水产品中的土腥味问题由来已久，水产品中的土腥味物质对水产品的养殖、加工、销售和消费等环节影响较大，会给相关产业造成的严重经济损失，因此多年来水产品中的土腥味问题一直备受关注。
土腥味相关化合物的产生多数是由环境因素导致，同时也包括水产动物体内发生的相关生化反应，如脂肪酸的氧化、含硫含氮前体物质的酶催化转化、鱼体内三甲胺在微生物和酶作用下的降解等，这些都是水产品中土腥味物质的来源[1-2]。现有研究表明，土臭素（geosmin，GSM）和 2-甲基异莰醇（2-methyli-soborneol，2-MIB）是其中两种主要的土腥味物质，其相关研究也最多。GSM和2-MIB均属于天然烯萜醇类化学物质，属于亲脂类，具有叔醇结构[3]，具备抗氧化的能力，属半挥发性，微溶于水中。低浓度的2-MIB溶液有独特的霉味，但高浓溶液则呈现明显的樟脑味；GSM具有泥土的味道，但即使二者浓度较低也会对水产品风味造成巨大的影响[4]。
为了能够对水产品中的GSM和2-MIB进行有效评估，有必要对其开展监测。由于水产品体内GSM和2-MIB大都是痕量存在，目前通常采用气相色谱技术（gas chromatography，GC）[5-6]或气相色谱-质谱联用技术（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）进行定性、定量分析[7-8]。因此在分析中对其进行提取、富集和净化等一系列前处理显得尤为重要。目前常见的前处理方法主要包括微波蒸馏-吹扫捕集[9-10]、搅拌棒吸附法[11-12]、微波蒸馏提取法[13]、微波蒸馏-固相微萃取[14-15]、固相微萃取法[2，16-17]等。顶空分析减小了样品基质对分析的干扰，但由于2-MIB和GSM的半挥发性，顶空采样会导致重复分析的重现性较差[15]。微波蒸馏吹扫捕集法可有效解决手动样品前处理过程中的交叉污染、减少检测人员接触有机溶剂的风险，提取效率也提高很多，但其试验装置较为复杂且操作条件要求较高[9-10]。微波蒸馏-固相微萃取是目前气质联用法里使用最多的一种前处理方法，但其萃取装置费用高，固相微萃取头易折断，且提取时间较长，不适合批量测定[14-15]。搅拌棒吸附法是目前较为新颖的前处理方法，检出限相对较低，虽然加标回收率在可接受范围之内，但由于方法回收率等问题，目前较少使用[11-12]。综上，这些方法在处理水产品中GSM和2-MIB的分析时成本高、耗时长，难以满足大批量快速监测的生产应用需求。
本研究以主要水产品鱼为研究对象，通过分散固相萃取技术结合GC-MS，发展一种基于快速前处理技术的分析方法，缩短检测时长，降低分析成本，实现水产品中GSM和2-MIB的日常监测批量化。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鱼：市售；土臭素（GSM）标准品（纯度≥97%）：上海麦克林生化科技有限公司；2-甲基异莰醇（2-MIB）标准品：美国Chem Service公司；2-甲氧基-3-异丁基吡嗪（2-methoxy-3-isobutylpyrazine，IBMP）标准品（纯度＞99%）：上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙腈、正己烷、乙酸乙酯（均为色谱纯）：瑞典欧森巴克化学公司；氯化钠（分析纯）：天津市东丽区天大化学试剂厂；无水硫酸钠、无水硫酸镁（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；石墨化炭黑（C18）、乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）：天津博纳艾杰尔科技有限公司；弗罗里硅土（Florisil）：霍尼韦尔国际公司；0.2 μm有机相微孔滤膜：天津津腾实验设备有限公司。
1.2 仪器与设备
6890N GS-5975 MS气相色谱质谱仪、HP-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、DB-624UI毛细管柱（30 m×0.25 mm×1.40 μm）、DB-35MS毛细管柱（30 m×320 μm ×0.25 μm）：美国 Agilent公司；CR22GⅡ型高速冷冻离心机：日本Hitachi公司；Vortex3000涡旋振荡器、D-130手持匀浆机：德国艾卡仪器设备有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 标准溶液的配制
