薏苡仁，别称薏仁、薏米，是草本植物薏苡的成熟种仁，它的生长环境一般处在湿润阴凉处，其特点是生长能力较强，在我国大部分的省份均有种植[1-2]。薏苡仁含有的营养成分极其丰富，其中含有淀粉约为60%，蛋白质约为13%，脂肪约为5%，膳食纤维含量约为17%，这些营养物质的含量均超过稻米，且薏苡仁可以作为药食两用的食材[3-4]。薏苡仁中还含有人体必需的8种氨基酸，同时钙、磷、铁等矿物质含量较为丰富，具有抗氧化、降血压血糖、抗肿瘤的功能[5-6]。因此，有关薏苡仁的研究逐渐成为国内外的热点。
多糖是糖苷键结合的糖链，是至少需10个单糖构成的聚合糖高分子化合物，在生物体内广泛存在[7-8]。薏苡仁多糖是薏苡仁的主要功能性成分，是薏苡仁发挥药理保健功能的重要活性成分，具有降血脂、降血糖[9-10]、抗肿瘤[11]、提高免疫力[12]、防癌[13]等作用。另外，薏苡仁多糖还具备抗氧化能力，可以清除机体内多余的自由基，保护机体细胞不受到损伤[14-15]。当前薏苡仁多糖的研究仅针对其营养成分，对其多糖的生物活性研究鲜有报道。本文以响应面法优化薏苡仁多糖闪式提取工艺，得出最佳的提取工艺参数，同时对薏苡仁多糖的生物活性进行研究，探讨其抗氧化活性以及体外降糖活性，为薏苡仁多糖的开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 原料与试剂
薏苡仁：亳州市惠民百草药业销售有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐[2，2′-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]（均为分析纯）：上海跃腾生物技术有限公司；3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）、无水乙醇、硫酸、苯酚、硫酸亚铁、过硫酸钾、水杨酸、30%过氧化氢（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；维生素C（分析纯）：江苏久佳生物科技有限公司；α-淀粉酶（30 U/mg）、α-葡萄糖苷酶（50 U/mg）（食品级）：北京百灵威科技有限公司。
1.2 仪器与设备
PWN225DZH型电子天平：河南奥普斯仪器设备有限公司；Fresco 21型离心机：上海远耀生物科技有限公司；752N型紫外/可见分光光度计：山东博科生物产业有限公司；KM1-JHBE-50T型闪式提取器：东方化玻（北京）科技有限公司；JC22520型旋转蒸发仪：邢台德延科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 薏苡仁多糖的制备
预处理：选择饱满的薏苡仁，烘干至恒重，使用粉碎机粉碎成粉末过60目筛后，称取适量的薏苡仁粉末，使用95%乙醇加热回流3 h，加热回流2次，脱脂处理2次，脱脂后的薏苡仁粉末自然晾干。
称取一定量的脱脂薏苡仁粉末，加入蒸馏水搅拌混匀，加入到闪式提取器中，调整闪提时间、提取电压、液料比、提取转速、提取次数进行提取，待提取结束后，将提取液过滤，提取液浓缩至原体积的1/2，加入无水乙醇至浓缩液中，使其体积分数为80%，静置过夜8 h，抽滤干燥滤饼，得到薏苡仁多糖[16-17]。
1.3.2 薏苡仁多糖得率的测定
薏苡仁总糖测定：参考李岩等[18]的测定方法并稍作修改。精密称取葡萄糖标准品10 mg至10 mL容量瓶中，加入蒸馏水定容，精密量取 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL葡萄糖标准品溶液至试管中，向各个试管中加入蒸馏水1.0 mL，随后加入6%苯酚溶液1.0 mL，轻轻振荡摇匀，混匀后量取浓硫酸5 mL，加入至试管摇匀，水浴锅90℃下加热20 min后，放冷至温度为（23±2）℃，并于490 nm波长测定吸光值。以葡萄糖标准品质量浓度x为横坐标，以吸光值y为纵坐标绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程y=1.631 1x+0.036 2，R2=0.998 3。
薏苡仁还原糖测定：采取上述总糖中葡萄糖标准溶液配制方法，配制浓度为1 mg/mL葡萄糖标准溶液，精密量取 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 葡萄糖标准溶液置于试管中，补充蒸馏水至2.0 mL，然后加入2 mL DNS溶液，混匀后置于沸水中加热5 min，取出放冷，在540 nm处测定吸光值。得到标准曲线回归方程y=1.437 5x+0.007 5，R2=0.997 1。薏苡仁多糖含量为总糖含量与还原糖含量差值。
薏苡仁多糖得率计算公式如下。
式中：Y为薏苡仁多糖得率，%；C为薏苡仁多糖含量，mg/mL；V为提取液体积，mL；M为薏苡仁粉末质量，mg。
1.3.3 单因素试验
以薏苡仁多糖得率为指标，考察液料比、闪提时间、提取电压、提取转速、提取次数对薏苡仁多糖得率的影响。
1.3.4 响应面法优化薏苡仁多糖提取试验
参考单因素试验结果，设计Box-Behnken试验，以薏苡仁多糖得率Y为响应值，考察闪提时间X1、提取电压X2和提取转速X3对薏苡仁多糖得率影响，进行响应面试验，因素水平见表1。
表1 Box-Behnken试验设计因素水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken test design
?
