变化的研究中发现，30～35 ℃为各轮次不同位点酒醅的普遍温度范围[12]。BM01～BM09 在35 ℃下生长情况见图4（a），BM09 在37 ℃下生长情况见图4（b）。
图4 菌株在不同温度条件下的生长情况
Fig.4 Growth of strains under different temperature conditions
（a）35 ℃；（b）37 ℃。100 为原菌液，10-1、10-2、10-3、10-4 分别为稀释10 倍、100 倍、1 000 倍、10 000 倍的菌液。
由4（a）可知，BM01～BM09 均能够在35 ℃下生长良好。由图4（b）可知，BM09 更是能够在37 ℃下生长。这些菌株对温度的良好耐性是其能够在酱香型白酒酒醅中成为优势菌株的原因。
2.2.2 乙酸、乳酸耐受性
在酱香型白酒酿造过程中，随着轮次的增加，酒醅酸度逐渐升高，核心功能酵母被抑制，导致白酒的产量和品质下降，所以对酵母的耐酸性的评估是必要的[13]。乙酸和乳酸是发酵体系中酸度的主要贡献物质[14]，因此考察了筛选获得菌株在不同乳酸、乙酸浓度下的生长状况，BM01～BM09 在不同胁迫条件下生长情况见图5。
图5 菌株在不同胁迫条件下生长情况
Fig.5 Growth of strains under different stresses
（a）16 g∕L 乙酸；（b）110 g∕L 乳酸。100 为原菌液，10-1、10-2、10-3、10-4分别为稀释10 倍、100 倍、1 000 倍、10 000 倍的菌液。
由图5（a）可知，BM01～BM09 能够耐受的乙酸含量为16 g∕L（pH1.62），其中BM09 菌液在稀释10 000 倍的情况下依旧能够生长，是这9 株菌中对乙酸的耐受性最强。由图5（b）可知，在乳酸的胁迫压力下，BM01～BM09 均可以在乳酸含量110 g∕L（pH1.55）下生长，其中BM09 的乳酸耐受性显著强于其他菌株。
2.2.3 乙醇耐受性
发酵过程中酵母是主要的乙醇生产者，发酵体系中乙醇浓度升高，细胞受到乙醇毒害作用，从而抑制酵母生长，使得发酵力不足，产量下降[15]。因此，高乙醇耐受性是白酒功能酵母所必备的性能。BM01～BM09在14%乙醇溶液胁迫条件下生长情况见图6。
图6 菌株在14%乙醇溶液胁迫条件下生长情况
Fig.6 Growth of strains under 14% ethanol stress condition
100 为原菌液，10-1、10-2、10-3、10-4 分别为稀释10 倍、100 倍、1 000倍、10 000 倍的菌液。
由图6 可知，BM01～BM09 均能够耐受14% 浓度的乙醇溶液，其中BM02、BM03 及BM09 菌株耐受能力略强于其它菌株。
2.3 菌株发酵性能和代谢特征评价
除了耐受性，酵母菌株的代谢特性也是影响基酒质量的重要因素。通过利用高粱水解液模拟白酒发酵，对这9 株菌的发酵性能和风味物质的合成情况进行了系统分析，并因工业酿酒酵母AY12 具备优良的发酵及产酒性能[16]，所以以实验室保藏的酿酒酵母AY12 作为对照菌株，这9 株菌在高粱水解液发酵条件下代谢特性分析见图7。
图7 菌株在高粱水解液发酵条件下代谢特性分析
Fig.7 Metabolic characteristics of strains under fermentation of sorghum hydrolysate
（a）不同菌株发酵失重变化曲线；（b）不同菌株在高粱水解液条件下乙醇产量；（c）不同菌株发酵失重与乙醇产量的关联分析。显著性分析均以AY12 为对照进行分析：ns 表示无显著性差异，*表示在P<0.05 水平下有显著性差异；**表示在P<0.01 水平下有显著性差异；***表示在P<0.001 水平下有显著性差异。
由图7（a）可知，酿酒酵母AY12 发酵24 h 后开始进入稳定期，而菌株BM01～BM09 的发酵速度均显著低于酿酒酵母AY12，其中BM09 发酵速度最快，在72 h 后进入稳定期；BM01、BM02、BM03、BM04、BM05、BM06 及BM07 在96～108 h 期间分别进入稳定期，而BM08 发酵速度最慢，在144 h 后进入稳定期。由图7（b）的乙醇产量可知，除了菌株BM09[（66.93±0.51）g∕L]，其它菌株的乙醇产量也显著低于酿酒酵母AY12[（68.27±0.62）g∕L]，且由图7（c）可知，发酵失重与乙醇产量之间的相关分析R2 为0.913 0，相关性良好。
