滇黄精（Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.）为百合科黄精属多年生草本植物，以干燥块茎入药，始载于《神农本草经》，是常用的补益类中药，同时也是药食两用天然植物资源。《中国药典》（2020）[1]记载其具有补气养阴、健脾、润肺、益肾的作用，用于脾胃气虚、体倦乏力、胃阴不足、口干食少、精血不足、腰膝酸软等。现代化学和药理研究证明，黄精的化学成分主要有糖类、皂苷、黄酮类、生物碱、木脂素等，研究人员对黄精的功效研究发现，黄精在延缓衰老、调节免疫力、调节血脂、改善记忆、抗肿瘤、抗菌等方面显示出潜在的药用价值[2-9]。
目前，黄精越来越多地应用于各类兼具营养和功能性的食品中，如黄精酸奶、黄精酵素饮料等。现有关于黄精产品研发的报道中，多采用发酵法进行处理。其中大部分加入外源菌种进行发酵，微生物通过自身代谢活动不仅可以去除黄精的生麻口感、改善适口性，同时还可提升其功效。杨婧娟等[10]对黄精发酵工艺进行探究发现，发酵能去除生黄精的生麻口感及刺激性；钟灿等[11]对添加菌种的蒸制黄精进行发酵，发现产物的酶活随时间的延长而增加；李安等[12]将保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌接种黄精进行发酵得到一款兼具营养和保健功能的发酵功能饮料。以上研究均以外源添加发酵菌种为主，Niu[13]等和Hassani 等[14]发现鲜黄精根茎内富含大量内生菌，其内生菌在共进化的过程中，与宿主植物形成了良好的共生关系，可以作为天然酵素开发的优质原料，目前通过黄精内生菌天然自发酵黄精产品的工艺研究鲜见。
本试验对新鲜滇黄精块茎进行预处理后进行自然发酵，通过单因素和正交试验进行工艺优化，以酶活和功能成分作为评价指标，获得滇黄精天然发酵酵素的最优发酵工艺，并对滇黄精酵素进行活性成分测定和对比，以期为其进一步研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
生滇黄精根茎（六年生）：云南绿生药业有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（≥98%）、人参皂苷Rb1 标准品（≥98%）、芦丁标准品（≥98%）、没食子酸对照品（≥98%）、3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）试剂、福林酚试剂：上海源叶生物科技有限公司；2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐[2，2′-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]（≥98%）：北京索莱宝科技有限公司；过硫酸钾（分析纯）：上海易恩化学技术有限公司；水杨酸、三氯乙酸（均为分析纯）：上海麦克林生化科技股份有限公司；铁氰化钾、三氯化铁（均为分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；苯酚、香草醛、硫酸亚铁（均为分析纯）：广东光华科技有限公司；浓硫酸（分析纯）：汕滇药业有限公司；冰醋酸、甲醇、亚硝酸钠、硝酸铝、碳酸钠（分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
L5S 紫外可见分光光度计：尤尼克（上海）仪器有限公司；K-98-ⅡA 电热恒温水浴锅：天津泰斯特仪器有限公司；SC-3614 低速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；DHG-9420A 电热恒温鼓风干燥箱：重庆实验设备厂；LRH-70 恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 工艺流程
预处理：去皮黄精块茎采用无菌水浸泡10 min，后用75%乙醇浸泡5 min，经无菌水润洗3～5 次后用3%次氯酸钠溶液浸泡5 min，最后用无菌水润洗3～5 次。混合打浆后于37 ℃恒温培养箱静置发酵。
1.3.2 单因素试验
单因素试验以超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、脂肪酶活性、多糖含量、皂苷含量为指标，采用综合评分法进行数据分析。
