面包是一种通过微生物发酵加工的食品，更加符合欧洲、北美、南美、澳洲等地的饮食习惯，是日常碳水化合物的主要食物来源。在我国以面包作为主食的饮食习惯正在逐步养成。近年来，临床研究发现部分人群中体内因含有抗酿酒酵母抗体（anti-Saccharomyces cerevisiae antibodies，ASCA）造成酵母不耐症[1]。ASCA是一种由磷酸肽类甘露聚糖引起的特异性血清反应性抗体，酿酒酵母的细胞壁含有大量的甘露糖分子，从而引起抗体的产生[2]。已有研究表明ASCA阳性与肠道通透性增加有关[3]，该抗体能够鉴别诊断肠道自身免疫过程引起的克罗恩病，成为克罗恩病的预测指标以及患病程度的评估标志物[4-5]。这种免疫反应会导致患者出现腹痛和腹泻等不良症状[6]，严重者甚至还会导致慢性肠衰竭[7]。为了避免酵母不耐症患者食用含酵母的面包造成免疫反应，亟需发现一种可代替面包酵母的食品级安全菌株应用于发酵面包。
运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）是革兰氏阴性、兼性厌氧菌，多呈杆状或成对存在。运动发酵单胞菌能利用葡萄糖、果糖、蔗糖通过Entner-Doudoroff途径发酵产生酒精和CO2[8]，而且它被美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）认证为“一般公认安全”菌株，能安全用于食品领域[9]。运动发酵单胞菌具有许多独特的生理特性和优良的工业生产特性，如高糖吸收率[10]、高乙醇产量[11]和良好的环境适应性[12]，且在酿造和发酵工业中显示出与酵母相当的优势[13]。
运动发酵单胞菌代替酵母加入到面包的工艺制作中，既丰富焙烤产品的种类，又可避免面包酵母不耐患者产生不良症状。本研究以运动发酵单胞菌作为发酵菌株，将食盐、蔗糖添加量和发酵时间作为变量，以单因素试验为基础，进行响应面优化设计试验，通过感官评分确定运动发酵单胞菌发酵面包的最佳工艺。以期开发出可为酵母不耐症患者提供替代选择的面包产品，从而为运动发酵单胞菌在食品工业中的综合利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
运动发酵单胞菌：农业农村部沼气科学研究所生物质能实验室诱变获得；高筋面包粉：新乡市新良粮油加工有限责任公司；白砂糖：广州福正东海有限公司；食盐：中盐上海市盐业有限公司；脱脂奶粉、黄油：恒天然商贸（上海）有限公司；酵母：安琪酵母股份有限公司；鸡蛋：市售。
厨师机（ZG-LZ358）：中山市灿欣制品有限公司；电烤箱（Hauswirt C40）：青岛汉尚电器有限公司；电子天平（AL104）、pH 计（FE28）：梅特勒-托利多仪器有限公司；微波炉（M1-L213B）：广东美的厨房电器制造有限公司；质构仪（TVT6700）：波通瑞华科学仪器北京有限公司；恒温培养箱（DH-500AB）：北京中兴伟业世纪仪器有限公司；磁力搅拌器（KMS-141E）：精凿科技（上海）有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 基础配方
运动发酵单胞菌面包：100 g高筋面包粉、8 g脱脂奶粉、8 g黄油、12 g鸡蛋、58 mL 水、5 g蔗糖、0.5 g食盐、运动发酵单胞菌接种量108CFU/g。
酵母菌面包：100 g高筋面包粉、8 g脱脂奶粉、8 g黄油、12 g鸡蛋、58 mL 水、5 g蔗糖、0.5 g食盐、酵母菌接种量108CFU/g。
1.2.2 工艺流程及操作要点
工艺流程：原料混合→面团搅拌→发酵→分割滚圆→排气整形→二次醒发→烘烤→冷却→成品。
面团搅拌：将除黄油外的所有原辅料加入厨师机中慢速搅拌1 min，再快速搅打面团10 min至扩展阶段，之后加入黄油快速搅打15 min至面团表面光洁，断裂处无锯齿状痕迹，手感柔和，可拉至均匀薄膜即可[14]。
发酵：将面团表面整理光滑，分别放入发酵盒中置于30℃发酵箱发酵120 min。
分割滚圆：将发酵好的面团分割为每份250 g的面团，搓圆整形，盖上保鲜膜松弛10 min。
排气整形：将面团稍作揉搓排气，压扁后折叠起来，静置10 min后再擀平并卷起成型，放入吐司盒中。
二次醒发：面团放入温度37℃、相对湿度80%的发酵箱中醒发，面团占容器体积80%后加盖。
烘烤：将发酵好的面团放入提前预热（165℃）的烤箱中（上火175℃、下火165℃）烘烤35 min。
冷却：烤制好的面包在室温（20℃）下冷却2 h后装入保鲜袋密封保存。
1.2.3 单因素试验
按照1.2.2工艺流程，以感官评分为指标，分别考察发酵时间、食盐添加量、蔗糖添加量对面包品质的影响。