同时，利用GC 检测这些菌株发酵所产生的主要风味物质，结果见表4。
表4 不同菌株在高粱水解液发酵条件下风味化合物的产量
Table 4 Yield of flavor compounds of different strains under fermentation of sorghum hydrolysate
注：显著性分析均是以AY12 为对照进行分析：ns 表示无显著性差异，*表示在P<0.05 水平下有显著性差异，**表示在P<0.01 水平下有显著性差异，***表示在P<0.001 水平下有显著性差异，****表示在P<0.000 1 水平下有显著性差异。
菌株AY12 BM01 BM02 BM03 BM04 BM05 BM06 BM07 BM08 BM09风味酯∕（mg∕L）高级醇∕（mg∕L）乳酸乙酯1.21±0.03 1.26±0.01ns 1.31±0.14ns 1.25±0.07ns 1.22±0.08ns 1.29±0.05ns 1.43±0.17ns 1.42±0.22ns 1.41±0.33ns 1.53±0.06*乙酸乙酯5.63±0.65 25.50±1.16****33.01±3.57****28.89±0.27****33.38±1.85****23.88±4.96****29.72±2.75****29.42±2.91****25.84±4.07****36.29±1.19****正丙醇43.56±2.47 57.32±1.82**75.18±4.29***67.34±1.59***66.19±2.18***66.85±1.73***64.68±1.90***63.43±1.37***60.69±2.74**44.61±0.87ns异戊醇172.01±13.51 127.04±4.80**152.89±15.37ns 136.65±4.22*222.92±6.83**132.96±4.16**218.96±1.23**211.00±1.35**210.81±2.52**168.22±6.33ns异丁醇45.75±3.33 55.21±2.31*65.50±5.87**57.34±2.72**126.03±4.26****59.05±2.63**123.82±0.66****119.35±0.57****120.52±4.17****45.78±3.26ns苯乙醇22.26±7.41 19.37±1.24ns 19.76±0.66ns 17.93±0.93ns 13.77±4.16ns 16.97±0.15ns 18.01±1.25ns 18.58±1.34ns 17.81±0.94ns 20.56±0.63ns
拜耳接合酵母作为产香酵母对酱香型白酒中乙酯类物质产生起到积极作用[17]。由表4 可知，BM01～BM09 的乙酸乙酯产量显著高于酿酒酵母AY12，是AY12 乙酸乙酯产量的4.24 倍～6.45 倍，其中BM09 的乙酸乙酯产量最高，为（36.29±1.19）mg∕L。另外，仅有BM09 的乳酸乙酯产量显著高于酿酒酵母AY12。此外，高级醇是白酒的风味物质，其含量过高会使得酒味辛辣苦涩，不利于酒体品质[18]，因此筛选的菌株应该对高级醇产量不宜过高。分析发现BM01～BM09 的高级醇产量和酿酒酵母AY12 存在差异，其中BM02、BM04、BM06、BM07 及BM08 的高级醇产量是酿酒酵母AY12 的1.10 倍～1.51 倍，而BM01、BM03、BM05 及BM09 的高级醇产量是酿酒酵母AY12的91.31%～98.48%，含量相当。
根据对菌株耐受性、发酵能力和风味化合物合成能力分析，BM09 菌株在温度、乙酸、乳酸及乙醇耐受性方面表现优良，另外在乙醇产量及产酯能力也是表现突出，因此，选取BM09 作为强化菌剂应用于酱香型白酒原位生产发酵试验。
2.4 强化菌剂原位发酵试验
根据上述的菌株耐受性能分析和模拟白酒发酵的结果，选择菌株BM09 作为强化菌株进行酱香型白酒原位生产发酵验证，以等体积无菌生理盐水作为对照。将菌株BM09 培养液以接种量为106 CFU∕g 添加于第7 轮次发酵生产过程中。堆积发酵阶段和窖池发酵阶段的酒醅理化指标结果见表5，发酵后的酒样风味物质结果见表6。
表5 酒醅中淀粉和乙醇含量