1.3.2.1 发酵时间对滇黄精酵素的影响
固定料水比为1∶3.5（g∕mL）、初始糖浓度为20%，考察不同发酵时间（9、12、15、18、21 d）对滇黄精酵素的影响。
1.3.2.2 初始糖浓度对滇黄精酵素的影响
固定料水比为1∶3.5（g∕mL）、发酵时间为15 d，考察不同初始糖浓度[0%、5%、10%、15%、20%（质量分数）]对滇黄精酵素的影响。
1.3.2.3 料水比对滇黄精酵素的影响
固定初始糖浓度为20%、发酵时间为15 d，考察不同料水比[1∶1.5、1∶2.5、1∶3.5、1∶4.5、1∶5.5（g∕mL）]对滇黄精酵素的影响。
1.3.3 隶属度综合分析方法
运用隶属度综合评分法[15]进行评分，对各指标进行权重系数确定。酵素综合品质应考虑酶活性，且黄精的主要活性物质为多糖，在使酶活力达到最佳水平的基础上，应尽可能保留发酵过程的活性物质，使其含量达到较高水平。采用隶属度综合评分法和赋予的权重进行加权求和得到各样本的综合评分。基于此目标对各指标进行权重系数确定，SOD 活性、脂肪酶活性、多糖含量、皂苷含量权重系数分别为25%、25%、30%、20%。其中隶属度按下式计算。
式中：L 为指标隶属度；Ci 为指标值；Cmin 为指标最小值；Cmax 为指标最大值。
1.3.4 正交试验
根据单因素试验结果，以黄精酵素的发酵时间、初始糖浓度、料水比设计L9（34）正交试验，因素水平设置见表1。沿用单因素试验指标，应用SPSS 软件进行分析得出最优发酵工艺。
表1 正交试验因素及水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal test
水平123 A 发酵时间∕d 12 15 18 B 初始糖浓度∕%5 10 15 C 料水比∕（g∕mL）1∶2.5 1∶3.5 1∶4.5
1.3.5 理化指标测定
1.3.5.1 SOD 活性测定
采用邻苯三酚自氧化法，参照许雅娟等[16]的方法，于波长325 nm 处测定吸光度。自反应开始每30 s 测定一次吸光度并计算平均增量，记作△A0，在上述反应体系中加入样品液，测定和计算方法同上，记作△A1。样品抑制率（Y，%）及酶活性（X，U∕g）按下式进行计算。
式中：V1 为反应体系总体积，mL；V2 为测试时样品的加入体积，mL；V3 为样品液总体积，mL；n 为样品稀释倍数；m 为样品总质量，g；50% 为酶活力中自氧化速率。
1.3.5.2 脂肪酶活性测定
参照滕宏飞等[17]的方法，采用滴定法测定，脂肪酶活性按下式进行计算。
X =（B - A）× 50 ×（1∕15）× n
式中：X 为样品的酶活性，U∕mL；B 为滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；A 为滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；n 为稀释倍数；50 为0.05 mol∕L 氢氧化钠溶液1.00 mL 相当于脂肪酸50µmol；1∕15 为反应时间15 min，以1 min 计。
1.3.5.3 多糖含量测定
参照王欢等[18]的方法，采用苯酚-硫酸法于490 nm处测定吸光度值。绘制标准曲线方程为y = 49.04x-0.033 2，R2=0.997 8。多糖含量（D，mg∕g）按下式计算。
D = n × C × V1 × V3∕（m × V2）
式中：n 为稀释倍数；C 为葡萄糖的质量浓度，mg∕mL；V1 为反应液体积，mL；V2 为上样量，mL；V3 为样品液总体积，mL；m 为样品总质量，g。
1.3.5.4 皂苷含量测定
参照杜金凤等[19]的方法，采用香草醛-高氯酸比色法于波长545 nm 处测定吸光度。绘制标准曲线方程为y=18.065x-0.002 3，R²=0.99。皂苷含量（Z，mg∕g）按下式计算。
Z = n × C × V1 × V3∕（m × V2）
式中：n 为稀释倍数；C 为人参皂苷Rb1 标准品的质量浓度，mg∕mL；V1 为反应液体积，mL；V2 为上样量，mL；V3 为样品液总体积，mL；m 为样品总质量，g。
1.3.5.5 总黄酮含量测定
参照张可青等[20]的方法，采用分光光度法测定总黄酮含量，绘制标准曲线方程为y = 8.76x-0.017 8，R2=0.997 7。总黄酮含量（H，mg∕g）按下式计算。
