藤茶（Ampelopsis grossedentata W.T.）为葡萄科蛇葡萄属植物，常作为健康茶饮或饮料而被广泛消费，具有较好的抗氧化活性[1-3]、抑制α-葡糖苷酶活性[4]、改善2型糖尿病患者症状[5]以及调节血脂血糖且无毒性副作用[4]等多种生理功效。研究表明，藤茶中黄酮干重含量在20%～40%，其中二氢杨梅素（dihydromyricetin，DHM）为最主要的黄酮类化合物，含量占总黄酮的50% 以上[3，5]。已有研究显示，藤茶的生理活性与其DHM 功能有着密不可分的联系，如DHM 可降低氧化应激损伤[6]、保护心血管系统[7]、调节肠道菌群[8]。此外，藤茶DHM 还作为抗氧化剂和抗菌剂被广泛用于食用油、面制品及肉制品加工中[9-11]。因此，DHM 是藤茶中最主要的生物活性成分。
近年来，消费者对健康生活方式关注的提升导致其对功能饮料的需求增加[12]。在全球功能食品市场中，功能性饮料市场（平均年增长率为9%）占据了主导地位，到2025 年，功能性饮料预计将占消费者总需求的40%[12]。其中，饮用草药饮料是一种递送营养物质（矿物质、维生素）和植物生物活性化合物（如萜烯、皂苷、生物碱及抗氧化剂）的极好方法[13]，并因其可改善机体氧化应激水平，提高整体健康状况而逐渐受到消费者和研究人员的关注[14]。制备饮用草药饮料的原料包括绿茶、咖啡、玫瑰、谷物、苦丁茶、金虎尾、车前草等，主要生物活性物质包括多酚、酚酸、黄酮、甾醇、类胡萝卜素等[12-13，15-16]。同时，研究表明，这些天然生物活性化合物具有抗氧化、抗炎、抗血栓及血管舒张等生物效应[9，12]。因此，开发植物功能性饮料是满足未来消费者对健康需求的重要途径。
尽管藤茶DHM 具有诸多生理活性，且被建议用于功能食品、营养制品及饮料的加工中，然而，其低溶解性、亲油性及有限的热稳定性限制了其可加工性及其在食品工业中的应用[9]。同时，功能性饮料的生物活性往往具有浓度依赖性，而高含量的生物活性成分不仅会影响饮料的贮藏品质，还会影响到消费者的可接受度（适口性）[15]。此外，在饮料开发中，常易出现褐变、浑浊及沉淀等现象，是影响饮料品质的关键因素之一[8]。对此，通常采用抗氧化剂、护色剂、稳定剂（乳化剂）等方式加以控制，且在已有研究及产品开发中得到实际应用，并取得了较好的效果[17-18]。本课题组虽已将藤茶结合其它药食两用植物加工成复合饮料[19]，但在后续试验中发现该复合饮料在贮藏过程中易出现褐变、浑浊及沉淀现象，这极大地缩短其货架期。因此，本研究以藤茶饮料为研究对象，探究其在贮藏过程中理化性质的变化，并考察杀菌时间、山梨酸钾、护色剂及稳定剂对藤茶复合饮料色泽、浊度、沉淀率及黄酮保留率的影响，以期为提高藤茶复合饮料的贮藏稳定性提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
藤茶：铜仁学院藤茶基地，引种于铜仁市江口县德旺镇；金银花、绞股蓝、丹参：市售；无水乙醇、Al（NO3）3、NaNO2、NaOH、硫酸肼、环六亚甲基四胺（均为分析纯）：上海麦克林生化科技股份有限公司；黄原胶、羧甲基纤维素钠（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na）、海藻酸钠（均为食品级）：上海梯希爱化成工业发展有限公司；亚硫酸钠（食品级）、半胱氨酸（C3H7NO2S，分析纯）、乙酸锌（分析纯）、山梨酸钾、苹果酸、柠檬酸、维生素C（vitamin C，VC）：江西华豫源生物科技有限公司；果葡糖浆（食品级）：中粮融氏生物科技有限公司；DHM（纯度>95%）：吉首大学林产化工工程湖南省重点实验室。