Table 5 Contents of starch and ethanol in fermented grains
注：ns 表示无显著性差异，*表示在P<0.05 水平下有显著性差异，**表示在P<0.01 水平下有显著性差异。
不同发酵阶段堆积发酵末期窖池发酵末期对照组淀粉∕%10.85±0.34 4.81±0.10强化组淀粉∕%11.87±0.14ns 4.00±0.12*乙醇∕（g∕L）0.61±0.02ns 1.37±0.01**乙醇∕（g∕L）0.65±0.03 0.84±0.03
表6 酒样中风味物质含量
Table 6 Contents of flavor compounds in different samples
注：ns 表示无显著性差异，***表示在P<0.001 水平下有显著性差异。
菌剂强化组酒样∕（mg∕L）4.53±0.98***23.51±3.06ns 24.35±2.20***154.49±16.31ns 6.87±0.76ns 7.78±0.49ns 20.70±1.17ns 14.68±0.86ns 111.69±6.30ns 42.74±3.47ns 38.16±0.73ns 4.17±1.00ns风味物质乙醛糠醛乙酸乙酯乳酸乙酯正丙醇异丁醇异戊醇苯乙醇乙酸乳酸丙酸丁酸对照组酒样∕（mg∕L）15.29±1.84 19.25±4.99 13.15±0.53 161.84±16.21 6.82±1.58 6.80±1.58 19.25±0.28 13.81±0.86 123.37±10.08 40.70±3.57 37.99±0.56 3.48±1.17
由表5 可知，添加BM09 可以显著提高原料利用率，主要在窖池发酵阶段发挥作用。窖池阶段对照组淀粉从（10.85±0.34）%降低到（4.81±0.10）%，强化组淀粉从（11.87±0.14）%降低到（4.00±0.12）%，淀粉利用率提高了29.80%。出窖后强化组酒醅中的乙醇含量显著提高了63.10%，从对照组的（0.84±0.03）g∕L 提升到（1.37±0.01）g∕L。这些结果证实了高耐性拜耳接合酵母的使用可以显著提升对原料利用率，解决发酵力不足、产能下降的实际生产问题。目前拜耳接合酵母作为强化菌剂应用于白酒生产调节发酵的研究极少，但利用其他非酿酒酵母来强化应用的报道已有不少。如卢君等[19]利用耐酸粟酒裂殖酵母作为强化菌剂应用于白酒生产试验，基酒产量显著提升了13.47%～25.97%。林良才等[20]筛选的一株高耐性库德里阿兹威氏毕赤酵母在酱香型白酒生产中强化应用，原料利用率提高20%，乙醇产量提升13%。由此可以推断，高耐性非酿酒酵母在白酒生产的应用技术开发，是解决发酵力不足，出酒率低下等实际生产问题的有效手段。
由表6 可知，菌剂强化组酒样中的乙酸乙酯与乙醛含量分别为（24.35±2.20）、（4.53±0.98）mg∕L，对照组酒样中的乙酸乙酯与乙醛含量分别为（13.15±0.53）、（15.29±1.84）mg∕L，乙酸乙酯显著提高了85.17%，乙醛显著降低了70.37%，这意味拜耳接合酵母应用于酱香型白酒后面轮次酿造中，可以有效增加基酒中酯类物质、降低乙醛含量，有利于改善第6 轮次、第7 轮次的基酒杂醇含量高、酯含量低的问题。
3 结论
酱香型白酒独特的酿造工艺造成了一个高温、高酸、高乙醇的酿造环境，这样的环境对功能微生物的耐受能力要求高，酵母的耐受能力越强，在酱香型白酒酿造过程中发挥功能作用更有优势。本研究以调节微生物来改善白酒生产问题为目标，从酱香型白酒酒醅中筛选获得了9 株拜耳接合酵母，通过对耐受能力和代谢性能的评估对比，选出了一株高耐性、高产乙醇及高产酯的拜耳接合酵母BM09 作为强化菌剂，进行原位发酵试验。结果表明BM09 的强化应用提高了酱香型白酒第7 轮次酿造中原料的利用率，使乙醇产量提高63.10%，酒体中乙酸乙酯含量提高85.17%，酒体中乙醛含量减少70.37%，改善了7 轮次基酒中酯类物质低的现状。本研究结果对拜耳接合酵母在酱香型白酒酿造过程中的功能地位提供了理论支持，其作为功能菌剂添加到第7 轮次的发酵结果对功能菌剂的应用及白酒酿造过程中微生物的定向调节与控制提供了重要参考。同时，为实现酱香型白酒稳定高质生产提供了新的调控手段和策略。
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