黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）广泛分布于我国西北地区及西藏高原盐渍沙漠[1]，含有许多生物活性成分，对人体健康有很大益处[2]，其花色苷含量高于许多植物[3]。黑果枸杞富含花色苷，特别是酰化花色苷[矮牵牛素-3-O-芸香糖（反式-p-香豆酰基）-5-O-葡萄糖苷][4]，可调控肠道菌群结构[5-6]，改善肠道微生物[7]，具有抗氧化、预防心血管疾病等功能[8]。
然而，花色苷在储存过程中其稳定性易受pH 值、温度、结构等因素影响[9]，易降解和发生色泽变化[10]，故大部分黑果枸杞均以干果形式销售[11]，特别是温度高于50 ℃会导致花色苷部分或完全降解[12-13]，低于50 ℃时，花色苷较稳定[14]。而发酵属于冷加工，低温有助于花色苷的保存[15]，通过发酵技术可以在很大程度上保留花色苷类物质的稳定性和生物活性[16]，丰富其相关产品开发，从而拓宽其市场[17]。史晓华等[18]利用仙人掌果和黑枸杞作为原料酿制复合果酒并研究其发酵工艺，通过对温度、糖度及酵母菌的添加比例等酿造因子的考察，确定最优发酵工艺，糖度和酵母菌添加比例对花青素稳定性的影响不明显。Guerrand 等[19]发现EX-V果胶酶可以提升果酒中花色苷的稳定性，对果酒颜色和酚类物质浸提能力有增强作用。而目前，有关黑果枸杞与酿酒葡萄混合发酵果酒发酵工艺及在酿造过程中花色苷稳定性等方面的研究报道鲜见。
黑果枸杞鲜果成熟果实呈紫黑色，虽然富含酚类物质，尤其是花色苷组分，但与成熟的酿酒葡萄相比，黑果枸杞果实含糖量和酸度低，同时香气成分也较少，若单一酿造，需人为添加大量蔗糖、柠檬酸或酒石酸来调整原料组成，致使果酒口感较差，缺乏怡人的果酒香气，而且不利于酒体花色苷的保存，无法酿造优质果酒[20]。酿酒葡萄与黑果枸杞同为浆果，果实色泽相近，并具有浓郁的浆果香气，因此考虑将黑果枸杞汁与酿酒葡萄汁混合共同发酵酿造果酒[21]。本研究通过单因素试验，考察不同酿造因子对果酒中多酚及花色苷含量的影响，通过正交试验优化最佳酒精发酵工艺，在发酵过程中可以高效地利用黑枸杞花色苷物质，以期为黑果枸杞资源的综合利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）：国家枸杞工程技术研究中心种质资源圃（宁夏，银川）；酿酒葡萄（Cabernet Sauvignon）：国家枸杞葡萄种质资源圃（宁夏，银川）。共发酵果酒由国家枸杞工程技术研究中心枸杞加工室酿制；张裕干红葡萄酒（赤霞珠葡萄采收于2009 年，生产日期2013.09.04）：烟台张裕葡萄酒股份有限公司。
EX-V 果胶酶（>3 479.3 U∕g）、FX-10（Zymaflore FX10）、RX-60（Zymaflore RX60）、AC 活性干酵母、活性乳酸菌（Lactoenos 450 Pre AC）（食品级）：法国LAFFORT 公司；2-氯苯丙氨酸、甲醇、乙腈（均为色谱纯）：德国Merck 公司；矮牵牛素-3-O-芸香糖（反式-p-香豆酰）-5-O-葡萄糖苷标准品（纯度>90%）：国家枸杞工程技术研究中心枸杞加工室自制；甲酸（色谱纯）：天津市大茂化学试剂厂；乙醚（分析纯）：四川西陇科学有限公司。
1.2 仪器与设备
MS 204S 分析天平：德国赛多利斯公司；125L 不锈钢发酵罐：山东烟台市吉讯酿酒设备加工厂；ZORBAX XB-Aq 914 柱（4.6 mm×250 mm，5µm）、1260 高效液相色谱系统（G1311C Quat Pump，G1329B ALS，G1316A TCC，G1315D DAD）：美国安捷伦科技有限公司；TU1810 紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；CM-5 分光测色仪：日本柯尼卡美能达控股株式会社。
1.3 试验方法
1.3.1 工艺流程