1.2 仪器与设备
恒温培养箱（SPX-150）：金坛市三和仪器有限公司；酶标仪（SYNERGYH1MG）：美国基因工程技术公司；台式数显浊度计（WGZ-1A）：上海力辰邦西仪器科技有限公司；色差仪（TS8216）：深圳市三恩时科技有限公司；水浴锅（DK-S26）、恒温干燥箱（DHG-9071A）、高频超声清洗仪（KH-160 TDB）：上海精其仪器有限公司；均质机（ESB-500X）：上海易勒机电设备有限公司；微波炉（PC23M6W）：广东美的厨房电器制造有限公司。
1.3 方法
1.3.1 藤茶复合饮料的制备
参考文献[19]方法并稍作修改，将采摘的新鲜藤茶杀青（120 ℃）15 min 后，置于40 ℃烘箱中干燥（24 h），粉碎过60 目筛，备用。按质量比为3∶2∶1∶1（藤茶粉∶金银花∶丹参∶绞股蓝）称取4 种原料，以料液比1∶100（g∕mL）加入蒸馏水，并于75 ℃水浴锅中浸提40 min，抽滤除滤渣，收集滤液。量取100 mL 滤液，先将稳定剂（黄原胶、CMC-Na、海藻酸钠）按一定配比在80 ℃下溶解于部分（20～30 mL）滤液中，充分混匀后冷却至室温。加入剩余的提取液、VC（0.2 mg∕mL）、苹果酸、柠檬酸及果葡糖浆，经超声脱气（5 min）、均质（5 min）、微波灭菌（3 min）、冷却后密封并灌装。
1.3.2 贮藏条件对藤茶复合饮料稳定性的影响
1.3.2.1 贮藏时间的影响
将制备好的藤茶复合饮料贮藏于28 ℃恒温培养箱中，分别贮藏0、6、12、18、24、30、36、42、48、54 d。每个时间节点设置3 组平行试验，并在每个时间节点测定藤茶复合饮料的理化指标。
1.3.2.2 贮藏温度的影响
将制备好的藤茶复合饮料分别置于10、20、28、36、44 ℃恒温培养箱中，贮藏28 d。每个贮藏温度设置3 组平行试验，贮藏结束后测定藤茶复合饮料的理化指标。
1.3.2.3 微波杀菌时间的影响
微波杀菌时间分别设置为0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 min，并将制备好的饮料置于28 ℃恒温培养箱中，贮藏28 d。每个杀菌时间设置3 组平行试验，贮藏结束后测定藤茶复合饮料的理化指标。
1.3.2.4 山梨酸钾添加量的影响
按照1.3.1 的方法制备藤茶复合饮料，添加山梨酸钾时，添加量设置为0、0.03、0.05、0.07、0.09 mg∕mL，于28 ℃贮藏28 d。每组设置3 次平行试验，贮藏结束后测定藤茶复合饮料的理化指标。
1.3.3 护色剂对藤茶复合饮料稳定性的影响
添加护色剂时，先考察不同护色剂（Na2SO3、VC、乙酸锌、C3H7NO2S，0.30 mg∕mL）对藤茶复合饮料稳定性的影响，再考察复配护色剂及添加量（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg∕mL）对藤茶复合饮料稳定性的影响，并以空白组为对照，于28 ℃贮藏28 d。每组设置3 次平行试验，贮藏结束后测定藤茶复合饮料的理化指标。
1.3.4 稳定剂对藤茶复合饮料稳定性的影响
先考察不同稳定剂（空白组、黄原胶、海藻酸钠、CMC-Na，0.3 mg∕mL）及CaCl2（0.3 mg∕mL）对藤茶复合饮料稳定性的影响，再考察复配稳定剂（等比例复配）的稳定效果，于28 ℃贮藏28 d。每组设置3 个平行试验，贮藏结束后测定藤茶复合饮料的理化指标。复配稳定剂的配比见表1。
表1 复配稳定剂的配比类型及用量