1.3.5 薏苡仁多糖抗氧化活性测定
1.3.5.1 薏苡仁多糖对DPPH自由基清除能力的影响
参考刘保山等[19]的方法，将DPPH配制成0.2mmol/L溶液，将薏苡仁多糖样品配制成不同浓度（0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mg/mL）薏苡仁多糖溶液，取DPPH 自由基溶液1 mL和不同浓度的薏苡仁多糖溶液1 mL混合，在 517 nm 测定吸光值，同时配制 0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mg/mL VC溶液作为对照溶液。DPPH自由基清除率计算公式如下。
DPPH 自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100
式中：A0为对照品吸光值；A1为含多糖样品吸光值；A2为样品空白吸光值。
1.3.5.2 薏苡仁多糖对ABTS阳离子自由基清除能力的影响
将ABTS配制成7 mmol/L的溶液作为母液，与2.6 mmol/L过硫酸钾溶液等比例混合，避光反应16 h，薏苡仁多糖样品配制成不同浓度（0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mg/mL）薏苡仁多糖溶液，取避光反应后的ABTS溶液1 mL和不同浓度的薏苡仁多糖溶液1 mL混合，在 734 nm 测定吸光值，同时配制 0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mg/mL的VC溶液作为对照溶液。ABTS阳离子自由基清除率计算公式如下。
ABTS 阳离子自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100
式中：A0为对照品吸光值；A1为含多糖样品吸光值；A2为样品空白吸光值。
1.3.5.3 薏苡仁多糖对·OH清除能力的影响
配制10 mmol/L硫酸亚铁溶液、10 mmol/L水杨酸溶液、10 mmol/L过氧化氢溶液，薏苡仁多糖样品配制成不同浓度（0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mg/mL）薏苡仁多糖溶液，分别与上述溶液各1 mL混合，在510 nm测定吸光值，同时配制 0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mg/mL 的VC溶液作为对照溶液。
·OH 清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100式中：A0为对照品吸光值；A1为含多糖样品吸光值；A2为样品空白吸光值。
1.3.6 薏苡仁多糖生物活性试验
称取适量薏苡仁多糖粉末，加入蒸馏水配制成0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mg/mL 的薏苡仁多糖溶液，对其进行α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制试验[20]。
1.4 数据处理
所有试验均重复3次，数据均以平均值±标准差表示，利用Design-Expert软件对薏苡仁多糖得率进行优化。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 液料比对薏苡仁多糖得率的影响
液料比对薏苡仁多糖得率的影响见图1。
图1 液料比对薏苡仁多糖得率的影响
Fig.1 Effect of liquid material ratio on the yield of Coix polysaccharide