黑果枸杞鲜果与酿酒葡萄分别除梗破碎，按质量比1∶3 混合，加入果胶酶0.50 g∕L，补二氧化硫40×10-6 mg∕L，16～18 ℃冷浸渍（cold soaking，CS）7 d，有助于果肉细化，提高出汁率和色素溶出[22]。7 d 后进行酒精发酵（alcohol fermentation，AF）。称取0.25 g∕L 活性酿酒干酵母融入少量混合浆液进行活化，3～4 h 后将活化后的酵母菌接种到黑果枸杞与酿酒葡萄混合汁中，20～22 ℃发酵7 d 左右。检测酒体中残糖含量<5 g∕L，酒精发酵结束，进行皮渣分离，自流汁经管道流入新消毒的罐中，皮渣经过30～50 MPa 压力出汁，与自流汁混合，进入苹果酸-乳酸发酵（malolactic fermentation，MLF）。乳酸菌按10 mg∕L 加入酒中，18～20 ℃缓慢发酵30～60 d，降低酒体酸度，使酒体变得饱满、柔和，提高酒体风味和稳定性[23]，当苹果酸微量时，苹果酸-乳酸发酵（malolactic fermentation，MLF）阶段结束。倒罐，低温澄清（clarification，CF）30 d，倒入新罐中，补二氧化硫20×10-6 mg∕L，封口陈酿（Ageing）。试验分为6 组：CS 为冷浸渍时期；AF 为酒精发酵时期；MLF 为苹果酸-乳酸发酵时期；CF-30 d，为澄清（30 d）时期；Ageing-1M 为陈酿1 个月；Ageing-2M 为陈酿2 个月。
1.3.2 单因素试验设计
考察酿酒葡萄添加量、酵母菌类型及不同发酵pH值对黑果枸杞果酒多酚、花色苷的影响，明确不同酿造因子对酿造时期果酒品质的影响作用，具体试验设计如表1～表3 所示。
表1 不同原料配比酿造黑果枸杞果酒试验设计
Table 1 Design scheme for brewing Lycium ruthenicum Murr.fruit wine with different addition mass ratios
编号LRM-WG WG LRM黑果枸杞与酿酒葡萄质量比1∶3纯葡萄纯黑果枸杞果胶酶添加量∕（g∕L）0.50 0.50 0.50酵母菌种FX-10 FX-10 FX-10酵母添加量∕（g∕L）0.25 0.25 0.25 pH 值3.9 3.9 3.9
表2 不同酿酒酵母菌酿造黑果枸杞果酒试验设计
Table 2 Experimental design scheme for brewing Lycium ruthenicum Murr.fruit wine with different Saccharomyces cerevisiae
编号Yeast-1 Yeast-2 Yeast-3 Yeast-4黑果枸杞与酿酒葡萄质量比1∶3 1∶3 1∶3 1∶3果胶酶添加量∕（g∕L）0.50 0.50 0.50 0.50酵母菌种RX-60 AC FX-10 3 种酵母1∶1∶1酵母添加量∕（g∕L）0.25 0.25 0.25 0.25 pH 值3.9 3.9 3.9 3.9
表3 不同pH 值条件酿造黑果枸杞果酒试验设计
Table 3 Experimental design scheme of brewing Lycium ruthenicum Murr.fruit wine under different pH conditions
编号123黑果枸杞与酿酒葡萄质量比1∶3 1∶3 1∶3果胶酶添加量∕（g∕L）0.50 0.50 0.50酵母菌种FX-10 FX-10 FX-10酵母添加量∕（g∕L）0.25 0.25 0.25 pH 值3.5 3.9 4.3
1.3.2.1 酿酒葡萄添加量对黑果枸杞果酒花色苷的影响
黑果枸杞与酿酒葡萄按质量比1∶3 混合，并以单一酿酒葡萄、单一黑果枸杞发酵作为对照组，加入果胶酶0.50 g∕L，18 ℃下冷浸渍7 d，添加FX-10 酵母菌0.25 g∕L 至混合汁中，pH 值为3.9，22 ℃下经过7～10 d的发酵，使残糖含量<5 g∕L，酒精发酵结束。试验分为3 组：LRM-WG 表示酿酒原料为黑果枸杞：酿酒葡萄（质量比）；WG 为单一酿酒葡萄；LRM 为单一酿酒葡萄。
1.3.2.2 不同酵母菌对黑果枸杞果酒花色苷的影响
黑果枸杞与酿酒葡萄按质量比1∶3 混合，加入果胶酶0.50 g∕L，18 ℃下冷浸渍7 d，分别添加不同酵母菌（RX-60、AC、FX-10 和RX-60、AC、FX-10 3 种酵母菌株质量比1∶1∶1 混合）0.25 g∕L 至混合汁中，pH 值为3.9，22 ℃下发酵7～10 d，至残糖含量<5 g∕L，酒精发酵结束。试验分为4 组：Yeast-1、Yeast-2、Yeast-3、Yeast-4 分别表示酵母菌种RX-60、AC、FX-10 以及前3 种酵母菌株质量比1∶1∶1 混合。
1.3.2.3 不同pH 值对发酵后酒体花色苷的影响
