萝卜红色素是一种从红心萝卜或红皮萝卜中提取出的可用作天然色素的葡萄糖苷衍生物[1]，由于其水溶性好可以很容易进入到食品体系中提供鲜艳的颜色，并且可以作为抗氧化剂、抗菌剂等发挥保健功效，因此常被应用于食品加工行业[2-3]。但由于萝卜在咀嚼或加工过程中，萝卜中的内源酶水解硫代葡萄糖苷会产生异味，这种异味限制了萝卜红色素在食品工业中的应用[4]。因此，研究萝卜红色素的高效脱异味技术迫在眉睫。
目前比较常见的脱味方法有理化脱味法和生物学脱味法[5-9]。权清转等[10]采用大孔吸附树脂吸附萝卜红色素中的异味。朱诗优等[11]采用超临界二氧化碳法成功脱除了萝卜红色素中的异味。Rodriguez-Saona等[12]采用透析技术脱除萝卜红色素的臭味。Kottman[13]用研磨法、蒸汽法与盐、酸加热处理相结合，提取萝卜红色素，虽然能明显减轻萝卜红色素的异味，但提取量较少。Gao等[14]发现壳聚糖吸附可以去除红萝卜中的异味。理化脱味法虽然脱味快，但存在应用范围较窄、脱味率低，脱味后萝卜红色素的提取率低、稳定性差，有时还会引入新的化学物质等问题[15-17]。生物学脱味法可分为酶解法和微生物脱味法，但添加酶制剂成本较高，且不能从根本上脱除异味[18]。微生物脱异味效果较好，还具有操作简单、成本低廉、不污染环境等优点[19-21]。
本研究以萝卜红色素为研究对象，从多种菌种中筛选能有效脱除萝卜红色素异味的功能性微生物，并以感官评价和萝卜红色素含量为指标，优化几种脱味菌种的复配比以及混菌发酵的脱味工艺条件。旨在建立一种新的减少或消除萝卜红色素异味的方法，以期为扩大萝卜红色素的应用范围提供技术支持，为萝卜红色素的工业化生产提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、米根霉（Rhizopus）、德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）：安琪酵母股份有限公司；黑曲霉（Aspergillus niger）-CMCC（F）98003：北京索莱宝科技有限公司；米曲霉（Aspergillus oryzae）：济宁玉园生物科技有限公司；腐乳毛霉（Mucor furu）：沂水锦润生物科技有限公司。
1.1.2 原料与试剂
胭脂萝卜、马铃薯：市售；MRS培养基：杭州百思生物技术有限公司；牛肉膏：北京奥博星生物技术有限公司；马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：青岛海博生物技术有限公司；琼脂粉：南京茂捷微生物科技有限公司；氯化钠（分析纯）：重庆川东化工集团有限公司；蛋白胨（分析纯）：上海博微生物科技有限公司；葡萄糖（分析纯）：成都市科隆化学品有限公司；氢氧化钠（分析纯）：重庆川东化工集团有限公司。
1.1.3 培养基
PDA培养基：马铃薯200 g，自来水1 000 mL，琼脂20 g，葡萄糖 20 g，pH 值调至 6.5，121 ℃灭菌 20 min[22]。
牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3 g，自来水1 000 mL，蛋白胨 10 g，氯化钠 5 g，琼脂 20 g，pH 值调至 7.3，121 ℃灭菌 20 min[22]。
发酵培养基：将胭脂萝卜捣碎后，5 000 r/min均质5 min，取匀浆液 100 g（胭脂萝卜 ∶蒸馏质量比=1 ∶1），121℃灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
EL204电子分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；T6紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；H30FK802-136高压蒸汽灭菌锅：东莞市星辰电器贸易有限公司；ZHJH-C1214C双人洁净工作台：上海智城分析仪器制造有限公司；UB1021正置生物显微镜：重庆澳浦光电技术有限公司；HHWSII-250恒温恒湿培养箱、HGZN-138电热恒温干燥箱：上海跃进医疗器械有限公司；SB-5200 DTD超声波清洗仪：宁波新芝生物科技有限公司；JX2598多功能食品加工机：台湾金熊电器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 微生物发酵法脱除萝卜红色素异味的工艺流程
菌种活化→菌悬液制备→扩大培养→筛选脱味菌种→菌种复配→发酵→萝卜红色素含量测定及感官评价