由图 1 可知，液料比在 10 ∶1（mL/g）～20∶1（mL/g）时，薏苡仁多糖得率呈上升趋势，当液料比为20∶1（mL/g）时，薏苡仁多糖得率达到最高，之后得率变化不明显。分析其原因可能是蒸馏水的比例增加，使闪式提取器内的被提取物和蒸馏水两者之间传质推动力增大，并且被提取物与蒸馏水充分混合，有利于多糖溶出到蒸馏水中，使薏苡仁多糖得率增加。继续增加蒸馏水的比例，薏苡仁多糖得率不再提高，可能原因是薏苡仁中含有的多糖已经基本被提取完全。因此，最佳液料比选择 20 ∶1（mL/g）。
2.1.2 闪提时间对薏苡仁多糖得率的影响
闪提时间对薏苡仁多糖得率的影响见图2。
图2 闪提时间对薏苡仁多糖得率的影响
Fig.2 Effect of flash extraction time on the yield of Coix polysaccharide
由图2可知，闪提时间在40 s～100 s时，薏苡仁多糖得率呈上升趋势，之后薏苡仁多糖得率开始降低，并且闪提时间为100 s时，薏苡仁多糖得率达到最高。分析其原因可能是随着闪提时间延长，会使闪式提取器内部温度快速上升，从而使薏苡仁多糖分解，因此选择闪提时间80、100、120 s进行后续试验。
2.1.3 提取电压对薏苡仁多糖得率的影响
提取电压对薏苡仁多糖得率的影响见图3。
图3 提取电压对薏苡仁多糖得率的影响
Fig.3 Effect of extraction voltage on the yield of Coix polysaccharide
由图3可知，提取电压在120 V～160 V时，薏苡仁多糖得率呈上升趋势，提取电压为160 V时，薏苡仁多糖得率达到最高，之后得率开始下降。分析其原因可能是提取电压增加，会使闪式提取器内的剪切刀头转速加快，进而剪切力增加，最终薏苡仁多糖由于剪切力的影响，传质速率加快，多糖更容易向外溶出到蒸馏水中。继续增加提取电压，会使闪式提取器内部各个元器件摩擦生热，从而温度加速提高，薏苡仁多糖分解，导致得率降低。因此，选择提取电压140、160、180 V进行后续试验。
2.1.4 提取转速对薏苡仁多糖得率的影响
提取转速对薏苡仁多糖得率的影响见图4。
图4 提取转速对薏苡仁多糖得率的影响
Fig.4 Effect of extraction speed on yield of Coix polysaccharide
由图4可知，提取转速在4 000 r/min～6 000 r/min，薏苡仁多糖得率呈上升趋势，提取转速为6 000 r/min时，薏苡仁多糖得率达到最高，之后得率开始下降。随着转速的增加，提取器内会产生巨大的剪切力，使有效成分快速溶出。继续增加提取转速，会导致剪切刀头热量过多，提取器内部环境温度升高，薏苡仁多糖分解，得率降低。因此，选择提取转速5 000、6 000、7 000 r/min进行后续试验。
2.1.5 提取次数对薏苡仁多糖得率的影响
提取次数对薏苡仁多糖得率的影响见图5。
图5 提取次数对薏苡仁多糖得率的影响
Fig.5 Effect of extraction times on yield of Coix polysaccharide
由图5可知，薏苡仁多糖得率随着提取次数的增多呈上升趋势，当提取次数为2次时薏苡仁多糖得率变化趋于平缓，表明薏苡仁多糖已经提取完全。综合考量时间和成本，选择2次为最佳提取次数。
2.2 响应面法试验结果与分析
参考单因素试验，根据Box-Benhnken试验，以闪提时间、提取电压、提取转速3个因素进行试验，对薏苡仁多糖得率（Y）进行优化。响应面分析方案与结果见表2。
表2 Box-Behnken试验设计与结果
Table 2 Test design and results of Box-Behnken
?
对表2数据进行分析，得到薏苡仁多糖得率（Y）多元回归方程：Y=9.03+0.049X1+0.030X2+0.11X3-0.028X1X2-0.020X1X3+0.058X2X3-0.37X12-0.31X22-0.41X32。方差分析见表3。
表3 响应面回归模型ANOVA分析结果
Table 3 ANOVA analysis results of response surface regression model
注：*表示有显著影响（P＜0.05）；**表示有极显著影响（P＜0.01）。
?