黑果枸杞与酿酒葡萄按质量比1∶3 混合，加入果胶酶0.50 g∕L，18 ℃下冷浸渍7 d，添加FX-10 酵母菌0.25 g∕L 至混合汁中，用柠檬酸调整pH 值分别为3.5、3.9、4.3，22 ℃下发酵7～10 d，至残糖含量<5 g∕L，酒精发酵结束。
1.3.3 正交试验设计优化发酵工艺
以黑果枸杞与酿酒葡萄质量比、果胶酶添加量、酿酒酵母添加量为考察因素，以酒精发酵后期酰化花色苷[矮牵牛素-3-O-芸香糖（反式-p-香豆酰基）-5-O-葡萄糖苷]含量为考察指标，采用正交试验设计优化共发酵果酒工艺，因素与水平如表4 所示。制备9 组共发酵果酒样品，分别编号为1#～9#。
表4 正交试验设计因素与水平
Table 4 Orthogonal design factors and level
水平123 A 黑果枸杞与酿酒葡萄质量比1∶3 1∶4 1∶5 B 果胶酶添加量∕（g∕L）0.3 0.5 0.7 C 酿酒酵母添加量∕（g∕L）0.15 0.20 0.25
1.4 指标测定方法
1.4.1 总酚测定
总酚测定方法参考福林酚法[24]以没食子酸为标准溶液，并稍作修改。称取5.00g 样品于250 mL 三角瓶中，加入75 mL 体积分数为70% 的乙醇溶液，搅拌均匀，在恒温水浴锅中75 ℃水浴，提取50 min，提取液以3 000 r∕min 离心30 min，取上清液。重复提取步骤2 次，定容至250 mL，得到样品多酚提取液。移取1 mL 样品待测液于25 mL 容量瓶中，分别加入福林酚试剂1 mL，摇匀后再加入质量分数12% Na2CO3 溶液2 mL，用水定容至25 mL，摇匀，平行3 组，室温下避光反应2 h 后，在765 nm 波长下测定吸光度。
1.4.2 总花色苷含量的测定
总花色苷含量参考闫亚美等[25] 的pH 示差法测定，并稍作修改。吸取一定量酒体样品于100 mL 烧杯中，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调pH 值至3.0，再用pH 值为3.0 的缓冲溶液定容至100 mL 容量瓶中。取稀释后样品1 mL，加入pH 值为1.0 和4.5 的缓冲溶液9 mL，40 ℃水浴平衡20 min 后，以去离子水为空白，于510 nm 和700 nm 波长下测定吸光度。
1.4.3 色泽测定
采用CM-5 分光测色仪进行果酒色泽特征分析[26]，测定时使用液体反射模式，以白色校正瓷砖为背景，测量果酒液体亮度（L*值）、红度（a*值）、黄度（b*值），c 值和h 值（L 表示亮暗；±a 表示红绿；±b 表示黄蓝；c 表示色彩饱和度，c 越大则颜色的鲜艳度越高；h表示色度角），每个样品测定5 次，记录数据。
1.4.4 高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法测定花色苷组成及含量
取5 mL 酒样，用15 mL 乙醚萃取3 次（每次加入5 mL，提取30 min），取下层液体过0.22µm 滤膜，置于-80 ℃备用。
色谱条件：色谱柱ZORBAX XB-Aq 914（4.6 mm×250 mm，5µm）；流动相A：1% 甲酸+0.1% 三氯乙酸（trichloroacetic acid，TFA）溶液；流动相B：15%甲醇乙腈溶液；梯度洗脱，洗脱程序：0 min，90% A，10% B；20 min，70%A，30%B；35 min，50%A，50%B；45 min，90%A，10% B；55 min，90% A，10% B；流速0.8 mL∕min；检测波长530 nm；柱温30 ℃；进样体积20µL。
花色苷标准曲线的绘制：称取标准品矮牵牛素-3-O-芸香糖（反式-p-香豆酰基）-5-O-葡萄糖苷5 mg，用1% 甲酸定容于50 mL 容量瓶，配制成100 mg∕L 标准液，分别配制成5、10、50、100、200、500 mg∕L 不同浓度标准品溶液进样，以质量浓度为横坐标（mg∕L），峰面积为纵坐标，进行线性回归得到标准曲线y=29.4x-99.55，R²=0.991 5；各标准品曲线在5～500 mg∕L 范围内线性关系良好。样品进样后将峰面积代入标准曲线，计算并得到酰化花色苷矮牵牛素-3-O-芸香糖（反式-p-香豆酰基）-5-O-葡萄糖苷含量。
1.5 统计分析
数据统计分析采用SPSS 21.0 对数据进行单因素方差统计分析，结果以平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 不同原料配比对果酒酿制过程酚类物质的影响