1.3.2 操作要点
1.3.2.1 菌种活化
将酿酒酵母、黑曲霉、米曲霉、米根霉、毛霉等真菌接种在PDA培养基上活化，乳酸菌属接种在MRS培养基活化；然后从生长真菌的PDA培养基上用接种环挑取一环菌种进行平板划线培养，于平板培养基中，30℃培养3 d[22]；保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌采用同样的方式，37℃培养3 d，直至长出肉眼可见的菌苔[23]。
1.3.2.2 菌悬液制备、扩大培养
将平板培养的酿酒酵母、黑曲霉、米曲霉、米根霉、毛霉用接种环挑取一环接入100 mL灭菌的PDA培养基中，于30℃培养2 d；乳酸菌属采用同样的方式接种到100 mL灭菌的MRS培养基中，37℃培养2 d[23]。做复配菌悬液时，将单菌液37℃培养2 d后，取适当的复配比例加入到99 mL PDA培养基中，在160 r/min、30℃下培养6 h[22]。
1.3.3 脱味菌种筛选试验
将酿酒酵母、黑曲霉、米曲霉、毛霉、米根霉、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌7种菌种按1%接种量接入发酵培养基，在发酵温度30℃、pH5.5、转速160 r/min的条件下，发酵24 h，然后测定萝卜红色素含量，结合萝卜红色素含量，以萝卜红色素异味的感官评分为主要指标，筛选出脱除异味最佳的4种菌株。
1.3.4 菌种复配正交试验
将筛选出脱味效果较好的4种菌株按照接种量0%、1%、2%接入发酵培养基中。以感官评分（权重0.5）和萝卜红色素总含量（权重0.5）的综合分数作为评价指标，在发酵温度30℃、发酵pH5.5、发酵时间24 h的条件下进行L9（34）正交试验[24]，筛选最佳的菌种复配比，因素水平见表1。
表1 菌种复配正交试验因素水平
Table 1 Levels and factors of orthogonal experiments of strain combination
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1.3.5 复配菌种发酵单因素试验
在复配菌种（酿酒酵母、黑曲霉、米曲霉菌液质量比为2∶2∶1）的总接种量为2%、发酵pH5.5、发酵温度30℃的条件下，考察发酵时间（24、36、48、60、72 h）对萝卜红色素感官评分和萝卜红色素含量的影响；在复配菌种（酿酒酵母、黑曲霉、米曲霉菌液质量比为2∶2∶1）的总接种量为2%、发酵温度30℃、发酵时间24 h的条件下，考察发酵液初始 pH 值（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5）对萝卜红色素感官评分和萝卜红色素含量的影响；在复配菌种（酿酒酵母、黑曲霉、米曲霉菌液质量比为2∶2∶1）的总接种量为2%、发酵pH5.5、发酵时间24 h的条件下，考察发酵温度（15、20、25、30、35℃）对萝卜红色素感官评分和萝卜红色素含量的影响；在发酵时间24 h、发酵pH5.5、发酵温度30℃的条件下，考察接种量（1%、2%、3%、4%、5%）对萝卜红色素感官评分和萝卜红色素含量的影响。以未发酵的萝卜浆的红色素作为对照组。
1.3.6 响应面试验
在单因素试验的基础上，以发酵温度、发酵时间、发酵pH值、接种量作为自变量，感官评分作为响应值，采用Design-Expert 8.0软件设计响应面试验，并最终确定最优的发酵工艺条件。其因素水平设计见表2。
表2 响应面试验因素水平
Table 2 Levels and factors of response surface experiments
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1.3.7 质量指标测定
1.3.7.1 感官评价
由17名食品相关专业学生对萝卜红色素的脱异味效果进行评价，最终分值为17名同学的平均值。具体评分标准见表3。
表3 萝卜红色素异味的感官评分标准
Table 3 Sensory evaluation of off-flavor of red radish pigment
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1.3.7.2 萝卜红色素含量的测定
胭脂萝卜红色素是一种花青素的葡萄糖苷生物[1]，参考Fuleki等[25]的pH示差法对胭脂萝卜红色素总含量进行测定，在该方法上略有修改。取胭脂萝卜发酵液20 mL，平均分装于两个烧杯中，分别用pH1.0和pH4.5的缓冲液稀释至50 mL，20℃～25℃下3 000 r/min离心10 min，取上清液，然后静置10 min，将溶液稀释10倍，在530 nm处测定其吸光度，计算得出萝卜红色素含量并进行比较，计算公式[26]如下。