Table 1 Composite type and amount of stabilizers
稳定剂CMC-Na+CaCl2海藻酸钠+CaCl2黄原胶+CaCl2黄原胶+CMC-Na+CaCl2黄原胶+海藻酸钠+CaCl2海藻酸钠+CMC-Na+CaCl2黄原胶+海藻酸钠+CMC-Na+CaCl2总用量∕（mg∕mL）0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
1.3.5 理化指标测定
1.3.5.1 浊度的测定
根据文献[20]并适当修改，采用台式数显浊度计进行测定。
福尔马肼浑浊度标准液的配制：分别吸取5.00 mL溶液（1 g∕100 mL）和5.00 mL 环六亚甲基四胺溶液（10 g∕100 mL）于100 mL 容量瓶中，混匀，于（25±2）℃静置24 h 后，用纯水稀释至刻度，混匀后再稀释4 倍，即得福尔马肼浑浊度标准液。
浊度的测定：以纯水为空白组，测定其浊度后清零；再用浊度计测定福尔马肼浑浊度标准液的浊度值，并校准为100 NTU；取适量待测样品，采用浊度计测定，读取其浊度即为样品的浊度值。
1.3.5.2 沉淀率的测定
参照文献[21]并适当修改，将滤纸置于60 ℃恒温干燥箱中，干燥至恒重（重复称重之间差值不超过0.005 0 g），并记为m0（mg）。取100 mL（V）藤茶复合饮料，采用真空泵和上述滤纸进行抽滤，将截留有沉淀物的滤纸置于60 ℃恒温干燥箱中，干燥至恒重（重复称重之间差值不超过0.005 0 g），记为m1（mg）。藤茶复合饮料的沉淀率（S，mg∕100 mL）按公式（1）计算。
1.3.5.3 色差值的测定
参照文献[22]，取适量1.3.5.2 中抽滤所得的滤液，采用色差仪测定滤液的L*、a*、b*值（测量5 次），并根据贮藏前后L*、a*、b*值计算复合饮料色差值，即ΔL、Δa、Δb。总色差变化用ΔE 表示，计算方法如公式（2）所示。
1.3.5.4 黄酮保留率的测定
参照文献[23]并适当修改，以DHM 为标品，以80%乙醇配制浓度为1 mg∕mL 的标准母液。然后再稀释配制0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mg∕mL 标准溶液。取1 mL 标准溶液于10 mL 聚乙烯离心管中，加入4 mL 超纯水和0.3 mL 5% NaNO2 溶液，室温反应6 min 后加入0.3 mL 10% Al（NO3）3 溶液，混匀后加入2 mL 1 mol∕L NaOH 溶液，反应6 min 后涡旋振荡约1 min，静置10 min 后在510 nm 处测定吸光度，以吸光度（x）和浓度（y）绘制标准曲线：y=0.145 7x+0.018 8，R2=0.990 2。
藤茶复合饮料中黄酮含量的测定：取2 mL 饮料样品，按照上述方法测定饮料样品中黄酮的含量，样品中总黄酮含量以DHM 当量（mg DE∕100 mL）计。有沉淀或悬浮物样品，按1.3.5.2 方法抽滤后，再测定滤液中总黄酮的含量。藤茶复合饮料黄酮保留率（R，%）按公式（3）计算。
式中：F1 为贮藏后藤茶复合饮料上清液中总黄酮含量，mg∕mL；F0 为贮藏前新鲜藤茶复合饮料中总黄酮含量，mg∕mL。
1.4 数据处理
采用IBM SPSS 22.0 软件对试验数据进行处理与分析，并采用单因素方差分析（1-way analysis of variance，1-way ANOVA）法进行差异显著性检验，采用Origin 86 软件作图。
2 结果与分析