由表3可得，模型P＜0.01，说明该模型极显著，失拟项P=0.367 8＞0.05，说明各个因素对试验的结果影响较小，模型拟合好，试验误差较小。模型R2=0.998 7，RAdj2=0.996 9，说明薏苡仁多糖得率的理论值与试验值拟合较好，一致性较高。并且X1、X2、X3均达到了极显著水平（P＜0.01）；X1X2达到显著水平（P＜0.05），X2X3达到极显著水平（P＜0.01）；各因素的二次项对薏苡仁多糖得率的影响达到了极显著水平（P＜0.01）。
2.3 响应面法优化分析
各因素间交互作用的响应面图见图6～图7。
由图6、图7可知，闪提时间和提取电压，提取电压和提取转速对薏苡仁多糖得率的影响呈明显的椭圆形，表明闪提时间和提取电压以及提取电压和提取转速交互作用明显。
图6 闪提时间和提取电压对薏苡仁多糖得率的响应面分析
Fig.6 Response surface analysis of flash extraction time and extraction voltage on yield of Coix seed polysaccharide
图7 提取电压和提取转速对薏苡仁多糖得率的响应面分析
Fig.7 Response surface analysis of extraction voltage and rotation on yield of Coix seed polysaccharide
响应面分析得出薏苡仁多糖的最优提取工艺为闪提时间101.19 s、提取电压161.16 V、提取转速6 133.64 r/min，理论薏苡仁多糖得率为9.06%。考虑到操作便利性，在实际试验中参数设定为闪提时间101 s、提取电压161 V、提取转速6 100 r/min。将上述工艺参数做3次平行试验，得出薏苡仁多糖平均得率为9.03%，与预测值接近。表明上述回归模型可用于薏苡仁多糖提取工艺参数的优化。
2.4 薏苡仁多糖抗氧化活性测定结果
2.4.1 薏苡仁多糖对DPPH自由基清除能力的影响
薏苡仁多糖对DPPH自由基清除能力的影响见图8。
图8 薏苡仁多糖对DPPH自由基清除能力的影响
Fig.8 Effect of Coix polysaccharide on DPPH radical scavenging ability
由图8可知，薏苡仁多糖对DPPH自由基产生了积极的影响，样品浓度在0.1 mg/mL～3.2 mg/mL时，DPPH自由基清除率呈上升趋势，并且随着浓度的增加，清除率增大，最终稳定在60.21%，说明薏苡仁多糖对DPPH自由基具有良好的清除能力。
2.4.2 薏苡仁多糖对ABTS阳离子自由基清除能力的影响
薏苡仁多糖对ABTS阳离子自由基清除能力的影响见图9。
图9 薏苡仁多糖对ABTS阳离子自由基清除能力的影响
Fig.9 Effect of Coix polysaccharide on free radical scavenging ability of ABTS+
由图9可知，薏苡仁多糖对ABTS阳离子自由基产生了积极的影响，样品浓度在0.1 mg/mL～3.2 mg/mL时，ABTS阳离子自由基清除率呈上升趋势，并且随着浓度的增加，清除率增大，稳定在40.06%，说明薏苡仁多糖对ABTS阳离子自由基具有良好的清除能力。
2.4.3 薏苡仁多糖对·OH清除能力的影响
薏苡仁多糖对·OH清除能力的影响见图10。
由图10可知，薏苡仁多糖对·OH产生了积极的影响，样品浓度在0.1 mg/mL～3.2 mg/mL时，·OH清除率呈上升趋势，并且随着浓度的增加，清除率越高，达到21.65%，相比VC对于·OH的清除能力，薏苡仁多糖对·OH的清除能力较弱。
图10 薏苡仁多糖对·OH清除能力的影响
Fig.10 Effect of Coix polysaccharide on·OH scavenging ability
2.5 薏苡仁多糖对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制的影响
薏苡仁多糖对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制的影响见图11。
图11 薏苡仁多糖对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制的影响
Fig.11 Effect of Coix seed polysaccharide on α-amylase and α-glucosidase inhibition
由图11可知，薏苡仁多糖对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶产生了积极的影响，样品浓度在0.1 mg/mL～3.2 mg/mL时，薏苡仁多糖对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率呈上升趋势，并且随着浓度的增加，抑制率增大，分别达到81.34%和78.88%，说明薏苡仁多糖对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶具有良好的抑制作用。
3 结论
本文通过响应面优化闪式提取薏苡仁多糖，得出最优提取工艺为闪提时间101 s、提取电压161 V、提取转速6 100 r/min。将上述工艺参数做3次平行试验，得出薏苡仁多糖平均得率为9.03%，与预测值接近。同时薏苡仁多糖对DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除能力效果明显，清除率分别达到60.21%和40.06%，对·OH清除能力效果一般，清除率为21.65%，表明薏苡仁多糖具有良好的抗氧化能力。薏苡仁多糖对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制能力效果明显，抑制率分别达到81.34%和78.88%，说明薏苡仁多糖对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶具有良好的抑制作用，为今后薏苡仁多糖在药食两用方面的研究提供了参考。
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