共轭亚油酸（conjugated linoleic acid，CLA）是亚油酸（linoleic acid，LA）的衍生物，是共轭双键在多种位置与空间异构体的统称[1]。在CLA的20多种异构体中，具有生理活性的异构体主要有顺9，反11-共轭亚油酸（cis9，trans11-CLA，c9，t11-CLA）、反 10，顺 12-共轭亚油酸（trans10，cis12-CLA，t10，c12-CLA）和反9，反11-共轭亚油酸（trans9，trans11-CLA，t9，t11-CLA）等[2]。
CLA具有抑癌的功能被研究证实后[3]，吸引了众多学者对CLA生理功能的探索。CLA在多方面为人类的健康生活做出积极贡献，如通过调节细胞凋亡相关基因的mRNA和蛋白水平、调节与细胞生长繁殖相关的细胞信号通路和转录因子等方式实现抑制癌细胞发生、增殖、扩散及促进癌细胞凋亡，从而抗肿瘤（乳腺癌、胃腺癌、前列腺癌和恶性黑素瘤细胞等）[4-7]；通过调控抗氧化系统的一些关键酶和辅助因子，从而抑制活性氧形成和清除自由基，实现抗氧化功能[8-10]；通过抑制单核/巨噬/泡沫细胞迁移、抑制血小板积累和释放相关蛋白质，从而改善心血管疾病[11-14]；通过抑制脂肪细胞的分化，促进脂肪增加能量消耗、细胞凋亡、脂肪酸氧化和脂质分解，从而调节机体脂肪的组成并减少机体脂肪含量[15-17]；调节机体免疫、控制类风湿关节炎和改善骨骼形成等生理功能[18-20]。
随着CLA的生理功能被发掘，天然来源的CLA含量难以满足人们的需求。为实现CLA产量自由，3种主要方法被广泛应用于合成CLA。1）化学合成：以相应的不饱和脂肪酸为底物，通过碱催化异构化、光催化异构化、蓖麻油酸脱水异构、油酸烯丙醇脱水和过渡金属催化异构等化学异构法合成CLA[21-25]；2）微生物发酵合成：瘤胃细菌、乳酸菌、丙酸菌及梭状芽孢杆菌等微生物在发酵过程中通过体内的酶代谢相应的不饱和脂肪酸从而合成CLA，主要转化产物为c9，t11-CLA、t9，t11-CLA 和 t10，c12-CLA[26-30]；3）酶法体外合成：微生物合成CLA的实质是微生物体内的一些酶在发挥催化作用，将合成CLA途径中的关键酶分离纯化，或利用分子生物学和蛋白工程技术高效获得重组关键酶，以相应的不饱和脂肪酸为底物，可在体外高效转化合成CLA[31-36]。化学法合成CLA，具有成本低、产率高的优势，是工业生产CLA中应用最广泛的方法，但是存在产物异构体复杂、分离提纯困难、副产物残留等食用安全隐患，微生物发酵合成的CLA食用安全性更高，但瘤胃细菌、丙酸菌及梭状芽孢杆菌等微生物自身需要严格的厌氧生长条件，因此限制了其高效制备CLA。酶法体外合成的CLA，反应体系较为单一，仅为酶、底物和低浓度盐离子缓冲液，反应条件温和可控、产物单一、效率高且安全性高，但酶制剂制备成本较高，且该法目前仍处于实验室研究阶段。为解决酶制剂制备昂贵、存储条件严苛等限制问题，本文对酶法合成CLA途径以及合成途径中关键酶的研究现状进行综述，以期为利用生物法高效合成食用安全性更高的CLA提供参考。
1 酶法合成CLA途径
不同微生物体内合成CLA的关键酶不同，其合成的CLA异构体也有所差异，目前酶法合成CLA的主要途径有5种，具体如图1所示。
图1 酶法合成CLA途径
Fig.1 The pathway of enzymatic synthesis of CLA
亚油酸异构酶可以将LA转化为c9，t11-CLA，如来源于瘤胃细菌溶纤维丁酸弧菌的c12，t11-LA异构酶[37]的转化；亚油酸异构酶也可以将LA转化为t10，c12-CLA，如来源于丙酸杆菌的亚油酸异构酶[38]；由共轭亚油酸水合酶（EC 4.2.1.53）、羟基脂肪酸脱氢酶（EC 1.1.1.1.98）和共轭亚油酸乙酰乙酸脱羧酶（EC 4.1.1.4）共同组成的亚油酸异构酶系，经水合、脱氢、双键移位、氧化和脱水反应多步反应，将LA转化为c9，t11-CLA、t10，c12-CLA 和t9，t11-CLA，如植物乳杆菌AKU1009a和植物乳杆菌p-8的亚油酸异构酶系[33，36]；同样由共轭亚油酸水合酶、羟基脂肪酸脱氢酶和共轭亚油酸乙酰乙酸脱羧酶共同催化LA，但产物为不同异构体，c9，t11-CLA和t9，t11-CLA，如植物乳杆菌ZS2058亚油酸异构酶系[34]；由共轭亚油酸水合酶和α-烯醇化酶（EC4.2.1.11）催化脱水和异构两步反应将LA转化为c9，t11-CLA，如植物乳杆菌ATCC8014亚油酸异构酶系[35，39]。