为保证发酵的正常进行，并确保果酒具有良好的香气结构，黑果枸杞与酿酒葡萄的混合汁需满足：总糖≥24%，pH3.5～4.5，通过预试验，确定了黑果枸杞与酿酒葡萄的添加比例范围>1∶2.6（质量比），即酿酒葡萄最低添加量≥72%。因此，设置黑果枸杞与酿酒葡萄的复配比例为1∶3（质量比），同时以单一酿酒葡萄、单一黑果枸杞发酵果酒为对照，探究酿酒葡萄添加量对果酒总酚、总花色苷含量及色泽的影响，结果如图1、图2 所示。
图1 不同原料配比酿造黑果枸杞果酒多酚含量变化
Fig.1 Changes of polyphenol content in Lycium ruthenicum Murr.fruit wine brewed with different addition mass ratios of raw materials
图2 不同原料配比酿造黑果枸杞果酒花色苷含量变化
Fig.2 Changes of anthocyanin content in Lycium ruthenicum Murr.fruit wine brewed with different addition mass ratios of raw materials
由图1、图2 可知，3 组样品在整个酿造时期多酚含量变化趋势一致，在酒精发酵期达到最高值，且LRM 组中多酚含量远高于WG 组。LRM 组果酒花色苷含量始终高于WG 组和LRM-WG 组，这和黑果枸杞原料中花色苷含量有关，但LRM 组果酒花色苷降解速率最大，WG 组和LRM-WG 组相对较为平稳。单一LRM 发酵，冷浸渍时期花色苷含量为1 520.76 mg∕L，在酒精发酵时期达到最高值1 963.20 mg∕L，但在二次发酵后花色苷含量迅速锐减，至陈酿两个月时花色苷含量仅为242.49 mg∕L，这与Wang 等[27]的研究规律一致；单一酿酒葡萄酿造果酒，花色苷含量随着酿造时间延长而不断降低，但降低速率较慢，陈酿2 个月时花色苷含量为35.26 mg∕L，LRM-WG 组花色苷含量在陈酿2 个月时花色苷含量为173.38 mg∕L，说明单一LRM 发酵不易于酒体花色苷的保存，黑果枸杞与酿酒葡萄复配抑制了花色苷降解损失。
2.1.2 不同原料配比果酒酿制过程中色泽变化
不同原料配比果酒酿制过程中色泽变化见表5。
表5 不同原料配比酿造黑果枸杞果酒色泽
Table 5 Color of Lycium ruthenicum Murr.fruit wine brewed with different addition mass ratios of raw materials
注：同行不同字母表示差异显著（p<0.05）。
色泽L*值a*值b*值组别CS AF MLF CF-30 d Ageing-1M Ageing-2M CS AF MLF CF-30 d Ageing-1M Ageing-2M CS AF MLF CF-30 d Ageing-1M Ageing-2M LRM-WG 31.04±0.02b 48.10±0.04b 51.29±0.19b 52.96±0.13b 58.74±0.19b 59.22±0.13b 55.17±0.01a 47.65±0.04a 44.40±0.14a 40.76±0.11a 35.23±0.14b 32.56±0.05b-7.03±0.03c-2.69±0.03c 10.66±0.16b 16.51±0.13a 24.14±0.13a 25.72±0.15b WG 68.93±0.04a 79.52±0.02a 78.60±0.01a 74.37±0.00a 74.82±0.11a 75.45±0.05a 36.89±0.04b 22.52±0.02b 24.56±0.01b 26.39±0.01b 24.82±0.10c 23.98±0.05c 7.05±0.01a 8.40±0.03a 11.46±0.00a 10.23±0.01b 9.28±0.02c 9.92±0.06c LRM 0.82±0.04c 6.35±0.06c 1.11±0.04c 1.91±0.04c 16.68±0.14c 33.69±0.15c 1.43±0.02c 8.03±0.09c 5.64±0.07c 11.46±0.0.18c 40.53±0.13a 42.16±0.10a-0.03±0.02b-0.51±0.05b 1.05±0.03c 2.07±0.03c 21.40±0.27b 49.15±0.05a