2.1 贮藏条件对藤茶复合饮料稳定性的影响
藤茶复合饮料在贮藏过程（28 ℃）中，贮藏条件对其稳定性的影响如图1 所示。
图1 贮藏条件对藤茶复合饮料稳定性的影响
Fig.1 Effect of storage conditions on the stability of Ampelopsis grossedentata compound beverage
（A）、（D）为贮藏时间及贮藏温度对浊度和沉淀率的影响；（B）、（C）为贮藏时间及贮藏温度对色差和黄酮保留率的影响；（E）、（F）为山梨酸钾添加量对色差、黄酮保留率、浊度和沉淀率的影响。同一指标不同字母表示不同试验组之间存在显著差异，P<0.05。
由图1（A）、图1（B）可知，色差、浊度及沉淀率随时间的延长呈先上升后降低趋势，而黄酮保留率呈下降趋势，所有指标在42 d 后趋于稳定，其中黄酮保留率最终降低至约55%，而沉淀率最高可达76.0 mg∕100 mL，其中浊度的变化与已有研究存在相似的规律[24]。贮藏期间（≤28 d），温度越高，黄酮保留率越高，沉淀率及浊度也随之降低，说明增加温度有利于藤茶复合饮料中黄酮的稳定[图1（C）、图1（D）]。然而，温度过高（30 ℃）会导致色差极度增加，并出现一定程度的褐变现象。此外，添加山梨酸钾有助于降低藤茶复合饮料的色差、浊度及沉淀率，但添加量超过0.05 mg∕mL 后，黄酮保留率及沉淀率不再有显著变化[图1（E）、图1（F）]。有研究显示果蔬饮料中花青素在43 ℃会发生降解，且花青素保留率与贮藏时间呈负相关[25]。由此说明，低温和高温均不利于保持藤茶复合饮料的贮藏稳定性，添加适量的防腐剂可在一定程度上增强其稳定性。这主要是由于藤茶中DHM 在低温条件下的溶解度较低，而在温度过高时又易发生褐变反应，较长时间贮藏会导致黄酮类分子相互聚集而沉淀[9]；光照和残留微生物可能也会使藤茶复合饮料中的黄酮降解[20]。添加适量山梨酸钾可抑制残存微生物的生长，从而抑制微生物产色素或黏液多糖，进而可降低藤茶复合饮料的色差、浊度及沉淀率[24]。整体而言，添加0.05 mg∕mL 的山梨酸钾，并贮藏于30～35 ℃，有利于提高藤茶复合饮料的贮藏稳定性。
不同测定指标之间的相关性分析结果如表2 所示。
表2 不同测定指标之间的相关性分析
Table 2 Correlation analysis among various parameters
注：**表示两个指标之间存在极显著相关性。
项目贮藏时间浊度沉淀率色差黄酮保留率浊度沉淀率色差黄酮保留率贮藏时间1 0.955**0.958**0.955**-0.957**1 0.951**0.910**-0.957**1 0.983**-0.999**1-0.980**1
由表2 可知，沉淀率与色差、浊度与沉淀率、色差与黄酮保留率、沉淀率与黄酮保留率的相关系数分别为0.983、0.951、-0.980、-0.999，表明不同指标之间存在紧密的相关性，特别是沉淀率与黄酮保留率之间存在高度相关性，进一步说明黄酮在藤茶复合饮料中的稳定性与其溶解性及化学性质有紧密联系。
2.2 杀菌时间对藤茶复合饮料稳定性的影响
微生物对饮料及其它食品的贮藏稳定性有重要影响作用[24]，藤茶复合饮料经不同微波杀菌时间处理后，其稳定性指标如图2 所示。
图2 杀菌时间对藤茶复合饮料稳定性的影响
Fig.2 Effect of sterilization time on the stability of Ampelopsis grossedentata compound beverage