2 酶法合成CLA途径中关键酶的研究现状
2.1 亚油酸异构酶
亚油酸异构酶最早于瘤胃细菌溶纤维丁酸弧菌中被发现，该酶可以将C9和C12位上均有双键且带有游离羧基的脂肪酸转化为相应的双键位置有变的脂肪酸，即可将LA转化为c9，t11-CLA[40-41]。Kelper等[37]推测该酶与底物互作的机制，底物与酶分子的活性中心结合是通过LA分子中双键的π电子与酶活性中心的亲电氨基酸相互作用，以及LA未解离的羧基与活性中心带负电氨基酸形成氢键，从而形成酶-底物复合物。此外，也有研究认为该酶催化底物发生水合和脱水反应生成的产物为羟基脂肪酸，并非发生双键异构反应，即C13从水中获得氢从而生成C12为羟基的脂肪酸，但目前尚未在溶纤维丁酸弧菌的转化产物中发现羟基脂肪酸。该酶是膜蛋白，难以分离纯化，因此限制了对其催化机制以及结构和功能的进一步研究[34]。
Liavonchanka等[38]研究发现，痤疮丙酸杆菌的亚油酸异构酶（Propionibacterium acnes linoleate isomerase，PAI，PDB ID：2BAB）可将 LA 异构为 t10，c12-CLA，利用大肠杆菌BL21（DE3）工程菌株进行大量表达，并成功获得了PAI、PAI与底物和产物的共结晶复合物三维结构，发现PAI共有424个氨基酸，其分子量约为46 kDa，是一个单体酶，也是首个获得晶体结构的脂肪酸异构酶，三维结构中包含有3个紧密连接的结构域，一个结构域与辅酶分子——黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin denine dinucleotide，FAD）结合，其余两个结构域则与底物特异性结合有关。将聚乙二醇400（polyethylene glycol 400，PEG 400）作为与酶分子结合的模拟物，通过PAI-PEG400复合物三维结构的分析，确定底物通往酶分子活性中心的路径，底物通道入口处带有正电荷的氨基酸残基（Lys 85、Arg 87、Lys 102 和 Arg 195）是与底物分子相互作用的初始识别位点，负责与带负电荷的羧酸酯基团相互作用，位于通道口处的Arg 88和Phe 193在底物分子的诱导作用下其侧链构象发生变化，使底物通道的入口从闭合状态转变为打开状态，这种特殊的开合机制可能与底物的特异性以及产物的结构特异性有关。在反应过程中辅酶FAD至关重要，首先从底物的C11位上给出一个氢到FAD的N5原子，得到C11位有正离子的亚油酸中间产物，随后C9位的双键移位，最后C11位加氢同时完成氧化形式的FAD再生，如图2所示[38]。PAI是胞内可溶蛋白，目前已经在多种基因工程系统中成功异源表达[42-43]。
图2 PAI催化机制
Fig.2 PAI catalytic mechanism
2.2 亚油酸水合酶
除上述依赖亚油酸异构酶直接异构LA为CLA的途径以外，也可以通过由多个酶组成的亚油酸异构酶系转化CLA，首先经共轭亚油酸水合酶催化不饱和脂肪酸发生水合反应，形成相应的羟基不饱和脂肪酸产物。共轭亚油酸水合酶属于肌球蛋白交叉反应抗原（myosin cross reactive antigen，MCRA） 蛋白超家族，是一个在细菌中广泛存在的保守蛋白家族，该家族成员的基因序列一致性较低，但FAD结合序列保守[39，44-45]。MCRA蛋白首次发现于化脓链球菌中[46]，是具有FAD结合位点的脂肪酸水合酶，可以将在C9和C11位上含有双键的十六碳和十八碳脂肪酸分别转化为相应的10-羟基脂肪酸或10，13-二羟基脂肪酸[47]。
来源于嗜酸乳杆菌NCFM的共轭亚油酸水合酶（Lactobacillus acidophilus hydratase，LAH，PDB ID：4IA5）有591个氨基酸，分子量约为67 kDa，同源二聚体结构，每个单体包含4个结构域，有一个典型的FAD结合结构域。LAH在FAD的协助下，可以将LA转化为10-羟基脂肪酸和10，13-二羟基十八碳脂肪酸，但是FAD在催化过程中只用于维持LAH结构，并未发生氧化还原反应。LAH的C端所形成的第4个结构域与底物的结合相关，具有构象灵活性和重折叠能力，当脂肪酶与其底物接触时，第4个结构域表面上许多带正电荷的残基识别带负电荷的底物羧酸酯基团，从而改变脂肪酶的构象，暴露蛋白质表面的疏水结合口袋，使其呈“打开”状态。目前暂未获得FAD、游离脂肪酸与LAH的晶体结构，因此无法彻底阐明其催化LA的具体机理[48]。