H = n × C × V1 × V3∕（m × V2）
式中：n 为稀释倍数；C 为芦丁的质量浓度，mg∕mL；V1 为反应液体积，mL；V2 为上样量，mL；V3 为样品液总体积，mL；m 为样品总质量，g。
1.3.5.6 总多酚含量测定
参照李娜等[21]的方法，采用福林酚比色法测定总多酚含量，绘制标准曲线方程为y=0.128 1x-0.009 4，R2=0.998。总多酚含量（F，mg∕g）按下式计算。
F = n × C × V1 × V3∕（m × V2）
式中：n 为稀释倍数；C 为没食子酸的质量浓度，mg∕mL；V1 为反应液体积，mL；V2 为上样量，mL；V3 为样品液总体积，mL；m 为样品总质量，g。
1.3.5.7 还原糖含量测定
参照曾志恒等[22]的方法，采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量，绘制标准曲线方程为y =11.486x-0.014 9，R2 = 0.999。还原糖含量（T，mg∕g）按下式计算。
T = n × C × V1 × V3∕（m × V2）
式中：n 为稀释倍数；C 为葡萄糖的质量浓度，mg∕mL；V1 为反应液体积，mL；V2 为上样量，mL；V3 为样品液总体积，mL；m 为样品总质量，g。
1.3.6 抗氧化能力测定
1.3.6.1 DPPH 自由基清除能力
参照章烨雯等[23]的方法并稍作修改，取样品上样量20µL，DPPH 工作液180µL。A0 为空白对照组吸光度，A1 为样品体系吸光度，A2 为以甲醇为工作液的反应体系下测得吸光度，DPPH 自由基清除率（P，%）按下式进行计算。
1.3.6.2 ABTS+自由基清除能力
参照章烨雯等[23]的方法并稍作修改，取样品上样量20µL，ABTS 工作液180µL，ABTS+自由基清除率计算公式同1.3.6.1。
1.3.6.3 羟自由基（·OH）清除能力
参照闫旭宇等[24]法并稍作修改，取样品上样量为1 mL，·OH 清除率计算公式同1.3.6.1。
1.3.6.4 总还原力测定
取1 mL 样品液至离心管中，加入磷酸盐缓冲液2.50 mL、铁氰化钾溶液2.50 mL，混匀后置50 ℃恒温水浴反应20 min，反应完成后快速冷却，再加入三氯乙酸溶液2.50 mL。混匀后离心（3 000 r∕min，10 min），取上清液2.50 mL 于另一试管，加入蒸馏水2.50 mL 和氯化铁溶液0.50 mL，充分混匀后在室温下静置10 min，波长700 nm 下测定吸光度，记为A1。蒸馏水作空白对照，记为A0。总还原力（O）计算公式如下。
O = A1 - A0
1.4 数据处理
运用SPSS 26.0 软件进行显著性分析，p<0.05 表示差异显著；采用GraphPad Prism 8.0 软件进行绘图分析；所有试验均进行3 次重复。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 发酵时间对滇黄精酵素的影响
发酵时间对滇黄精酵素的影响如图1 所示。
图1 发酵时间对滇黄精酵素的影响
Fig.1 Effect of fermentation time on the Polygonatum kingianum jiaosu
A.多糖含量、SOD 活性；B.皂苷含量、脂肪酶活性；C.综合评分；同一指标不同字母表示具有显著性差异，p<0.05。
由图1 可知，在发酵时间为9～15 d 时，随着发酵时间的增加，SOD 活性和脂肪酶活力在不断增加，当时间超过15 d 时，各含量及酶活性均呈下降趋势。即随着发酵时间的延长，黄精酵素的酶活力及有效成分的含量均呈现较高水平，表明发酵时间长，自然发酵菌种可将黄精内的活性物质溶出[25]，且酶活较高。12 d 时，多糖含量有所下降，此时已进入发酵中后期，体系中的微生物不断生长[26]，糖源被消耗；而至15 d 时微生物快速繁殖，对植物细胞的破壁作用加强，有效成分溶出增多，随着发酵进行，基质中的营养物质被消耗殆尽以至不足以满足菌体生长所需，微生物代谢渐缓，产酶量减少，导致酶活性降低。SOD 活性及脂肪酶活性在发酵至15 d 时取得最大值，原因可能是黄精酵素的发酵体系适宜其生存，进而生长代谢旺盛，使得两种酶酶活力明显提高，因此选取发酵时间12、15、18 d 进行后续试验。