同一指标不同字母表示不同试验组之间存在显著差异，P<0.05。
由图2 可知，杀菌3 min 时藤茶复合饮料色差最低；杀菌4 min 时，黄酮保留率最高，而浊度及沉淀率最低；杀菌时间过短或过长均会对藤茶复合饮料贮藏稳定性产生不利影响。这可能是因为杀菌时间太短，残存活性微生物数量较多，贮藏期间生长繁殖较快，次级代谢产物分泌随着时间延长而逐渐增加，导致色差、浊度及沉淀率增加，黄酮被微生物代谢利用使其保留率降低；杀菌时间过长，会导致黄酮发生氧化，产生褐变，降低其保留率，也可能使少量蛋白变性而降低其溶解性，导致沉淀率增加。综上所述，杀菌时间应控制在3～4 min。然而，在实际生产应用中，适宜杀菌时间会因杀菌方式的不同而有所适当调整。
2.3 护色剂对藤茶复合饮料稳定性的影响
藤茶复合饮料添加防腐剂并经适当杀菌后，其贮藏稳定性指标得到有效控制。然而，饮料的色泽（ΔE>3.0）、黄酮保留率（<85%）及沉淀率（>30 mg∕mL）仍有提升的必要。添加适当的护色剂后，藤茶复合饮料色差、浊度、黄酮保留率及沉淀率如图3 所示。
图3 护色剂对藤茶复合饮料稳定性的影响
Fig.3 Effect of color inhibitors on the stability of Ampelopsis grossedentata compound beverage
（A）单一护色剂种类；（B）复配护色剂种类；（C）复配护色剂添加量对色差及黄酮保留率的影响；（D）复配护色剂添加量对浊度及沉淀率的影响。同一指标不同字母表示不同试验组之间存在显著差异，P<0.05。
由图3（A）可知，单一护色剂中，Na2SO3 和VC 相比空白组，可有效降低藤茶复合饮料的色差，C3H7NO2S的护色效果次之，而Zn（CH3COO）2 虽能显著抑制色泽的变化，但效果并不理想。因此，将效果明显的护色剂（Na2SO3、VC 及C3H7NO2S）进行复配，以进一步稳定藤茶复合饮料的色泽。
由图3（B）可知，相比单一护色剂，VC 与Na2SO3 复配的效果更佳，其色差值相比单一护色剂VC 降低了73%，而将Na2SO3、VC 及C3H7NO2S 复配虽能进一步降低色差，但差异不显著。因此，将VC 与Na2SO3 以质量比1∶1 复配即可显著抑制藤茶复合饮料的褐变。
由图3（C）、图3（D）可知，色差和浊度随复配护色剂添加量增加而逐渐降低，但超过0.4 mg∕mL 不再有明显变化；超过0.3 mg∕mL 后，沉淀率不再显著降低，黄酮保留率也不再显著增加。类似地，Chung 等[26]采用VC 与阿拉伯胶处理胡萝卜花青素饮料后，相比对照组，处理组饮料的色差明显降低。Zhao 等[27]发现添加质量比为0.25% 的黄原胶与VC 在较高贮藏温度（40 ℃）下也可提高花青素饮料的色泽稳定性。综上所述，VC 具有较强的抗氧化作用，与Na2SO3 复配时，其护色效果更佳，这可能是护色剂和稳定剂存在一定的协同作用，既可增加藤茶饮料中黄酮的溶解性，同时还可避免黄酮被氧化，因而VC 与Na2SO3 复配时的总添加量控制在0.3～0.4 mg∕mL 即可起到较好的护色效果。
2.4 稳定剂对藤茶复合饮料稳定性的影响
黄原胶、海藻酸钠、CMC-Na 及CaCl2 4 种常用稳定剂及其复配对藤茶复合饮料色泽、黄酮保留率、浊度及沉淀率的影响如图4 所示。
图4 稳定剂对藤茶复合饮料稳定性的影响
Fig.4 Effect of stabilizers on the stability of Ampelopsis grossedentata compound beverage