来源于脑膜脓毒性菌的油酸水合酶（Elizabethkingia meningoseptica oleate hydratase，OhyA，PDB：4UIR）也具有脂肪酸水合酶活性，在FAD的参与下可以将油酸转化为C10-羟基硬脂酸[49]。OhyA有645个氨基酸，分子量约为73 kDa，是一个同型二聚体结构。OhyA也是依赖FAD行使催化功能的酶，分析其三维结构，在FAD附近有一个狭长的呈V形的疏水空腔，通道的一端存在呈亲水性的残基Gln 265、Thr 436、Asn 438和His 442，在V形空腔的弯曲处，有3个极性残基Glu 122、Tyr 241和Tyr 456，并且靠近FAD的异咯嗪环[49]。在OhyA催化油酸的过程中，酶分子的Tyr 241首先将油酸的双键质子化，进一步Glu 122激活水分子攻击带电双键，形成10-羟基硬脂酸。辅酶FAD在OhyA催化反应的过程中不会发生氧化还原反应，起到维持活性中心的疏水腔结构和稳定活性中心正电荷的作用。从细胞中提取OhyA到体外后，酶分子上的还原态FAD在有氧情况下会立即发生氧化，显著降低了酶活性，若在反应中补加还原态FAD则可有效提高酶的活力。虽未报道OhyA可以催化LA，但该酶属于MACR蛋白超家族，上述对其三维结构与功能的关系研究，为其转化LA为CLA的研究奠定了基础。
来源于海洋细菌红串红球菌的油酸水合酶（Rhodococcus erythropolis oleate hydratase，OhyRe，PDB：5ODO）可以将带有双键的不饱和脂肪酸转化为相应的羟基脂肪酸[50]。OhyRe有559个氨基酸，分子量约为66 kDa，是一个单体结构，包含4个结构域，其中第4个结构域与LAH和OhyA均有差异。将在其他家族成员中保守的残基Met 77和Val 393突变后，导致其水合活性显著降低，表明OhyRe可能与上述MCRA家族成员的催化机制有所不同。同样，FAD对OhyRe行使催化功能至关重要，二者通过非共价形式结合，且在纯化过程中会因FAD丢失而失活，在反应前若将FAD与纯化酶孵育后，其活性则可恢复。此外，OhyRe的底物谱较宽，可以将棕榈酸、油酸、亚油酸、α-亚油酸和γ-亚油酸转化为相应的羟基脂肪酸，其中转化油酸为10-羟基硬脂酸的能力最强，催化LA的能力相对较弱。由于暂未获得OhyRe与底物的共结晶晶体结构，其具体催化机制仍需要进一步探索。
从植物乳杆菌ATCC8014中成功分离得到具有生物活性的亚油酸水合酶（Lactobacillus plantarum hydratase，LPH），可将LA转化为10-羟基-顺-12-十八碳烯酸，利用同源建模技术以LAH的晶体结构为模板，获得了LPH的空间结构，进一步通过分子对接技术，分析了LPH与LA结合、LPH与LA、FAD共结合的相关氨基酸残基[39]。该酶有549个氨基酸，分子量约为64 kDa，有3个结构域，比LAH少了第4个起到底物通道开关的结构域。经分子对接后，LPH与LA有两个相互作用的位点，在第3个结构域有一个可与底物结合的位点，在3个结构域连接处有一个大的疏水空腔为第二个位点，是LPH的活性中心，与LA结合催化有关。LAH在第3个结构域与底物互作的氨基酸残基有8 个，为 Pro 156、Ile 153、Met 154、Met 206、Leu 149、Ile 211、Phe 213和Leu 560。在3个结构域连接处与底物互作的氨基酸残基有12个，为His404、His408、Gly79、Ile 389、Ary 80、Met 81、Thr 190、Phe 191、Met 209、Tyr 87、Val 402和Trp 420。与FAD互作的氨基酸有20个，为 Val 322、Leu 326、Phe 296、Met 45、Ser 323、Ile 14、Gly 15、Tyr 41、Thy 297、Gly 17、Gly 512、Ala 525、Phe 523、Trp 352、Gly 79、Gly 78、Ile 301、Ala 53、Gly 52 和Val 43。其中 Asn 49、Ser 230、Ary 80、Thr 524、Glu 513、Leu 18、Ser 19和Met 81能与FAD形成氢键，Met 81和Met 154两个氨基酸在LAH与底物结合的过程中起关键作用。