式中：C为萝卜红色素含量，mg/g；A0和A1分别为pH1.0和pH4.5时色素在530 nm处的吸光度；V为提取液总体积，mL；n为稀释倍数；M为花青素相对分子质量，648.5；ε 为消光系数，30200；m 为样品质量，g。
1.4 数据处理
采用Excel和Design-Expert 8.0软件进行数据统计分析和作图。
2 结果与分析
2.1 菌种筛选试验结果
不同菌株脱味效果比较结果如图1所示。
图1 不同菌种对萝卜红色素异味和红色素含量的影响
Fig.1 Effect of different strains on off-flavor and content of red radish pigment
由图1可知，胭脂萝卜经过7种菌发酵后萝卜红色素均有不同程度的降解。在7种菌种中，经酿酒酵母发酵后，萝卜红色素降解最少；经米根霉发酵后，红色素降解最多。通过感官评价可知，米根霉发酵后，虽然萝卜红色素的损失最高，但其脱臭的效果最佳，几乎没有萝卜味和发酵味。经米曲霉发酵后的萝卜红色素损失相对较少，但感官评分不高。经黑曲霉发酵后，仅产生少许的发酵味，且萝卜红色素的损失量也较少。因此，黑曲霉适合于萝卜红色素的脱臭处理。经酿酒酵母发酵的萝卜红色素则是带有香甜的发酵味，随着酿酒酵母加入量的增加，其发酵味浓度呈现从淡到浓郁的趋势，该气味香甜、令人舒缓，符合萝卜红色素脱臭标准。而经保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和毛霉发酵，萝卜红色素的损失较少且无萝卜异味，但含有恶臭味，因此不适合萝卜红色素的脱臭。综上所述，根据萝卜红色素含量和脱臭效果的综合评定，本研究选择酿酒酵母、黑曲霉、米曲霉和米根霉作为复配菌株。
2.2 菌种复配正交试验
菌种复配正交试验结果如表4所示。
表4 菌种复配正交试验结果分析
Table 4 Results and analysis of t orthogonal experiments of strain combination
试验号 A酿酒酵母接种量B黑曲霉接种量C米曲霉接种量D米根霉接种量 综合评分1 1 1 1 1 2.760 2 1 2 2 2 3.524 3 1 3 3 3 3.425 4 2 1 2 3 3.867 5 2 2 3 1 3.926 6 2 3 1 2 4.025 7 3 1 3 2 4.271 8 3 2 1 3 3.885 9 3 3 2 1 4.278 K1 9.709 10.898 10.669 10.964 K2 11.818 11.335 11.669 11.433 K3 12.434 11.727 11.622 11.176 R 2.725 0.829 1.000 0.469
由表4可知，通过极差分析得到的最佳组合是A3B3C2D2，这与9次试验中的最高分数组合A3B3C2D1不一致。因此，需进行进一步验证试验，其结果见表5。
表5 验证试验
Table 5 Validation experiments
注：同列字母相同表示差异不显著（p＞0.05）。
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由表4可知，两个组合的感官评分差异不显著（p＞0.05），但组合A3B3C2D1的萝卜红色素含量更高。同时，从节约成本等方面综合考虑，最佳菌种复配比为A3B3C2D1，即混合菌株的质量比为2∶2∶1∶0。
2.3 发酵单因素试验
2.3.1 发酵时间对萝卜红色素感官评分和萝卜红色素含量的影响
发酵时间对萝卜红色素感官评分和含量的影响见图2。
图2 发酵时间对萝卜红色素感官评分和含量的影响
Fig.2 Effect of fermentation time on sensory score and content of red radish pigment