由表5 可知，同一时期不同原料组果酒样品色泽值存在显著差异。LRM-WG 组果酒L*值和b*值呈现逐渐增长的趋势；LRM-WG、WG 和LRM 3 组果酒在不同时期测定的L*值差异不显著（p>0.05）。
2.1.3 不同类型酵母菌对果酒酿制过程酚类物质的影响
通过添加不同类型酵母菌酿造了4 组果酒，不同时期酒体样品中多酚、花色苷含量如图3、图4 所示。
图3 不同酿酒酵母菌酿造黑果枸杞果酒多酚含量变化
Fig.3 Changes of polyphenol content in Lycium ruthenicum Murr.fruit wine brewed with different Saccharomyces cerevisiae
图4 不同酿酒酵母菌酿造黑果枸杞果酒花色苷含量变化
Fig.4 Changes of anthocyanin content in Lycium ruthenicum Murr.fruit wine brewed with different Saccharomyces cerevisiae
由图3、图4 可知，不同样品组多酚含量变化趋势一致，且含量较为接近，说明FX-10、AC、RX-60 酵母菌及3 种酵母菌混合发酵对酿造时期多酚的影响作用较小。不同样品组花色苷含量变化趋势一致，但与多酚变化趋势不同，在酒精发酵期结束后花色苷含量一直呈下降趋势，混合酵母菌Yeast-4 组在陈酿期花色苷含量较其他组低。这也与李双石等[28]研究发现的结果基本一致。
2.1.4 不同酿酒酵母酿制果酒过程色泽的变化
不同酿酒酵母酿制果酒过程色泽的变化见表6。
表6 不同酿酒酵母酿造黑果枸杞果酒色泽
Table 6 Color of Lycium ruthenicum Murr.fruit wine brewed with different Saccharomyces cerevisiae
色泽L*值a*值组别CS AF MLF CF-30 d Ageing-1M Ageing-2M CS AF MLF CF-30 d Ageing-1M Ageing-2M Yeast-1 42.32±0.23a 48.98±0.13b 49.49±0.0.31c 50.44±0.20c 55.93±0.04c 58.18±0.12d 39.97±0.29d 46.17±0.10c 45.37±0.23a 42.64±0.16a 37.98±0.05a 36.91±0.06a Yeast-2 35.83±0.01b 52.99±0.04a 50.30±0.34b 49.00±0.15d 57.69±0.34b 61.51±0.30b 42.26±0.01c 42.76±0.04d 42.68±0.23c 40.69±0.09b 34.99±0.23b 32.99±0.23b Yeast-3 31.04±0.02d 48.10±0.04c 51.29±0.19a 52.96±0.13b 58.74±0.19a 59.22±0.13c 55.17±0.01a 47.65±0.04a 44.40±0.14b 40.76±0.11b 35.23±0.14b 32.56±0.05c Yeast-4 32.32±0.11c 46.67±0.07d 51.62±0.13a 54.59±0.12a 58.50±0.41a 62.57±0.01a 53.92±0.06b 47.29±0.06b 41.91±0.09d 37.70±0.09c 34.39±0.27c 31.84±0.04d
续表6 不同酿酒酵母酿造黑果枸杞果酒色泽
Continue table 6 Color of Lycium ruthenicum Murr.fruit wine brewed with different Saccharomyces cerevisiae
注：同行不同字母表示差异显著（p<0.05）。