植物乳杆菌因其自身的益生特性，其亚油酸水合酶（CLA hydratase，CLA-HY）也被广泛研究，来源于植物乳杆菌AKU1009a、植物乳杆菌p-8和植物乳杆菌ZS2058的CLA-HY均在大肠杆菌工程菌中成功异源表达，并在FAD的存在下可将LA转化为10-羟基-顺-12-十八碳烯酸。CLA-HY有564个氨基酸，分子量约为64 kDa，植物乳杆菌p-8来源的CLA-HY以序列一致性为54.83%的OhyRe晶体结构为模板，利用同源建模技术获得CLA-HY的空间结构模型，CLA-HY包含3个结构域，包含与FAD的结合相关的典型Rossman折叠结构。分子对接结果表明，CLA-HY有一个由Gly 12、Leu 13、Ser 14、Asp 39、Met 40、Arg 72、Gly 74、Arg 75、Phe 225、Thr 292、Ser 295、Ile 296、Thr 297、Leu 483、Glu 508、Phe 518、Thr 519、Glu 520 和 Ala 523，19 个氨基酸残基组成的与LA结合催化相关的活性中心，其中Phe 518和Gly 74与LA形成2个氢键，Met 40和Phe 225与LA的羧基通过疏水作用相互作用，有9个氨基酸与LA的结合有关，分别是Met 204、Gly 74、Arg 75、Met 76、Thr 185、Phe 186、His 399、His 403 和 Trp 415，其中Gly 74和Met 76也与辅酶FAD的结合有关，Tyr 82、Arg 75和Thr 185与CLA-HY的催化有关[51]。
2.3 羟基脂肪酸脱氢酶
植物乳杆菌AKU1009a、植物乳杆菌p-8和植物乳杆菌ZS2058的羟基脂肪酸脱氢酶（CLA Hydroxy fatty acid dehydrogenase，CLA-DH）是3个菌株转化CLA的亚油酸异构酶系中第二个关键酶，以转化途径中的产物10-羟基-顺-12-十八碳烯酸和10-氧代-反-11-十八碳烯酸为底物，分别在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化态（nicotinamide adenine dinucleotide oxidation，NAD＋）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原态（nicotinamide adenine dinucleotide reduction，NADH）的协助下，生成10-氧代-顺-12-十八碳烯酸和10-羟基-反-11-十八碳烯酸。CLA-DH有286个氨基酸，分子量约为32 kDa，属于短链脱氢/还原酶（short-chain dehydrogenases/reductases，SDR）蛋白超家族，该家族的成员分布广泛，存在于多种生物体中，并且种类多样，在辅酶NAD+或NADH的参与下，催化酮的还原或醇的氧化反应（异丙醇、环己醇等小分子以及糖醇、脂质和长链羟基脂肪酸等大分子物质），参与生物体内各类代谢反应。SDR蛋白家族的成员多数是以多聚体的结构形式发挥生物功能，其N-端是高度保守的与辅酶结合的Rossman折叠，C-端通常是与底物结合催化相关的多变结构域，这也是该家族蛋白底物谱较宽的原因。利用大肠杆菌工程菌将来源于植物乳杆菌p-8的CLA-DH成功异源表达后，研究CLA-DH的结构与功能的关系。同源建模获得CLA-DH的三维结构，其N端是典型的Rossman折叠结构域，C端是α-螺旋结构。分子对接结果表明，CLA-DH与10-羟基-顺-12-十八碳烯酸分子对接后，有一个由26个氨基酸组成的活性中心，为Asp 39、His 201、Ile 113、Ile 93、Ala 142、Leu 195、Phe 18、Ser 143、Thr 193、Pro 188、Val 191、Phe 190、Val 229、Gly 189、Tyr 156、Lys 160、His 16、Val 141、Asn 90、Thr 198、Gly 92、Ala 91、Gly 13、Thr 12、Asp 37 和 Ile 38，其中His16、Asn90和Val191通过氢键与底物相互作用。