分别准确称取2-MIB、GSM、IBMP标准物质各10.0 mg，用甲醇定容至10.0 mL，得到1 000 mg/L的标准储备液。将其置于聚四氟乙烯封口的螺口瓶中，于-18℃避光保存，保存期为1个月。
分别准确移取100 μL 2-MIB和GSM标准储备液于同一容量瓶中，用甲醇定容至10 mL，得质量浓度为10 mg/L的混合标准工作溶液，现用现配。用甲醇将1 000 mg/L的IBMP内标准储备液，稀释成浓度为10 mg/L的内标添加液，现配现用。
准确移取1 mg/L标准混合液标准品1 000 μL，用甲醇定容至10 mL，配制成0.1 mg/L的标准工作溶液。再用甲醇配制成 1、2、4、5、10、20、40 μg/L 的系列标准曲线溶液，内标浓度为4 μg/L。
1.3.2 样品前处理
首先取适量新鲜的鱼进行预处理：鱼去鳞去皮，取肌肉部分粉碎。称取2 g鱼组织样品，置于50 mL聚丙烯离心管中，IBMP 添加量为 4 μg/L，加标量为 5、25、50 ng/g。加入2 mL水匀浆30 s后加入IBMP标准溶液，振荡后加入乙腈5 mL，涡旋振荡30 s，静置提取3 min后先加入1 g氯化钠涡旋振荡30 s后，再加入5 g无水硫酸钠涡旋振荡30 s，6 000 r/min离心5 min，取上层清液2 mL于50 mL聚丙烯离心管中，加入0.1 g PSA和0.1 g C18，涡旋混合30 s，12 000 r/min离心5 min后，取上层清液1 mL，过0.22 μm滤膜，待分析。
1.3.3 仪器分析
1.3.3.1 色谱条件
色谱柱为DB-624UI毛细管柱；载气为氦气；进样口起始温度250℃，不分流进样；进样量为1 μL；程序升温控制：初始温度为60℃，保持2.5 min，以15℃/min速率升至150℃，保持5 min，以5℃/min升至250℃。
1.3.3.2 质谱条件
离子源为电子轰击离子源（electron impact，EI）；离子化能量为70 eV；离子源温度为280℃；扫描模式为选择离子检测（selected ion monitor，SIM）。3种化合物的离子对参数见表1。
表1 3种化合物保留时间、定量、定性离子
Table 1 Retention times，quantitation ions and identification ions of the three compounds
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1.4 质量控制
所有玻璃器皿用自来水超声清洗30 min后，再用去离子水洗3次，烘干后依次用甲醇各洗2次，待溶剂挥发完全后，置于马弗炉中于450℃烧3 h，自然冷却后取出待用。
同时进行方法空白平行样及样品平行样的测定，以进行质量控制与质量保证。为了保证目标化合物识别的准确性，在相同的试验条件下，如果检出的色谱峰的保留时间和GSM与2-MIB标准品谱图一致，且保留时间与试样添加标准品的色谱峰保留时间比较，相对误差在2%内，则可认为样品中含有GSM和2-MIB成分。
1.5 数据分析
采用Origin 2018进行图形数据处理，使用Excel 2019对鱼组织中的GSM和2-MIB数据进行统计学比较分析。
2 结果与分析
2.1 色谱-质谱条件的优化
采用全扫描（full scan）和选择离子监测模式对目标物进行定性和定量测定，分别选取丰度相对最强的一对碎片离子作为定量离子，次强的一对或两对碎片离子作为定性离子，分别选用HP-5MS毛细管柱、DB-624UI毛细管柱、DB-35MS作为色谱柱。GSM和2-MIB 混合标准溶液（40 μg/L）、内标（4 μg/L）的总离子流色谱图见图1。
图1 GSM和2-MIB总离子流色谱图
Fig.1 GSM and 2-MIB total ion chromatograms
由图1可知，在本研究设定的条件下，2-MIB和GSM在3种色谱柱上均有较好的色谱保留行为，都能达到较好的色谱峰分离效果。相对于HP-5MS和DB-624UI毛细管柱，DB-35MS条件下3种化合物的响应强度较低；又由于DB-624UI同HP-5MS毛细管柱相比较，3种化合物有更好的分离度，且基质干扰小，因此试验中选择DB-624UI毛细管柱作为主要研究色谱柱。