1）固定蔗糖添加量为5%，食盐添加量为0.5%，考察不同发酵时间（1、2、3、4、5、6 h）对面包品质的影响。
2）固定发酵时间为3 h，食盐添加量为0.5%，考察不同蔗糖添加量（1%、5%、10%、15%、20%、25%）对面包品质的影响。
3）固定发酵时间为3 h，蔗糖添加量为15%，考察不同食盐添加量（0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）对面包品质的影响。
1.2.4 响应面试验
在单因素试验基础上，以感官评分为响应值，利用Design-Expert 13软件进行响应面优化试验，响应面试验因素与水平设计见表1。
表1 Box-Behnken试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiment
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1.2.5 指标测定
1.2.5.1 感官评价
邀请10人～15人对成品面包进行品尝，参考GB/T20981—2021《面包质量通则》中关于面包感官的要求和评价方法，分别对面包的形态、色泽、气味等进行打分，去掉最低分及最高分后取平均值。感官评分标准见表2。
表2 感官评分标准
Table 2 Standard of sensory evaluation
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1.2.5.2 质构特性的测定
将成品面包分割为厚12 mm的面包片，采用TVT 6700质构仪测定其质构特性，测定条件：P/36R探头，质地剖面分析（texture profile analysis，TPA）模式，测前速度1.0 mm/s，测试速度1.5 mm/s，测后速度5.0 mm/s，探入深度50%，自动触发，触发力为5 g，重复测定2次，间隔5 s。每次测量3个平行样，结果取平均值。
1.2.5.3 面包比容的测定
参考宋志强等[15]的测定方法，利用小米填充法测量面包体积，重复3组并取平均值。按照下列公式计算面包的比容。
式中：P 为面包比容，mL/g；V 为面包体积，mL；m为面包质量，g。
1.2.5.4 面包pH值及酸度的测定
参考GB/T 20981—2021《面包质量通则》：称取10 g面包芯，加入90 mL超纯水，用磁力搅拌器高速搅拌2 min，静置10 min后用两层纱布过滤，取清液用pH计测定pH值。
另取10 mL清液于锥形瓶中，加入3滴～5滴酚酞试剂，用0.1 mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至微红色且30 s不褪色，记录消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，同时用蒸馏水做空白试验，重复3组并取平均值。按照下列公式计算面团的酸度。
式中：X为试样的酸度，°T；c为氢氧化钠标准滴定溶液的浓度的准确数值，mol/L；V1为滴定试液时消耗氢氧化钠标准液的体积，mL；V2为空白试液时消耗氢氧化钠标准液的体积，mL；m为取样面团或面包芯质量，g。
1.2.5.5 理化指标测定
酸价测定参考GB 5009.229—2016《食品安全国家标准食品中酸价的测定》中的冷溶剂指示剂滴定法测定；过氧化值参考GB 5009.227—2016《食品安全国家标准食品中过氧化值的测定》中的滴定法测定。
1.2.5.6 微生物指标测定
菌落总数按照GB 4789.2—2022《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》测定；大肠菌群按照GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》中的平板计数法测定；霉菌按照GB 4789.15—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》中的方法测定。
1.3 数据处理
采用Design-Expert 13和IBM SPSS Statistics 26软件进行数据处理和分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 不同发酵时间对面包感官评分的影响
不同发酵时间对面包感官评分的影响见图1。
图1 发酵时间对面包品质的影响
Fig.1 Effect of leavening time on bread quality