由图2可知，发酵时间为60 h时，萝卜红色素含量最高；发酵时间为48 h时，感官评分最高。当发酵时间小于48 h，菌种可能处于生长繁殖阶段，主要是个体和菌体数量的增长，缺少降解臭味物质的相关酶的产生，所以脱臭效果不佳；同时，可能有部分萝卜红色素仍然存留在细胞内，没有充分释放出来，所以萝卜红色素含量低。当发酵时间达到48 h时，可能菌种处于稳定期，这个阶段会产生各种酶，如纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等，在各种酶的协同作用下，产生萝卜异味的有机物发生分解，使萝卜红色素的异味大大减少[16]，并且这个阶段会使细胞进一步分解破裂而释放出更多的萝卜红色素。发酵时间超过60 h，感官评分和萝卜红色素含量略有下降，其主要原因是：一方面由于菌种数目增多，菌体生长缺乏营养，会消耗一定量的萝卜红色素，同时发酵会产生一些新的代谢产物，产生发酵味，从而影响萝卜红色素的感官评分。因此，后续响应面试验的发酵时间选择为48、60、72 h。
2.3.2 发酵温度对萝卜红色素感官评分和萝卜红色素含量的影响
发酵温度对萝卜红色素感官评分和含量的影响见图3。
图3 发酵温度对萝卜红色素感官评分和含量的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on sensory score and content of red radish pigment
由图3可知，发酵温度为30℃时，感官评分最高，脱除异味的效果最佳，但萝卜红色素含量最低。当发酵温度为20℃时，温度较低，菌种生长缓慢，所以脱臭效果也不理想，但对萝卜红色素含量影响较小。当发酵温度为35℃时，萝卜红色素的感官评分有所降低，但萝卜红色素的含量有所上升，可能是因为提高发酵温度有利于细胞内萝卜红色素的释放。因此，综合考虑生产成本、萝卜红色素含量和异味脱除效果，响应面试验的发酵温度选择为25、30、35℃。
2.3.3 发酵pH值对萝卜红色素感官评分和萝卜红色素含量的影响
发酵pH值对萝卜红色素感官评分和含量的影响见图4。
图4 发酵pH值对萝卜红色素感官评分和含量的影响
Fig.4 Effect of fermentation pH on sensory score and content of red radish pigment
由图4可知，在pH4.5时，萝卜红色素含量和脱除异味的感官评分均为最佳，这可能是由于pH值会影响总硫代葡萄糖苷的含量，而硫代葡萄糖苷是异味物质的前体，当pH值达到4.5时，硫代葡萄糖苷会明显减少，所以异味降低，这与陈文田[27]、Chen等[28]的研究结果一致。综合萝卜红色素含量和感官评分的考虑，响应面试验pH值选择为4.5、5.0、5.5。
2.3.4 菌种接种量对萝卜红色素感官评分和含量的影响
菌种接种量对萝卜红色素感官评分和含量的影响见图5。
图5 接种量对萝卜红色素感官评分和含量的影响
Fig.5 Effect of inoculation amount on sensory score and content of red radish pigment
由图5可知，随着接种量的增加，感官评分逐渐下降。当接种量达2%时，萝卜红色素总含量较高，脱臭效果较好。说明在该条件下，不仅能有效脱除萝卜红色素的异味，且对萝卜红色素含量影响最小。当接种量为5%时，虽然萝卜红色素含量最高，但感官评分最低，这是由于发酵过度容易产生新的代谢产物，这些代谢产物带来新的异味。因此，综合经济效益、萝卜红色素含量和脱臭效果，响应面试验接种量选择为1%、2%、3%。
2.4 响应面试验
2.4.1 响应面试验结果分析
响应面试验方案及结果见表6，方差分析见表7。
表6 响应面设计与结果
Table 6 Design and results of response surface experiments
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表7 响应面回归方程方差分析
Table 7 Response surface regression equation analysis of variance
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续表7 响应面回归方程方差分析
Continue table 7 Response surface regression equation analysis of variance
注：**表示影响极显著（p＜0.01）；*表示影响显著（p＜0.05）。