CLA-DH和蓖麻油酸进行分子对接后，有一个由27个氨基酸残基组成的活性中心，为Ile 113、Ile 93、Ala 142、Leu 195、Phe 18、Ser 143、Thr 193、Pro 188、Val 191、Phe 190、Val 229、Gly 189、Tyr 156、Lys 160、His 16、Val 141、Asn 90、Thr 198、Gly 92、Asp 194、Ala 91、Gly 13、Thr 12、Asp 37、His 201、Ile 144和 Ile 38，其中 Gly 92和Val 191通过氢键作用力与底物相互作用。进一步结合点突变技术与酶动力学常数分析，发现来源于植物乳杆菌 p-8的CLA-DH 的 Ile 38、Asn 90、Ile 93、Thr 193 和Val 229与蓖麻油酸的结合相关，Ser 143与CLA-DH催化相关，Tyr 156与蓖麻油酸的结合和CLA-DH的催化均有关[51]。
2.4 共轭亚油酸乙酰乙酸脱羧酶
植物乳杆菌共轭亚油酸酶系中的共轭亚油酸乙酰乙酸脱羧酶（CLA acetoacetate decarboxylase，CLADC）在反应过程中催化双键异构。植物乳杆菌AKU-1009a、植物乳杆菌p-8和植物乳杆菌ZS2058来源的CLA-DC有281个氨基酸，分子量约为32 kDa，均在大肠杆菌中成功异源表达，并且检测到其具有异构不饱和脂肪酸的生物活性。但是关于CLA-DC酶学特性以及空间结构的研究较少，与底物结合和催化机制尚不明晰。
2.5 α-烯醇化酶
植物乳杆菌生物转化CLA的途径除上述在CLAHY、CLA-DH和CLA-DC的共同作用下催化LA生成CLA外，近年来还发现另一条途径，即植物乳杆菌ATCC8014的CLA-HY催化LA为10-羟基-顺-12-十八碳烯酸，进一步在α-烯醇化酶的作用下将10-羟基-顺-12-十八碳烯酸转化为c9，t11-CLA。植物乳杆菌ATCC8014中成功分离得到具有生物活性的α-烯醇化酶，共有442个氨基酸，分子量约为48 kDa。利用同源建模技术，获得了α-烯醇化酶的空间结构，该酶有3个结构域。经分子对接后，分别获得了与底物和产物结合的位点，与底物结合相关的氨基酸残基为Lys 307、Lys 310、Lys 311、Ile 425、His 426、Phe 428、Asp 432、Gly 433、Arg 436、Lys 442 和 Ile 439。与产物结合相关的氨基酸残基为 Thr 85、Asp 86、Gln 87、Arg 88、Ala 89、Leu 126、Met 128、Tyr 133、Leu 134、Phe 137、Thr 350和Val 353。酶分子中从底物到产物结合位点轨迹通道位于表面并穿过蛋白质的两个结构域，由各种疏水残基（Phe、Ile和 Leu）、离子残基（Asp、His、Lys和Arg）和极性残基（Tyr、Ser、Met、Asn 和 Gln）组成[35]。
3 展望
随着CLA功能的开发，市场对其需求量也将随之增加，目前主要的工业生产工艺是通过化学法合成CLA，但有合成产物异构体复杂、提纯难、反应废液处理成本高以及存在食用安全隐患等弊端。微生物法和酶法合成CLA是随着微生物种类的扩增及代谢产物的研究、分子生物学技术和蛋白质技术的发展，开发的合成方式，合成的CLA异构体较为单一，均具有积极生理功能，且无污染废弃物、食用较安全，但该法目前仍处于实验室研究阶段，未应用于大规模生产CLA。随着异源表达技术和蛋白纯化技术的成熟，利用重组酶法可以高产量、高纯度和高效率地合成CLA，有望尽早应用于工业化量产CLA。
虽然部分酶蛋白转化LA为CLA的途径已经阐明，但因微生物种属有别，各自体内转化LA生成CLA的酶不同，生成CLA异构体的类型和含量也均有所差异，酶法合成CLA的途径远不止上述所列，仍需进一步探索。
[1] MEI Y C,CHEN H Q,YANG B,et al.Research progress on conjugated linoleic acid bio-conversion in Bifidobacterium[J].International Journal of Food Microbiology,2022,369:109593.
[2] KELLEY N S,HUBBARD N E,ERICKSON K L.Conjugated linoleic acid isomers and cancer[J].The Journal of Nutrition,2007,137(12):2599-2607.