由图1可知，发酵时间在1 h～3 h，面包的感官评分随时间延长逐渐增大；发酵时间由3 h增加到6 h，面包的感官评分逐渐减小，发酵时间为3h时感官评分达到最高（P＜0.05）；运动发酵单胞菌以蔗糖为底物发酵时，代谢CO2的同时依然有70%的乙醇转化效率[16]，强烈酒精气味影响其感官评分。当发酵时间为3 h时，面包具有较为完整的外形，色泽金黄、内部组织细腻有弹性，感官评分最高。因此，选择发酵时间为2、3、4 h进行响应面优化。
2.1.2 不同蔗糖添加量对面包感官评分的影响
不同蔗糖添加量对面包感官评分的影响见图2。
图2 蔗糖添加量对面包品质的影响
Fig.2 Effect of sucrose on bread quality
由图2可知，随着蔗糖添加量的增加，感官评分先增大后减小。这可能是因为蔗糖一方面起到风味调节的作用，另一方面作为运动发酵单胞菌生长代谢过程的主要碳源，影响了其代谢生产CO2的能力，从而影响了面包的蓬松度及弹性。当蔗糖添加量低于15%时，面包蓬松度较低、弹性较差、甜度不够，感官评分较低；当蔗糖添加量超过15%时，面包的甜腻感较重，不符合大众口味；当蔗糖添加量为15%时，面包甜度适中、色泽均匀、松软适口，感官评分达到最高。因此，选择蔗糖添加量为10%、15%、20%进行响应面优化。
2.1.3 不同食盐添加量对面包感官评分的影响
食盐能够中和面包的甜腻感，调节风味，还能使面包的内部组织更加致密，但是高盐造成的渗透压会使面包的发酵滞后[17]。食盐添加量对面包感官评分的影响见图3。
图3 食盐添加量对面包品质的影响
Fig.3 Effect of salt on bread quality
由图3可知，食盐添加量小于1.0%时感官评分呈增大趋势，大于1.0%后呈减小趋势，但是该趋势变化较小，差异不显著。研究发现，当食盐添加量大于2.5%时，对运动发酵单胞菌的生长发酵造成较明显的影响[18]，从而影响面包的体积变化。在食盐添加量为1.0%时，感官评分最高，面包内部组织细腻有弹性，气孔较小并且分布均匀，风味柔和，口感适口。因此，选取食盐添加量为0.5%、1.0%、1.5%进行响应面优化。
2.2 响应面试验结果
2.2.1 响应面试验设计与结果
在单因素试验基础上，确定中心点及水平，使用Design-Expert 13软件进行Box-Behnken试验设计，确定其最佳工艺，结果见表3。
表3 响应面试验设计与结果
Table 3 Response surface test design and results
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续表3 响应面试验设计与结果
Continue table 3 Response surface test design and results
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根据Design-Expert 13软件对表3进行回归分析，将表3中所有的数据结果进行多元回归分析，建立二阶回归模型，得到3个因素对感官评分（Y）回归方程为Y=92.30+3.84A+2.01B-0.97C+0.075AB-0.100AC-0.15BC-4.54A2-9.04B2-1.06C2。
2.2.2 响应面回归模型方差分析
通过Design-Expert 13软件进行方差分析，结果见表4。
表4 回归模型方差分析
Table 4 Analysis of variance for the regression model
注：*表示影响显著（P＜0.05）；**表示影响极显著（P＜0.01）。
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由表4可知，该二次模型P＜0.000 1，表明模型极显著。失拟项P=0.397 8＞0.05表明失拟不显著，说明该模型误差小。确定系数R2=0.990 9，R2Adj=0.979 1，说明模型拟合度较高，仅有2.09%的情况无法用该模型解释，可以用该方程代替运动发酵单胞菌面包工艺真实试验进行预测分析。其中A、B、A2、B2影响极显著（P＜0.01）；C、C2影响显著（P＜0.05）；其余因素影响不显著。根据F值的大小，试验范围内各因素的影响大小依次为A（发酵时间）＞B（蔗糖添加量）＞C（食盐添加量）。
基于回归模型方差分析结果，利用Design-Expert 13软件绘出响应面及等高线，反映各个变量对响应值交互效应的强弱程度及其对感官评分的影响[19]。各因素交互作用响应面及等高线见图4。
图4 各因素的交互作用对运动发酵单胞菌面包感官评分影响的响应面
Fig.4 Response surface diagram of interaction of various factors on sensory score of Z.mobilis bread