色泽b*值组别CS AF MLF CF-30 d Ageing-1M Ageing-2M Yeast-1-5.11±0.01a-2.31±0.11c 5.82±0.26c 11.13±0.17c 22.07±0.13c 23.27±0.23c Yeast-2-7.34±0.01d 0.81±0.11a 5.79±0.28c 14.90±0.12b 22.12±0.13c 23.35±0.38c Yeast-3-7.03±0.03b-2.69±0.03d 10.66±0.16a 16.51±0.13a 24.14±0.13b 25.72±0.15b Yeast-4-7.17±0.08c 0.31±0.07b 9.52±0.13b 16.58±0.10a 24.74±0.30a 28.96±0.20a
由表6 可知，Yeast-1 组果酒在不同时期L*值和b*值呈现逐渐增长的趋势；Yeast-2 组果酒在不同时期b*值呈现逐渐增长的趋势，Yeast-3 和Yeast-4 组果酒在不同时期的L*值和b*值呈现不断增长的趋势，而a*值呈现不断下降的趋势。
2.1.5 不同pH 值对果酒酿制过程酚类物质的影响
不同pH 值对果酒酿制过程酚类物质的影响见图5、图6。
图5 不同pH 值条件酿造黑果枸杞果酒多酚含量变化
Fig.5 Changes of polyphenol content in Lycium ruthenicum Murr.fruit wine brewed under different pH conditions
图6 不同pH 值条件酿造黑果枸杞果酒花色苷含量变化
Fig.6 Changes of anthocyanin content in Lycium ruthenicum Murr.fruit wine brewed under different pH conditions
如图5 所示，不同pH 值条件下发酵并酿造果酒，其多酚含量变化趋势都一致，但在澄清期后，pH4.3 组多酚含量低于其他两组；如图6 所示，不同pH 值条件下花色苷含量变化差异较大，pH4.3 组花色苷含量从冷浸渍时期之后持续降低，并始终低于其他两组，结果说明在pH 值在3.5～4.3 范围对酿造果酒中多酚含量的影响较小，但对花色苷含量的保存影响较大，应控制物料pH 值小于4.0 进行果酒酿造，有助于果酒多酚、花色苷的保存。
2.1.6 不同pH 值条件酿制果酒色泽变化
不同pH 值条件酿制果酒色泽变化见表7。
表7 不同pH 值条件酿造黑果枸杞果酒色泽
Table 7 Color of Lycium ruthenicum Murr.fruit wine brewing under different pH conditions
注：同行不同字母表示差异显著（p<0.05）。
pH4.3 38.72±0.11a 56.90±0.09a 61.44±0.05a 63.11±0.01a 67.88±0.13a 70.24±0.24a 47.08±0.06c 37.62±0.09c 32.07±0.03c 29.39±0.01c 26.02±0.15c 24.83±0.20c-6.49±0.08b 2.64±0.08b 25.83±0.10a 36.23±0.02a 43.79±0.02a 44.87±0.26a色泽L*值a*值b*值组别CS AF MLF CF-30 d Ageing-1M Ageing-2M CS AF MLF CF-30 d Ageing-1M Ageing-2M CS AF MLF CF-30 d Ageing-1M Ageing-2M pH3.5 18.45±0.02c 34.31±0.06c 39.75±0.10c 43.34±0.06c 49.91±0.08c 55.99±0.13c 48.06±0.01b 59.67±0.01a 59.17±0.03a 54.97±0.01a 48.38±0.07a 41.64±0.14a-4.14±0.02a 5.34±0.01a 7.76±0.04c 14.06±0.06c 18.34±0.10c 24.08±0.14c pH3.9 31.04±0.02b 48.10±0.04b 51.29±0.19b 52.96±0.13b 58.74±0.19b 59.22±0.13b 55.17±0.01a 47.65±0.04b 44.40±0.14b 40.76±0.11b 35.23±0.14b 32.56±0.05b-7.03±0.03c-2.69±0.03c 10.66±0.16b 16.51±0.13b 24.14±013b 25.72±0.15b