2.1.2 初始糖浓度对滇黄精酵素的影响
初始糖浓度对滇黄精酵素的影响如图2 所示。
图2 初始糖浓度对滇黄精酵素的影响
Fig.2 Effect of initial sugar concentration on the Polygonatum kingianum jiaosu
A.多糖含量、SOD 活性；B.皂苷含量、脂肪酶活性；C.综合评分；同一指标不同字母表示具有显著性差异，p<0.05。
由图2 可知，多糖和皂苷含量在初始糖浓度0%～10% 时显著提高，当浓度超过15% 时，脂肪酶活性降低，可能是由于较高的渗透压影响酶活性。此外，在前期研究时发现发酵后期乳酸菌含量增多，使得pH 值下降，刘虹蕾等[27]发现低pH 值不利于脂肪酶的催化反应，所以在发酵后期脂肪酶活性显著降低。黄精中内生菌在利用黄精作为底物的条件下发酵，以达到产生特异性酶进行生物转化，但前期试验表明，未加糖发酵试验进行困难，所以在保证乳酸菌正常繁殖的情况下，尽可能减少糖用量，以期使菌群密度上升从而能更多地利用黄精为底物代谢。为维持合适稳定的渗透压，防止菌体提早衰亡，在对活性无显著差异影响下，选取初始糖浓度5%、10%、15%进行后续试验。
2.1.3 料水比对滇黄精酵素的影响
料水比对滇黄精酵素的影响如图3 所示。
图3 料水比对滇黄精酵素的影响
Fig.3 Effect of material-water ratio on the Polygonatum kingianum jiaosu
A.多糖含量、SOD 活性；B.皂苷含量、脂肪酶活性；C.综合评分；同一指标不同字母表示具有显著性差异，p<0.05。
由图3 可知，料水比1∶1.5～1∶4.5（g∕mL）时，多糖及皂苷含量明显上升，可能是由于基质中的糖含量充足，菌体数量增多，进而使得微生物快速繁殖，对植物细胞的破壁作用加强，从而使多糖及皂苷的含量增多。菌种密度高，乳酸菌的破壁作用促使多糖和皂苷等物质溶出，但对部分革兰氏阴性菌存在抑制作用，造成其分泌自身代谢产物的活性下降，导致酶活性降低。活性物质增加，酶活性降低，进一步说明酵素中物质含量的变化与微生物发酵过程中产生的水解酶系有关[28]。除料水比1∶3.5（g∕mL）外，SOD 活性各组间无显著差异，在一定范围内有正常波动。随溶剂添加量增加，脂肪酶活性先增高后下降，可能是溶剂添加量过高，稀释滇黄精酵素有效成分，影响酶活性。综上，选择料水比1∶2.5、1∶3.5、1∶4.5 进行后续试验。
2.2 正交试验
2.2.1 正交试验结果
在单因素试验的基础上，对发酵时间（A）、初始糖浓度（B）、料水比（C）3 个因素进行L9（34）正交试验。以SOD 活性、脂肪酶活性、多糖含量及皂苷含量作为评价指标，利用隶属度综合评分法进行评分，通过分析得最优发酵工艺条件，结果见表2～表3。
表2 正交试验结果
Table 2 Orthogonal test results
序号123456789 A 发酵时空列间111222333 B 初始糖浓度C 料水比123123123 123231312 D123312231 SOD活性∕（U∕g）86.20 81.20 131.90 101.50 316.20 209.70 202.90 177.50 262.10脂肪酶活性∕（U∕mL）0.42 0.38 0.35 0.38 0.47 0.37 0.42 0.50 0.68多糖含量∕（mg∕g）141.00 208.25 227.70 341.60 389.70 218.25 470.70 332.00 449.05皂苷含量∕（mg∕g）0.61 0.78 1.09 0.66 1.24 0.98 1.48 0.83 1.07综合评分0.058 4 0.123 0 0.243 2 0.238 3 0.712 0 0.307 2 0.682 5 0.440 4 0.828 5
续表2 正交试验结果
Continue table 2 Orthogonal test results
序号k1 SOD活性∕（U∕g）脂肪酶活性∕（U∕mL）多糖含量∕（mg∕g）皂苷含量∕（mg∕g）综合评分k2 k3R A 发酵时间0.142 0.419 0.650 0.508 B 初始糖浓度0.326 0.425 0.460 0.134 C 料水比0.269 0.397 0.546 0.277空列D 0.533 0.371 0.307 0.226