（A）、（C）分别为单一稳定剂、复合稳定剂种类对黄酮保留率的影响；（B）、（D）分别为单一稳定剂、复合稳定剂种类对沉淀率的影响；（E）、（F）分别为
复配稳定剂添加量对色差、黄酮保留率、浊度及沉淀率的影响。同一指标中中不同字母表示不同试验组之间存在显著差异，P<0.05。
由图4 可知，单一稳定剂中，黄原胶、CMC-Na 能够显著抑制饮料沉淀的产生，且抑制作用较为明显，同时也能显著增加黄酮保留率，而海藻酸钠与CaCl2 的效果稍差。将上述3 种单独和两两复合的稳定剂分别与CaCl2 复配（添加总量为0.3 mg∕mL）后[图4（C）、图4（D）]，藤茶复合饮料沉淀率进一步明显降低，黄酮保留率进一步明显增加，其中黄原胶+CMC-Na+CaCl2 的稳定效果较佳，其沉淀率为（12.3±1.1）mg∕100 mL，黄酮保留率达（94.0±1.5）%。进一步考察黄原胶+CMC-Na+CaCl2 添加量的影响[图4（E）、图4（F）]，当添加量超过0.3 mg∕mL 后，黄酮保留率并未显著增加，沉淀率也并未显著降低，相反，色差和浊度还会略微增加，这与已有研究存在相似的结论[24]。有研究用黄原胶及CMC-Na处理蛋白水解物，发现黄原胶（1 mg∕mL）可有效降低蛋白的聚集[28]。也有研究发现CaCl2 可以减少牛奶饮料在贮藏过程中蛋白质的聚集，从而降低饮料的黏度，结合热处理后，这种稳定效果更佳[29]，且在加热过程中，CaCl2 有助于过氧化物酶失活，说明CaCl2 在水溶液中具有抑制生物大分子链内或链间相互聚焦的作用。此外，结兰胶、黄原胶与VC 可显著提升花青素饮料的热稳定和贮藏稳定性，其机理主要可能是这些稳定剂在VC 协助下通过其氢键及疏水相互作用提高饮料的稳定性[27，30]。Lamsem 等[31]采用阿拉伯胶对脂溶性维生素D 进行封装，可明显提高维生素D 的生物可及性及低温贮藏稳定性。因此，复配稳定剂的稳定效果更好，可能是因为不同稳定剂之间及其与藤茶复合饮料中黄酮的相互作用存在差异，可通过协同或叠加效应增强稳定剂在溶液中形成的网络结构，进而封装黄酮分子并增强其稳定性，CaCl2 中的Ca2+可能会在不同稳定剂或相同稳定剂间起到交联作用，进而提高复配稳定剂网络结构的强度，因而对黄酮的封装效果更佳[32-33]。综上所述，黄原胶+CMC-Na+CaCl2 的添加量应控制在0.3～0.4 mg∕mL 为宜。
3 结论
藤茶复合饮料贮藏42 d 左右，其色泽、组织状态及黄酮保留率不再有明显变化。色差及浊度与黄酮保留率呈显著负相关性，特别是沉淀率与黄酮保留率存在极显著相关性，这在一定程度上说明藤茶中黄酮的理化性质是影响藤茶复合饮料稳定性的关键因素。经适当的杀菌（3～4 min），并添加山梨酸钾（约0.05 mg∕mL）、复配护色剂（VC 与Na2SO3，总量0.3～0.4 mg∕mL）及复配稳定剂（黄原胶+CMC-Na+CaCl2，总量0.3～0.4 mg∕mL）可有效增强藤茶复合饮料的贮藏稳定性。这可能是因为复配护色剂之间、复配稳定剂之间、护色剂及稳定剂之间均存在一定程度的协同效应，进而提高了藤茶复合饮料的黄酮保留率。然而，采用食品护色剂和稳定剂虽可明显增强藤茶复合饮料的短期贮藏稳定性，但未考察其长期效果，且未与固体乳化剂、微型乳化剂、纳米封装技术、化学修饰及酶修饰技术进行对比。因此，今后有必要采用更先进的技术进一步提高藤茶复合饮料的贮藏稳定性，并深入研究其可能的作用机制，为藤茶资源的开发与利用提供更多参考。
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