由表7 可知，同一时期不同pH 值条件下果酒样品色泽值存在显著差异。pH3.5 组果酒在不同时期L*值和b*值呈现逐渐增长的趋势；pH3.9 和pH4.3 组果酒在不同时期L*值和b*值呈现不断增长的趋势，而a*值呈现不断下降的趋势；pH3.9 和pH4.3 这两组果酒在不同时期测定的L*值差异不显著，pH4.3 组果酒在不同时期测定的a*值也差异不显著（p>0.05）。研究表明，酰化的花色苷在微酸性的水溶液中有较强的维持花色苷颜色稳定的能力[29]，与天然花色苷相比，其稳定性更高[30]。
2.2 主成分分析
2.2.1 酿酒葡萄添加量对黑果枸杞果酒品质的影响
采用单一黑果枸杞（LRM）发酵、单一酿酒葡萄（WG）发酵、黑果枸杞与酿酒葡萄（1∶3，质量比，LRMWG）混合后共发酵酿造果酒，对不同时期的样品进行多酚、花色苷含量及色泽特征值进行跟踪测定，并对数据进行多元数据回归分析，结果如图7、表8 所示。
图7 酿酒葡萄添加量对黑果枸杞果酒品质的影响
Fig.7 Effect of wine grape addition on quality of Lycium ruthenicum Murr.fruit wine
表8 酿酒葡萄添加量对黑果枸杞果酒品质的影响主成分分析特征值与贡献率
Table 8 Effect of wine grape addition on quality of Lycium ruthenicum Murr.fruit wine by eigenvalues and contribution rate of principal component analysis
主成分12345特征值3.385 22 0.900 42 0.622 02 0.062 79 0.029 55贡献率∕%67.704 30 18.008 35 12.440 45 1.255 83 0.591 06累积贡献率∕%67.704 30 85.712 66 98.153 11 99.408 94 100.000 00
由图7 可知，在第一主成分和第二主成分的得分图上，LRM 组、WG 组、LRM-WG 3 组样品可以明显区分，WG 组和LRM-WG 组分布于PC1 轴右侧，LRM 组分布于PC1 轴左侧，说明LRM 组与WG 组、LRM-WG 组样品信息差异较大。主成分载荷图上，色泽特征值L*值、a*值、b*值3 个指标位于PC1 轴右侧，花色苷、多酚含量指标位于PC1 轴左侧，且花色苷、多酚和L*值在PC1 上的载荷较大，表明通过改变酿酒葡萄的添加量形成不同原料配比，对酿造的黑果枸杞果酒花色苷、多酚和L*值影响较大。
如表8 所示，PC1 能够解释67.7%样品信息，PC2能够解释18.0%样品信息，PC1 与PC2 累积贡献率达到85.7%，这两个相互独立的变量可反映出不同原料配比或是组成酿造出的果酒绝大部分信息。
2.2.2 不同类型酵母菌对黑果枸杞果酒品质的影响
不同类型酵母菌对黑果枸杞果酒品质的影响，如图8、表9 所示。
图8 不同类型酵母菌对黑果枸杞果酒品质的影响
Fig.8 Effects of different types of yeast on the quality of Lycium ruthenicum Murr.fruit wine
表9 不同类型酵母菌对黑果枸杞果酒品质的影响主成分分析特征值与贡献率
Table 9 Effects of different types of yeast on the quality of Lycium ruthenicum Murr.fruit wine by eigenvalues and contribution rate of principal component analysis
主成分12345特征值3.383 90 1.275 82 0.219 65 0.094 96 0.025 67贡献率∕%67.677 91 25.516 38 4.393 09 1.899 16 0.513 47累积贡献率∕%67.677 91 93.194 29 97.587 37 99.486 53 100.000 00
如图8 所示，4 组样品能够较好分开，且色泽指标的载荷大于多酚、花色苷指标，表明酿酒酵母菌对酿造黑果枸杞果酒多酚、花色苷影响较小。如表9 所示，第一主成分为67.7%，第二主成分为25.5%，累积贡献率为93.2%，表明提取两个主成分可涵盖4 组样品93.2%的信息。
2.2.3 不同pH 值对黑果枸杞果酒品质的影响
不同pH 值对黑果枸杞果酒品质的影响见图9、表10。
