红豆又称赤豆，为菜豆属豆科草本植物赤小豆或赤豆的成熟种子，颜色淡红、鲜红或深红[1]。红豆营养丰富，可加工成许多食品，深受大众喜爱，堪称粮食佳品[2]。同时红豆是一种高蛋白低脂肪的食物，其氨基酸种类齐全，口感好，是食品加工业的优质原材料，其蛋白质含量平均可达22.65%，比禾谷类蛋白质含量高2倍～3倍[3]，必需氨基酸水平符合或高于世界卫生组织/联合国粮食及农业组织（World Health Organization/Food and Agriculture Organization of the United Nations，WHO/FAO）的要求[4]。
近几年的研究发现抗氧化肽具有抗氧化性[5]、降脂[6]、降血糖[7]、缓解骨质疏松[8]等功能特性，而目前制备肽一般采用传统的碱沉酸提法和酶解法，其中酶解法因其作用温和，可更好保护氨基酸结构，且操作便捷省时。刘琪等[9]采用Protex 6L酶解红豆粉制备红豆多肽，通过响应面优化提取红豆多肽的制备工艺，多肽的提取率可达84.29%左右。程谦伟等[10]采用碱性蛋白酶水解法制备红豆多肽，通过正交试验优化得出最佳工艺条件为加酶量8%，pH值9.0，底物浓度4%，酶解时间4 h，酶解温度55℃，此条件下的水解度为45.82%。梁英岳[11]采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解红豆多肽，结果表明碱性蛋白酶的水解效果最佳，所制备的酶解物具有一定的抗氧化活性。
本试验以红豆蛋白为原料，选取碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶共5种蛋白酶分别对红豆蛋白进行水解，选取其中两种最佳作用酶复合水解制备红豆多肽，并研究优化红豆蛋白肽的制备工艺，同时评估红豆蛋白多肽的体外抗氧化活性，旨在为红豆蛋白多肽的酶解制备和应用奠定一定基础。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
红豆蛋白粉：陕西斯诺特生物技术有限公司；碱性蛋白酶（10U/g～100U/g）、木瓜蛋白酶（6U/g～240U/g）、中性蛋白酶（5万 U/g～40万U/g）、胰蛋白酶（4 000 U/g）：上海翔洋实业有限公司；胃蛋白酶（1万U/g）：南宁庞博生物工程有限公司；氢氧化钠（NaOH）、盐酸（HCl）、过氧化氢（H2O2）、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、七水合硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）、氯化亚铁（FeCl2）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）：北京索莱宝科技有限公司。以上试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
Dor Yang FA-T万分之一电子天平：渡扬精密仪器（上海）有限公司；TGL20MC台式高速冷冻离心机：长沙英泰仪器有限公司；PHS-5GpH计：上海大普仪器有限公司；LGJ-18冷冻干燥机：北京亚星仪科科技发展有限公司；UPG-722紫外可见分光光度计：北京优谱通用科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 红豆蛋白粉成分测定
粗蛋白含量测定：参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》；粗脂肪测定：参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》；灰分测定：参照GB 5009.4—2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》；水分测定：参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》。
1.3.2 红豆蛋白多肽的制备工艺流程
红豆蛋白粉→1∶10（g/mL）加去离子水→红豆蛋白溶液→恒温水浴锅预热→加酶→调节各酶最适作用温度→0.5 mol/L NaOH和0.5 mol/L HCl调节各酶最适pH值→反应1 h→4 500 r/min离心20 min→取上清液→冻干→红豆蛋白肽→-80℃保存。
1.3.3 水解度（degree of hydrolysis，DH）的测定
采用pH-stat法测定计算蛋白水解度[12]。
1.3.4 最佳作用酶的筛选
以水解度为表征指标，将红豆蛋白粉与去离子水按照1∶25（g/mL）的配比混匀后，置于恒温水浴锅中，调节5种酶最适的作用温度，用1 mmol/L的NaOH和HCl调节5种酶作用的最适pH值条件，同时按0.5%的酶与底物添加量固定加酶量，分别启动酶水解反应。选取其中两个水解度最高的酶，以这两种酶协同酶解红豆蛋白液，后续以单因素试验方法探究不同反应条件对双酶协同反应效果的影响。
1.3.5 单因素试验
以水解度为表征指标，考察双酶协同酶解的底物浓度（1%、2%、3%、4%、5%、6%）、加酶量（200、400、600、800、1 000、1 200 U/g）、反应时间（1、2、3、4、5、6 h）、反应温度（50、51、52、53、54、55 ℃）以及两种酶的酶活比（1 ∶9、2 ∶8、3 ∶7、4 ∶6、5 ∶5、6 ∶4、7 ∶3、8 ∶2、9 ∶1）对水解度的影响。
1.3.6 正交试验
根据单因素试验所得出的结果，固定碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶活比为6∶4、pH值为7.5、反应温度为52℃，选取加酶量、底物浓度和反应时间3个因素，每个因素选取3个水平，进行L9（33）正交试验优化红豆蛋白肽的制备工艺，正交试验设计见表1。
表1 三因素三水平正交试验设计
Table 1 Three factors and three levels orthogonal test
?