[3] HA Y L, GRIMM N K, PARIZA M W. Anticarcinogens from fried ground beef:Heat-altered derivatives of linoleic acid[J].Carcinogenesis,1987,8(12):1881-1887.
[4] SŁOWIKOWSKI B K,DRZEWIECKA H,MALESZA M,et al.The influence of conjugated linoleic acid on the expression of peroxisome proliferator-activated receptor-γ and selected apoptotic genes in non-small cell lung cancer[J].Molecular and Cellular Biochem-istry,2020,466(1):65-82.
[5] EL ROZ A,BARD J M,HUVELIN J M,et al.The anti-proliferative and pro-apoptotic effects of the trans9,trans11 conjugated linoleic acid isomer on MCF-7 breast cancer cells are associated with LXR activation[J].Prostaglandins,Leukotrienes and Essential Fatty Acids,2013,88(4):265-272.
[6] CHEN J.Src may be involved in the anti-cancer effect of conjugated linoleic acid.Comment on:CLA reduces breast cancer cell growth and invasion through ER and PI3K/Akt pathways[J].Chemico-biological Interactions,2010,186(2):250.
[7] DEN HARTIGH L J.Conjugated linoleic acid effects on cancer,obesity,and atherosclerosis:A review of pre-clinical and human trials with current perspectives[J].Nutrients,2019,11(2):370.
[8] BROCARDO P S,BOEHME F,PATTEN A,et al.Anxiety-and depression-like behaviors are accompanied by an increase in oxidative stress in a rat model of fetal alcohol spectrum disorders:Protective effects of voluntary physical exercise[J].Neuropharmacology,2012,62(4):1607-1618.
[9] HANSCHKE N,KANKOFER M,RUDA L,et al.The effect of conjugated linoleic acid supplements on oxidative and antioxidative status of dairy cows[J].Journal of Dairy Science,2016,99(10):8090-8102.
[10] HUANG Y S,LIN Z D,RONG H,et al.Effects of conjugated linoleic acid on growth,body composition,antioxidant status,lipid metabolism and immunity parameters of juvenile Chu’s croaker,Nibea coibor[J].Aquaculture Research,2018,49(1):546-556.
[11] MOONEY D,MCCARTHY C,BELTON O.Effects of conjugated linoleic acid isomers on monocyte,macrophage and foam cell phenotype in atherosclerosis[J].Prostaglandins&Other Lipid Mediators,2012,98(3/4):56-62.
[12] MCCLELLAND S,COX C,O’CONNOR R,et al.Conjugated linoleic acid suppresses the migratory and inflammatory phenotype of the monocyte/macrophage cell[J].Atherosclerosis,2010,211(1):96-102.
[13] BRUEN R,CURLEY S,KAJANI S,et al.Different monocyte phenotypes result in proresolving macrophages in conjugated linoleic acid-induced attenuated progression and regression of atherosclerosis[J].The FASEB Journal,2019,33(10):11006-11020.
[14] KANTER J E,GOODSPEED L,WANG S R,et al.10,12 conjugated linoleic acid-driven weight loss is protective against atherosclerosis in mice and is associated with alternative macrophage enrichment in perivascular adipose tissue[J].Nutrients,2018,10(10):1416.
[15] 李海玲,张思晨,赵志敏,等.共轭亚油酸降脂及分子机理研究进展[J].中国油脂,2022,47(1):60-67.LI Hailing,ZHANG Sichen,ZHAO Zhimin,et al.Progress in fat reduction of conjugated linoleic acid and its molecular mechanism[J].China Oils and Fats,2022,47(1):60-67.
[16] XU W T,SONG Z G,WANG W B,et al.Effects of in ovo feeding of t10,c12-conjugated linoleic acid on hepatic lipid metabolism and subcutaneous adipose tissue deposition in newly hatched broiler chicks[J].Poultry Science,2022,101(5):101797.
[17] YEGANEH A,TAYLOR C G,TWOREK L,et al.Trans-10,cis-12 conjugated linoleic acid(CLA)interferes with lipid droplet accumulation during 3T3-L1 preadipocyte differentiation[J].The International Journal of Biochemistry&Cell Biology,2016,76:39-50.
[18] 张航,张腾龙,王雨琼,等.顺9,反11-共轭亚油酸对奶牛乳腺上皮细胞炎症因子的影响[J].饲料工业,2021,42(23):9-12.ZHANG Hang,ZHANG Tenglong,WANG Yuqiong,et al.Effects of Cis 9,trans 11-conjugated linoleic acid on inflammatory factors in bovine mammary epithelial cells[J].Feed Industry,2021,42(23):9-12.