由图4可知，响应面均开口向下，响应值均出现先增加后减少的趋势，即在试验范围内存在稳定点。响应曲面坡度趋势平缓，等高线偏圆，表明发酵时间（A）、蔗糖添加量（B）和食盐添加量（C）各因素的交互作用相对较弱，与方差分析结果一致。
2.2.3 响应面最优解验证试验
根据响应面模型进行运动发酵单胞菌发酵面包工艺分析预测，得到最佳工艺参数：发酵时间为3.43 h，蔗糖添加量为15.58%，食盐添加量为0.76%，此时的理论响应值最大为93.48。采用上述最优条件进行验证试验，同时考虑实际情况，将工艺条件修正为发酵时间3.40 h、蔗糖添加量15.60%、食盐添加量0.80%，3次重复试验实际测得感官评分为92.78，相对误差为0.75%。因此采用响应面优化运动发酵单胞菌发酵面包的回归方程拟合良好，获得的优化工艺参数准确可靠。
2.3 运动发酵单胞菌面包的理化性质结果
按照最佳工艺参数制作的运动发酵单胞菌面包，理化性质测定结果如表5所示。
表5 运动发酵单胞菌面包与酵母面包的理化性质对照
Table 5 Comparison of physical and chemical properties between Z.mobilis bread and yeast bread
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由表5可知，与酵母面包相比，运动发酵单胞菌面包的比容较小，说明在添加蔗糖的情况下，单一运动发酵单胞菌代替酿酒酵母发酵面包是可以实现的；水分含量比酵母面包高出1.63%，面包组织松软湿润，这可能是由于其副产物果聚糖的合成[20]，提高了面团的保水性[21]；酸价及过氧化值之间的差异较小，说明用于制作面包的脂肪品质较好，新鲜度高；酸度和pH值之间存在差异，说明运动发酵单胞菌面包中的酸性物质较多，可能是因为运动发酵单胞菌面包的发酵过程延长导致产生了更多的酸性物质，如乳酸[22]、葡萄糖酸[23]及琥珀酸[24]等。综上，运动发酵单胞菌面包具有良好的烘焙品质。
2.4 运动发酵单胞菌面包的质构特性结果分析
质构特性能够反映面包的品质，按照响应面得出的最佳工艺参数制作运动发酵单胞菌面包，测定其硬度、弹性、内聚性等质构指标，并与市售的吐司面包进行对比，分析结果如表6所示。
表6 运动发酵单胞菌面包与酵母面包的质构特性分析对比
Table 6 Comparison of texture analysis between Z.mobilis bread and yeast bread
注：同列不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
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由表6可知，与酵母面包相比，运动发酵单胞菌面包的硬度、胶着性、咀嚼度均较低，口感柔软度较好；而其弹性和内聚性较高，口感细腻度更佳。总体来看，运动发酵单胞菌面包的品质优于酵母面包。推测其质构品质提高可能是由于运动发酵单胞菌以蔗糖为底物发酵时，能够合成并分泌胞外多糖果聚糖，研究表明面包中添加适当浓度的果聚糖能够提高面包的柔软度[25]。但运动发酵单胞菌面包与市售吐司面包之间仍有差距。
2.5 运动发酵单胞菌面包的微生物指标测定结果
微生物指标是衡量食品安全的重要指标，按照最佳工艺参数制作的运动发酵单胞菌面包的微生物指标结果如表7所示。
表7 运动发酵单胞菌面包与酵母面包的微生物指标检测结果
Table 7 Results of microbial index test between Z.mobilis bread and yeast bread
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由表7可知，运动发酵单胞菌面包检测结果均符合GB 7099—2015《食品安全国家标准糕点、面包》中的要求，可安全食用。
3 结论
通过单因素试验结果结合响应面法优化设计，得到运动发酵单胞菌发酵面包的最佳生产工艺参数为发酵时间3.40 h、蔗糖添加量15.60%、食盐添加量0.80%。在此最佳参数下制作的运动发酵单胞菌面包的感官评分为92.78，与理论值相对误差为0.75%。该成品面包具有良好的烘焙品质，并且符合国家标准。
此产品为酵母不耐症患者提供了替代选择，丰富了面包产品的产品多样性，并且为运动发酵单胞菌在食品工业中的综合利用提供了参考。
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