1.3.7 双酶协同水解所得红豆蛋白肽的抗氧化活性测定
DPPH自由基清除能力的测定参照Xia等[13]的方法并略有修改，取0.5 mL 4 mg/mL的样品液加入0.5 mL0.1 mmol/L的DPPH无水乙醇溶液进行避光反应30 min，于波长517 nm处测定吸光度，以蒸馏水为空白对照。
DPPH 自由基清除率/%=（1-A样/A对）×100式中：A对为对照组在517 nm处的吸光度；A样为待测样品在517 nm处的吸光度。
参照Wang等[14]的方法对样品·OH清除率进行测定。
·OH清除率/%=[（A0-AS）/A0]×100式中：A0为对照组的吸光度；As为待测样品的吸光度。
ABTS+·清除率的测定参照王蘇音等[15]的方法进行计算，以蒸馏水为空白对照。
ABTS+自由基清除率/%=[（Ax-Ax0）/A0]×100
式中：AX为1.00 mL ABTS试剂和0.50 mL酶解样液的吸光度；A0为1.00 mL ABTS试剂和0.50 mL蒸馏水的吸光度；AX0为1.00 mL无水乙醇和0.50 mL酶解样液的吸光度。
O2-·清除率采用邻苯三酚法进行测定[16]，以蒸馏水为空白对照。
O2-·清除率/%=（1-A样品/A空白）× 100式中：A空白为空白对照组的吸光度；A样品为待测样品的吸光度。
1.4 统计分析
每组试验重复3次，数据结果表示为平均值±标准偏差。采用 origin 86、SPSS、Excel2012软件，进行方差分析和差异显著性分析（P＜0.05）。
2 结果与分析
2.1 红豆蛋白粉主要成分
红豆蛋白粉的主要成分见表2。
表2 红豆蛋白粉的主要成分
Table 2 Main components of red bean protein powder
?
由表2可知，粗蛋白、水分、灰分、粗脂肪为红豆蛋白粉的4种主要成分，且其粗蛋白含量较高，可达72.43%，且脂肪含量较低。
2.2 两种协同作用蛋白酶的筛选
不同蛋白酶对红豆蛋白水解度的影响见图1。
由图1可知，水解红豆蛋白作用较佳的酶是碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，将两种酶按照酶活比1∶1进行配比，协同水解的效果优于其他5种酶单独作用的效果，此时的蛋白水解度为21.26%。有研究显示碱性蛋白酶更适合水解植物蛋白[11]，且更容易作用于肽键。而木瓜蛋白酶是一种含巯基（-SH）的肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，其对动植物蛋白等具有较强的水解能力[17]。因此后续试验采用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶进行双酶协同水解制备红豆多肽，以及后续的工艺优化研究。
图1 不同酶水解红豆蛋白的测定结果
Fig.1 Determination results of different enzymes hydrolyzed red bean protein
2.3 不同因素对双酶协同作用水解红豆蛋白的影响
通过双酶筛选的碱性蛋白酶最适反应pH值为7～11，木瓜蛋白酶的最适反应pH值为7～8，因此选择7.5作为双酶协同反应的最适pH值，进行后续的单因素试验。
2.3.1 酶活比对红豆蛋白水解度的影响
不同酶活比对红豆蛋白水解度的影响见图2。
图2 不同酶活比对红豆蛋白水解度的影响
Fig.2 The effect of different enzyme activity ratio on the degree of hydrolysis of red bean protein
由图2可知，不同酶活比作用下的红豆蛋白水解度变化较大，其中碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶在酶活比为6∶4时，红豆蛋白的水解度最大，优于其他比例下的水解度，可能由于两种酶不同的酶切位点影响其协同作用的最佳性，碱性蛋白酶可裂解蛋白的Glu、Met、Leu、Tys、Lys以及 Gln 的羧端肽键[11]，木瓜蛋白酶的酶切位点为 Arg、Lys、Gly、瓜氨酸（L-citrulline）。初步确定，双酶协同水解的最佳酶活比为6∶4。
2.3.2 底物浓度对红豆蛋白水解度的影响
不同底物浓度对红豆蛋白水解度的影响见图3。
图3 不同底物浓度对红豆蛋白水解度的影响