[19] 杨媚,马杰,杨泰,等.共轭亚油酸的生物学功能及其在动物生产中的应用[J].中国畜牧兽医,2019,46(11):3216-3224.YANG Mei,MA Jie,YANG Tai,et al.Biological function of conjugated linoleic acid and its application in animal production[J].China Animal Husbandry&Veterinary Medicine,2019,46(11):3216-3224.
[20] HUR S J,PARK Y.Effect of conjugated linoleic acid on bone formation and rheumatoid arthritis[J].European Journal of Pharmacology,2007,568(1/3):16-24.
[21] SALAMON R V,VARGÁNÉ-VISI,ANDRÁS C D,et al.Synthetic methods to obtain conjugated linoleic acids(CLAs)by catalysis-A review[J].Acta Alimentaria,2015,44(2):229-234.
[22] 张可,滕域晰,胡凯,等.共轭亚油酸合成原料的研究进展[J].中国粮油学报,2018,33(3):139-146.ZHANG Ke,TENG Yuxi,HU Kai,et al.Research progress of feedstock for conjugated linoleic acid[J].Journal of the Chinese Cereals and Oils Association,2018,33(3):139-146.
[23] 晁建平,李响敏,陈志玲,等.蓖麻酸(酯)合成共轭亚油酸研究进展[J].中国油脂,2009,34(7):34-37.CHAO Jianping,LI Xiangmin,CHEN Zhiling,et al.Research advance in synthesis of conjugated linoleic acid from ricinic acid(ester)[J].China Oils and Fats,2009,34(7):34-37.
[24] 陈杰博.亚油酸异构化Mg基固体碱催化剂的调控合成及反应机理[D].福州:福建师范大学,2017.CHEN Jiebo.Design of Mg-based solid base for isomerization of linoleic acid and the mechanism studying[D].Fuzhou:Fujian Normal University,2017.
[25] KREICH M,CLAUS P.Direct conversion of linoleic acid over silver catalysts in the presence of H2:An unusual way towards conjugated linoleic acids[J].Angewandte Chemie International Edition,2005,44(47):7800-7804.
[26] KIM Y J.Partial inhibition of biohydrogenation of linoleic acid can increase the conjugated linoleic acid production of Butyrivibrio fibrisolvens A38[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2003,51(15):4258-4262.
[27] KHOSRAVI A,SAFARI M,KHODAIYAN F,et al.Bioconversion enhancement of conjugated linoleic acid by Lactobacillus plantarum using the culture media manipulation and numerical optimization[J].Journal of Food Science and Technology,2015,52(9):5781-5789.
[28] YANG B,GAO H,STANTON C,et al.Bacterial conjugated linoleic acid production and their applications[J].Progress in Lipid Research,2017,68:26-36.
[29] HORNUNG E,KRUEGER C,PERNSTICH C,et al.Production of(10E,12Z)-conjugated linoleic acid in yeast and tobacco seeds[J].Biochimica et Biophysica Acta,2005,1738(1-3):105-114.
[30] PENG S S,DENG M D,GRUND A D,et al.Purification and characterization of a membrane-bound linoleic acid isomerase from Clostridium sporogenes[J].Enzyme and Microbial Technology,2007,40(4):831-839.
[31] YANG B,CHEN H,GU Z,et al.Synthesis of conjugated linoleic acid by the linoleate isomerase complex in food-derived lactobacilli[J].Journal of Applied Microbiology,2014,117(2):430-439.
[32] OGAWA J,MATSUMURA K,KISHINO S,et al.Conjugated linoleic acid accumulation via 10-hydroxy-12-octadecaenoic acid during microaerobic transformation of linoleic acid by Lactobacillus acidophilus[J].Applied and Environmental Microbiology,2001,67(3):1246-1252.
[33] KISHINO S,TAKEUCHI M,PARK S B,et al.Polyunsaturated fatty acid saturation by gut lactic acid bacteria affecting host lipid composition[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the U-nited States of America,2013,110(44):17808-17813.
[34] 杨波.乳酸菌生物转化共轭亚油酸的研究[D].无锡:江南大学,2014.YANG Bo.Study of conjugated linoleic acid bioconversion in lactic acid bacteria[D].Wuxi:Jiangnan University,2014.
[35] ORTEGA-ANAYA J,HERNÁNDEZ-SANTOYO A.Production of bioactive conjugated linoleic acid by the multifunctional enolase from Lactobacillus plantarum[J].International Journal of Biological Macromolecules,2016,91:524-535.
[36] 赵微,张峰,张和平,等.植物乳杆菌p-8转化亚油酸为共轭亚油酸的分析[J].食品科学,2021,42(10):94-103.ZHAO Wei,ZHANG Feng,ZHANG Heping,et al.Conversion of linoleic acid to conjugated linoleic acid by Lactobacillus plantarum p-8[J].Food Science,2021,42(10):94-103.