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经过Design-Expert 8.0软件对回归模型的分析，萝卜红色素感官评分与发酵时间、发酵温度、发酵pH值和菌种接种量之间的回归二次方程：y=8.75-0.005 556A-0.13B+0.017C-0.20D+0.27AB-0.27AC-0.083AD-0.20BC-0.1BD-0.025CD-0.36A2-0.53B2-0.71C2-0.52D2。由表7可知，模型的p＜0.01，说明该模型具有统计学意义；而失拟项p值为0.791＞0.05，差异不显著，则说明试验中的该回归方程误差较小；R2=0.982 1，说明该模型的拟合度较好，可有效预测脱除异味的感官评分变化情况，进而验证工艺的准确性。由F值的大小可知，各因素对于萝卜红色素异味的脱除影响大小次序为D＞B＞C＞A，即接种量＞发酵时间＞发酵pH 值＞发酵温度，其中一次项 B、D，二次项 A2、B2、C2、D2，交互项AB、AC、BC对于萝卜红色素异味脱除效果的影响极显著（p＜0.01），交互项BD对萝卜红色素异味脱除效果的影响显著（p＜0.05）。在p=0.05的水平下去除不显著的项目，得到回归方程：Y=8.75-0.13B-0.20D+0.27AB-0.27AC-0.20BC-0.1BD-0.36A2-0.53B2-0.71C2-0.52D2。
2.4.2 交互作用分析
交互作用结果见图6～图9。
图6 发酵时间和发酵温度对萝卜红色素异味脱除效果的影响
Fig.6 Effect of fermentation time and fermentation temperature on deodorization of red radish pigment
图7 发酵温度和pH值对萝卜红色素异味脱除效果的影响
Fig.7 Effect of fermentation temperature and pH on deodorization of red radish pigment
图8 发酵时间和接种量对萝卜红色素异味脱除效果的影响
Fig.8 Effect of fermentation time and inoculation amount on deodorization of red radish pigment
图9 发酵时间和pH值对萝卜红色素异味脱除效果的影响
Fig.9 Effect of fermentation time and pH on deodorization of red radish pigment
由图6～图9可知，坡度越陡峭，表明响应值对于发酵条件的改变越敏感，该因素对异味脱除效果的影响越大；反之则表明该因素对异味脱除效果的影响越小[29]。在交互项对异味脱除效果的影响中，发酵温度与发酵时间、发酵温度与发酵pH值、发酵时间与接种量和发酵时间与发酵pH值之间交互作用明显，其他因素之间交互作用不明显，这与方差分析的结果相吻合。
2.5 验证试验结果
经Design-Expert 8.0分析可知，萝卜红色素异味脱除的最佳工艺参数：发酵温度29.747℃、发酵时间58.519 h、发酵pH5.021、菌种接种量1.824%，在此条件下，感官评分为8.70。为方便实际操作，将发酵条件调整为发酵温度30℃、发酵pH5.0、发酵时间60 h、菌种接种量2%。按此工艺进行3次平行验证试验，感官评分为8.70±0.07，与预测值相差不大，说明优化的工艺条件比较可靠。该条件下提取的萝卜红色素色泽鲜艳，无萝卜异味，伴有轻微的香甜发酵味，萝卜红色素含量为0.022 mg/g。
3 结论与展望
胭脂萝卜中的天然色素含量高，且较为稳定，是天然色素的重要来源。但萝卜红色素的异味却限制了其在食品中的应用。以萝卜红色素为研究对象，通过单因素试验从7种菌（酿造酵母、黑曲霉、米曲霉、米根霉、毛霉、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌）中，筛选出了4种（酿造酵母、黑曲霉、米曲霉、米根霉）脱异味效果较好的菌株，并通过正交试验对其混合比例进行优化，获得酿造酵母、黑曲霉、米曲霉与米根霉的最佳质量比为2∶2∶1∶0。通过响应面试验，获得最优发酵条件：发酵时间60 h、发酵温度30℃、发酵pH5.0、接种量2%。在该工艺下，萝卜红色素的感官评分为8.70±0.07，萝卜红色素的含量为0.022 mg/g。本研究为脱除萝卜红色素异味提供了一种新的思路，该方法成本低廉、操作方便、易于工业化生产，有利于扩大萝卜红色素的应用范围，为萝卜红色素的工业化生产提供方法指导和理论基础。
虽然本研究筛选出了能有效脱除萝卜红色素中异味的菌株，并获得了其最佳质量比、优化了发酵条件，但还需进一步探明混菌发酵法脱除萝卜红色素异味的代谢机制。另外，混菌发酵虽然有利于萝卜红色素异味的脱除，但也会在一定程度上影响萝卜红色素的提取量，所以探究一种既不影响萝卜红色素提取量，又能高效脱除萝卜红色素异味的混菌发酵方式将是今后研究的重点。
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