图9 不同pH 值对黑果枸杞果酒品质的影响
Fig.9 Effects of different pH values on the quality of Lycium ruthenicum Murr.fruit wine
表10 不同pH 值对黑果枸杞果酒品质的影响主成分分析特征值与贡献率
Table 10 Effects of different pH values on the quality of Lycium ruthenicum Murr.fruit wine by eigenvalues and contribution rate of principal component analysis
主成分12345特征值3.655 86 0.824 70 0.373 53 0.117 45 0.028 46贡献率∕%73.117 24 16.493 93 7.470 67 2.349 01 0.569 15累积贡献率∕%73.117 24 89.611 17 97.081 84 99.430 85 100.000 00
如图9 所示，通过主成分分析，不同pH 值条件下酿造的果酒样品被较好地分开，且花色苷、色泽（L*值、a*值、b*值）指标的载荷大于多酚指标，表明pH 值对黑果枸杞果酒花色苷和色泽影响较大。第一主成分为73.1%，第二主成分为16.5%，累积贡献率为89.6%，表明提取两个主成分可涵盖全部样品89.6%的信息。
2.3 正交试验结果分析
采用HPLC 检测技术测定9 组果酒样品中酰化花色苷[矮牵牛素-3-O-芸香糖（反式-p-香豆酰基）-5-O-葡萄糖苷]的含量，试验结果如表11 所示。
表11 正交试验结果分析
Table 11 Analysis of orthogonal test results
水平123456789K1 Y 酰化花色苷[矮牵牛素-3-O-芸香糖（反式-p-香豆酰基）-5-O-葡萄糖苷]含量∕（mg∕L）305.29 287.91 358.93 373.73 414.19 413.62 320.79 324.04 347.01 K2 K3R A 黑果枸杞与葡萄质量比1∶3 1∶3 1∶3 1∶4 1∶4 1∶4 1∶5 1∶5 1∶5 317.38 400.51 339.61 83.13 B 果胶酶添加量∕（g∕L）0.30 0.50 0.70 0.30 0.50 0.70 0.30 0.50 0.70 333.27 342.05 373.19 39.92 C 酿酒酵母添加量∕（g∕L）0.15 0.20 0.25 0.20 0.25 0.15 0.25 0.15 0.20 347.65 336.22 364.64 28.42
由表11 可知，黑果枸杞与酿酒葡萄的添加比例因素的极差最大，说明原料组成对发酵后酰化花色苷[矮牵牛素-3-O-芸香糖（反式-p-香豆酰基）-5-O-葡萄糖苷]含量的影响程度最大，其次是果胶酶添加量及酿酒酵母添加量，最佳参数组合为A2B3C3，即黑果枸杞与酿酒葡萄质量比为1∶4、果胶酶添加量0.70 g∕L、酿酒酵母添加量0.25 g∕L，在此条件下进行酵母菌发酵，发酵结束后果酒样品中酰化花色苷[矮牵牛素-3-O-芸香糖（反式-p-香豆酰基）-5-O-葡萄糖苷]含量为（459.51±3.66）mg∕L。
3 结论
通过单因素试验，得到黑果枸杞与酿酒葡萄质量比及发酵pH 值对果酒花色苷含量和色泽影响程度较大；酿酒葡萄经复配后，减少了果酒中花色苷损失，提高了黑果枸杞果酒中花色苷的稳定性，但对多酚含量影响作用较小；发酵前应调整物料pH 值小于4.0 再进行果酒酿造，有助于果酒多酚、花色苷的保存；酵母菌类型对黑果枸杞果酒多酚、花色苷和色泽影响均较小。正交优化试验结果表明，原料组成对发酵后酰化花色苷[矮牵牛素-3-O-芸香糖（反式-p-香豆酰基）-5-O-葡萄糖苷]含量的影响程度最大，其次是果胶酶添加量及酿酒酵母添加量。试验得到最佳发酵工艺条件：黑果枸杞与酿酒葡萄质量比为1∶4、果胶酶添加量为0.70 g∕L、酿酒酵母添加量为0.25 g∕L，酒精发酵后酰化花色苷[矮牵牛素-3-O-芸香糖（反式-p-香豆酰基）-5-O-葡萄糖苷]含量可达（459.51±3.66）mg∕L。此研究旨为推动黑果枸杞花色苷类活性成分的利用及精深加工产品研发提供理论依据。
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