表3 正交试验方差分析
Table 3 Orthogonal test analysis of variance
项目自由度F ABC误差均方0.195 0.014 0.058 0.188 9 0.013 6 0.056 2显著性不显著不显著不显著总和平方和0.390 0.029 0.116 0.0812 0.615 22228
由表2 可知，根据综合评分，各因素对滇黄精酵素影响程度的大小为发酵时间>料水比>初始糖浓度。正交试验结果表明，最佳发酵工艺条件为A3B3C3，即发酵时间18 d、初始糖浓度15%、料水比1∶4.5（g∕mL）。
由表3 方差分析结果得到，FA>FC>FB，发酵时间对滇黄精酵素生产工艺影响效果最大，其次是料水比，初始糖浓度对其影响最小，与正交试验结果分析一致。
2.2.2 验证试验
对最优条件进行3 次平行试验，对其各项指标进行综合评价，验证配方的合理性，结果见表4。
表4 验证试验结果
Table 4 Results of validation test
工艺A3B3C3 SOD 活性∕（U∕g）181.59±7.92脂肪酶活性∕（U∕mL）0.77±0.41多糖含量∕（mg∕g）543.60±43.73皂苷含量∕（mg∕g）3.26±1.81综合评分0.856 8
在A3B3C3 工艺下进行验证试验，脂肪酶活性、多糖及皂苷含量均高于正交试验中各组，综合评分高于正交试验中最高组，说明此工艺合理可行。
2.3 理化指标结果
最优发酵工艺条件和未发酵生滇黄精理化指标结果见表5。
表5 理化指标测定结果
Table 5 Determination results of physicochemical indicators
注：-表明该样品未测出指标值。
测定指标SOD 活性∕（U∕g）脂肪酶活性∕（U∕mL）总黄酮含量∕（mg∕g）总多酚含量∕（mg∕g）还原糖含量∕（mg∕g）多糖含量∕（mg∕g）皂苷含量∕（mg∕g）DPPH·清除率∕%ABTS+·清除率∕%·OH 清除率∕%未发酵生滇黄精--2.180±0.026 143.21±9.63 7.88±3.12 466.56±10.22 1.89±0.85 12.98±2.00 33.52±0.95 84.49±0.91最优工艺发酵生滇黄精181.59±7.92 0.77±0.41 0.650±0.004 228.98±7.04 423.47±50.76 543.60±43.73 3.26±1.81 33.79±2.17 41.27±0.03 91.06±0.79
由表5 可知，经过发酵后的酵素液总多酚、还原糖、皂苷、多糖含量增加，SOD 活性及脂肪酶活性增强。可能是因为在高渗透压的溶液环境下，酚类物质可能析出，同时，滇黄精酵素中众多微生物的复杂代谢较迅速，消耗了原料中的其他成分从而生成酚类物质。高维锡等[29]发现，微生物代谢产生的蛋白酶、纤维素酶和果胶酶可从不溶性基质中释放结合酚类化合物，并将其水解为游离形式，增加发酵产物中多酚含量。而总黄酮含量的下降可能是由于黄酮物质中的某些成分发生了生物转化或降解引起。多糖、皂苷等已被药理研究广泛证实为具备抗氧化能力的活性物质，在发酵后的滇黄精酵素中含量明显上升。DPPH·、ABTS+·、·OH的清除率均有所上升，表明滇黄精在自然发酵过程中自身进行了生物转化，具有较好的抗氧化作用。
3 结论
以新鲜滇黄精为原料，通过自然发酵，运用单因素和正交试验优化其工艺，对最佳工艺发酵的酵素多糖、皂苷含量以及SOD、脂肪酶活性进行测定。根据综合评分得出滇黄精自然发酵最优工艺条件为发酵时间18 d、初始糖浓度15%、料水比1∶4.5（g∕mL）。该工艺得到的滇黄精酵素SOD、脂肪酶活性分别为181.59 U∕g、0.77 U∕mL，多糖、皂苷含量为543.60、3.26 mg∕g，具有一定DPPH·、ABTS+·、·OH 清除能力；自然发酵滇黄精酵素的还原糖及总多酚含量高于未发酵的滇黄精。综上，发酵不仅能提高体系中的酶活力，还对其中的生物转化及活性物质的生成具有一定的促进作用。在今后的研究中可着重关注发酵体系中微生物群落的变化，以期实现对微生物菌群的调控，为黄精酵素的开发提供一定的理论依据。
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