Fig.3 Effects of different substrate concentrations on the degree of hydrolysis of red bean protein
由图3可知，随着底物浓度的增加，红豆蛋白水解度呈先升高后下降的趋势，且在底物浓度为5%时达到最高，水解效果最佳。可能是由于底物浓度加大，酶与底物充分接触的机会变多，蛋白的水解程度逐渐加深，但超过一定底物浓度后会对分子的碰撞和扩散产生一定的抑制作用，致使水解效率降低。因此，底物浓度为5%时为最佳的酶反应底物浓度。
2.3.3 加酶量对红豆蛋白水解度的影响
不同加酶量对红豆蛋白水解度的影响见图4。
图4 不同加酶量对红豆蛋白水解度的影响
Fig.4 Effect of different enzyme additions on the degree of hydrolysis of red bean protein
由图4可知，随着加酶量的升高，红豆蛋白的水解度呈先升高后趋于平缓的趋势，当加酶量为800U/g时，红豆蛋白的水解度最高，可能是由于加酶量的升高，酶可以更充分的水解底物，而后趋于平缓可能是由于特定的酶切位点与底物充分反应后，反应程度不会继续加深，因此选择800 U/g作为最佳的反应加酶量。
2.3.4 反应时间对红豆蛋白水解度的影响
不同反应时间对红豆蛋白水解度的影响见图5。
图5 不同反应时间对红豆蛋白水解度的影响
Fig.5 Effect of different reaction time on the degree of hydrolysis of red bean protein
由图5可知，随着反应时间延长红豆蛋白的水解度呈先升高后减缓的趋势，在反应5 h时红豆的蛋白水解度达到最大。可能是由于反应时间的延长，酶和底物充分反应，水解度升高。而后反应到一定时间后，蛋白底物的特定肽键减少致使水解度有减缓的趋势。因此5 h为双酶协同作用的最佳反应时间。
2.3.5 反应温度对红豆蛋白水解度的影响
不同反应温度对红豆蛋白水解度的影响见图6。
图6 不同反应温度对红豆蛋白水解度的影响
Fig.6 Effect of different reaction temperatures on the degree of hydrolysis of red bean protein
由图6可知，反应温度为52℃时，红豆蛋白的水解度最高，反应温度可以加速分子间的碰撞从而促进酶促效果，因此选择52℃作为最佳的双酶协同反应温度。
2.4 正交试验优化双酶协同反应工艺
正交试验结果见表3。
表3 正交试验结果
Table 3 Orthogonal test results
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续表3 正交试验结果
Continue table 3 Orthogonal test results
?
由表3可知，加酶量、底物浓度和反应时间对红豆蛋白水解度的影响程度为B＞A＞C（底物浓度＞加酶量＞反应时间），最佳加工工艺为A2B2C2，此时制备红豆蛋白肽的工艺为加酶量1 000 U/g、底物浓度5%、反应时间5h，水解度最高达27.5%。其中，在A1B2C2反应条件下测定水解度与A2B2C2相同，因此，考虑成本因素，在相同水解度下选择A1B2C2为最佳加工工艺，此时加酶量为800 U/g。在最优的作用条件下，复合酶协同作用的优势明显，可更充分地水解红豆蛋白。
2.5 红豆多肽的抗氧化活性
红豆多肽的自由基清除率见表4。
表4 红豆多肽的自由基清除活性
Table 4 Antioxidant activity of red bean polypeptide prepared
?
由表4可以看出，在最佳酶解条件下制备的红豆多肽，对于 DPPH 自由基、O2-·、·OH、ABTS+自由基均具有一定的清除能力，表现出较好的体外抗氧化活性。
3 结论
通过水解度的测定，选择碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶协同水解红豆蛋白。同时在单因素试验基础上，经正交试验得出双酶制备红豆多肽的最佳工艺为酶活比6 ∶4、反应 pH7.5、反应温度 52 ℃、加酶量 800 U/g、底物浓度5%、反应时间5 h。通过体外抗氧化性测定，本试验制备的红豆蛋白多肽显示出一定的抗氧化活性，为红豆蛋白综合利用提供理论基础。
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