2.2 前处理条件优化
2.2.1 有机溶剂的选择
GSM和2-MIB均属于天然烯萜醇类化学物质，属于亲脂类，具有叔醇结构。两者都存在羟基取代基，整体分子表现一定的弱极性。基于GSM和2-MIB的分子结构特征，选取常用的乙腈、乙酸乙酯和正己烷作为提取溶剂对目标化合物进行提取效率考察，试验结果如图2所示。
图2 3种有机溶剂对两种化合物回收率的影响
Fig.2 Effect of three organic solvents on the recovery of two compounds
由图2可见，3种提取溶剂中，乙腈、正己烷和乙酸乙酯的提取回收率范围分别为90.0%～110.0%、57.7%～69.9%和72.6%～123.0%，乙腈表现相对较好。此外，鱼体中富含蛋白质，乙腈具有一定的沉淀蛋白质能力[18]，有利于样品的净化。综上，研究选择乙腈作为提取溶剂。
2.2.2 有机提取溶剂用量选择
选择 3、5、7、10 mL乙腈分别进行加标（加标量为25 ng/g）回收试验，结果如图3所示。
由图3可知，试验设定的乙腈用量对回收率影响不大，回收率范围在92.3%～102.1%，均满足回收率要求。由于采用3 mL乙腈用量，提取剂用量较少，不易进行分散操作，易导致样品在提取溶剂中的分散处理时间增长。为了增加试验的可操作性，保证提取回收率的稳定性，并降低成本，选择5 mL乙腈用量作为提取剂用量。
图3 不同乙腈用量对两种化合物回收率的影响
Fig.3 Effect of different amounts of acetonitrile on the recovery of two compounds
2.2.3 提取时间选择
为考察乙腈作为提取溶剂的最佳提取时间，分别选择3、5、7、10 min作为不同提取时间进行加标（加标量为25 ng/g）回收试验，试验结果如图4所示。
图4 不同提取时间对两种化合物回收率的影响
Fig.4 Effect of different extraction times on the recovery of the two compounds
由图4可知，提取时间对回收效果无明显影响，提取回收率在81.7%～101.4%。为了缩短检测时长，在保证提取效率的基础上，试验确定乙腈提取时间为3 min。
2.2.4 脱水剂的选择
样品经乙腈提取后，为避免目标物在乙腈/水体系进行双水相分配，降低提取收率，试验中采用添加脱水剂以实现目标物在乙腈相中的充分分配。常用的脱水剂为无水硫酸钠、无水硫酸镁。考虑到鱼肉组织中的含水量，以及试验中添加水量，试验在4 g脱水剂用量下分别考察目标化合物中的提取回收率，结果见图5。
由图5可知，两种脱水剂的使用对目标化物的提取回收率影响不大，提取回收率在94.5%～113.4%。由于无水硫酸镁在吸水过程中放热剧烈，若样品处于室温状态，加入无水硫酸镁会产生大量热量，可能造成提取物损失，影响测定结果的准确性并存在一定的安全隐患。而无水硫酸钠价格低廉，吸水能力较强，加入无水硫酸钠既可以除去其中的水分，又不会因大量放热导致目标物损失，更利于目标物的提取，因此选择无水硫酸钠作为脱水剂。
图5 不同脱水剂下两种化合物回收率
Fig.5 Recovery rates of two compounds under different dehydrating agents
2.2.5 吸附剂的选择
鱼组织样品经过有机溶剂提取，提取液中会存在一定量类脂物质、聚合物及色素等杂质，这些物质在气相色谱分析时会聚集在仪器进样口和衬管，导致污染，造成色谱分离效率降低[19]，为了提高气相色谱分析的准确度，还需进一步净化，以降低杂质对定性定量分析的干扰，试验中选择3种常用的吸附剂（C18、PSA和Florisil）进行目标化合物的净化。PSA为弱阴离子交换填料，含有两个胺基结构，可吸附金属离子、色素、脂肪酸和其他极性有机酸等杂质[20-21]；C18可以吸收一些弱极性的化合物，除去基质中的蛋白质、脂类等弱极性的物质[21-22]；Florisil是一种高选择性的吸附剂，正相条件下能够从非极性基质中强烈吸附极性分析物[23]。本方法分别考察100 mg PSA、C18和Florisil吸附剂单独和组合使用后GSM和2-MIB在乙腈中的净化效果，结果见图6和图7。
图6 不同吸附剂下两种化合物回收率