[37] KEPLER C R,TUCKER W P,TOVE S B.Biohydrogenation of unsaturated fatty acids.V.Stereospecificity of proton addition and mechanism of action of linoleic acid delta 12-cis,delta 11-trans-isomerase from Butyrivibrio fibrisolvens[J].The Journal of Biological Chemistry,1971,246(9):2765-2771.
[38] LIAVONCHANKA A,HORNUNG E,FEUSSNER I,et al.Structure and mechanism of the Propionibacterium acnes polyunsaturated fatty acid isomerase[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2006,103(8):2576-2581.
[39] ORTEGA-ANAYA J, HERNÁNDEZ-SANTOYO A.Functional characterization of a fatty acid double-bond hydratase from Lactobacillus plantarum and its interaction with biosynthetic membranes[J].Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Biomembranes,2015,1848(12):3166-3174.
[40] KEPLER C R,TOVE S B.Biohydrogenation of unsaturated fatty acids[J].Journal of Biological Chemistry,1967,242(24):5686-5692.
[41] KEPLER C R,TUCKER W P,TOVE S B.Biohydrogenation of unsaturated fatty acids.IV.Substrate specificity and inhibition of linoleate delta-12-cis,delta-11-trans-isomerase from Butyrivibrio fibrisolvens[J].The Journal of Biological Chemistry,1970,245(14):3612-3620.
[42] 李迅,顾华祥,王飞.痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶的克隆表达及酶学性质研究[J].南京林业大学学报(自然科学版),2014,38(6):105-109.LI Xun,GU Huaxiang,WANG Fei.Cloning,expression and characterization of a linoleic acid isomerase from Propionibacterium acnes[J].Journal of Nanjing Forestry University(Natural Sciences Edition),2014,38(6):105-109.
[43] 张白曦.亚油酸异构酶基因在产油真菌中的异源表达及产物的生物合成[D].无锡:江南大学,2013.ZHANG Baixi.Heterologous expression of linoleic acid isomerase and product biosynthesis in oleaginous fungus[D].Wuxi:Jiangnan University,2013.
[44] ROSBERG-CODY E, LIAVONCHANKA A, GÖBEL C,et al.Myosincross-reactive antigen(MCRA)protein from Bifidobacterium breve is a FAD-dependent fatty acid hydratase which has a function in stress protection[J].BMC Biochemistry,2011,12:9.
[45] FIBINGER M P C,VON SAβ G J F,HERRFURTH C,et al.A directed mutational approach demonstrates that a putative linoleate isomerase from Lactobacillus acidophilus does not hydrate or isomerize linoleic acid[J].European Journal of Lipid Science and Technology,2016,118(6):841-848.
[46] KIL K S,CUNNINGHAM M W,BARNETT L A.Cloning and sequence analysis of a gene encoding a 67-kilodalton myosin-crossreactive antigen of Streptococcus pyogenes reveals its similarity with class II major histocompatibility antigens[J].Infection and Immunity,1994,62(6):2440-2449.
[47] VOLKOV A,LIAVONCHANKA A,KAMNEVA O,et al.Myosin cross-reactive antigen of Streptococcus pyogenes M49 encodes a fatty acid double bond hydratase that plays a role in oleic acid detoxification and bacterial virulence[J].Journal of Biological Chemistry,2010,285(14):10353-10361.
[48] VOLKOV A,KHOSHNEVIS S,NEUMANN P,et al.Crystal structure analysis of a fatty acid double-bond hydratase from Lactobacillus acidophilus[J].Acta Crystallographica Section D,2013,69(4):648-657.
[49] ENGLEDER M,PAVKOV-KELLER T,EMMERSTORFER A,et al.Structure-based mechanism of oleate hydratase from Elizabethkingia meningoseptica[J].ChemBioChem,2015,16(12):1730-1734.
[50] LORENZEN J,DRILLER R,WALDOW A,et al.Rhodococcus erythropolis oleate hydratase:A new member in the oleate hydratase family tree—Biochemical and structural studies[J].ChemCatChem,2018,10(2):407-414.
[51] 赵微.植物乳杆菌p-8合成CLA及CLA-HY和CLA-DH结构和功能关系的研究[D].呼和浩特:内蒙古农业大学,2020.ZHAO Wei.Study on the synthesis of CLA and the relationship between structure and function of CLA-HY and CLA-DH of Lactobacillus plantarum p-8[D].Hohhot:Inner Mongolia Agricultural U-niversity,2020.