Fig.6 Recovery rates of two compounds under different adsorbents
图7 不同吸附剂组合下的色谱图
Fig.7 Chromatograms under various adsorbent combinations
由图6可知，单独使用C18、PSA和Florisil时，3种吸附剂能够保证对GSM的提取回收率，回收率范围在99.9%～166.9%，但对2-MIB的提取回收率较低，分别为76.7%、45.9%、63.4%。使用 Florisil与 PSA、C18两两组合时发现，100 mg C18和Florisil组合时，2-MIB的提取回收率不足70%，100 mgPSA和Florisil组合时，GSM和2-MIB提取回收率过高（124.9%和124.4%），而100 mg C18和PSA组合作为吸附剂时，GSM和2-MIB的提取回收率在103.5%～109.1%，能够更好满足检测方法的要求。
由图7可知，经C18和PSA组合吸附后样品的杂质干扰比PSA、C18与Florisil单独使用和其他组合杂质干扰小。综上，本试验选择100 mg PSA和C18吸附剂组合，保证样品的净化效果，满足分析方法的要求。
2.3 线性范围及检出限与定量限
在选定的色谱和质谱条件下，根据所确定系列浓度的标准溶液，以目标物的浓度为横坐标（x），色谱峰的峰面积为纵坐标（y），进行回归分析，GSM和2-MIB在 0.50 μg/L～500.00 μg/L 具有良好的线性，相关系数R2＞0.999。根据国际纯粹和应用化学联合会（International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC）对检出限的定义，稀释并检测系列混合标准溶液，计算信噪比（S/N），以S/N=3为检出限（limit of detection，LOD），以S/N=10为定量限（limit of quantitation，LOQ），结果见表2。
表2 检出限（LOD）、定量限（LOQ）与线性关系
Table 2 Limits of detection，limits of quantification and linear relationships
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2.4 方法回收率和精确度
选取空白鱼肉组织样品添加GSM和2-MIB标准溶液，鱼肉组织按照5、25、50 ng/g 3个水平进行加标试验，每个水平做3个平行，按照方法规定的操作步骤进行测定，考察方法的回收率，结果见表3。
由表3可见，3个浓度水平的加标回收率范围在99.7%～115.7%，相对标准偏差（relative standard devia-tion，RSD）范围在3%～14%，均满足GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》残留分析要求。
表3 鱼肉中两种化合物加标回收率
Table 3 Spiked recoveries of two compounds in fish
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2.5 实际样品分析
按照本方法对不同种类鱼中GSM和2-MIB进行定量分析，结果见表4。
表4 不同种类鱼中两种化合物含量
Table 4 Two compounds in different fishes
注：ND表示未检出。
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由表4可知，不同种类鱼肉组织中能够检测到GSM和2-MIB，其检测范围分别为ND～20.56 ng/g和ND～12.51 ng/g。
3 结论
本试验建立了一种使用气相色谱-质谱联用仪同时快速大规模检测鱼组织中土腥味物质的方法。样品通过乙腈提取，采用PSA和C18净化后进样分析。优化后的样品前处理方法能在30 min内完成多个样品的处理，目标物在优化后的条件下具有良好的线性关系、回收率与精密度。该方法操作简单、耗时短、有机试剂消耗少、成本低廉，可以应用于鱼组织中土腥味物质的检测。
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