西梅（Prunus domestica L.）是蔷薇科李属落叶乔木，属于李子的一种[1]。西梅别称欧洲李，原产亚洲西部和欧洲，近年来我国主要栽培于新疆喀什、阿克苏和甘肃河西等地[2]。西梅果实中富含维生素[3]、有机酸[4]、膳食纤维[5]、矿物质[6]等营养成分且口感和风味独特，有着“奇迹水果”的美誉，被称为第三代功能性水果[7]。
西梅属于典型的呼吸跃变型果实[8]，采后由于果实自身不断进行呼吸作用，导致果实迅速衰老软化，影响商品价值和营养价值。目前我国西梅的加工方式主要以果脯、罐头果酱等产品为主[9]，西梅在深加工方面有极大的前景，其中，膳食纤维（dietary fiber，DF）因特有的膨胀力、持油力和持水力等作用，在预防人体肥胖、降脂、维持肠道健康方面作用突出。膳食纤维根据溶解性分为两类，即不溶性膳食纤维（insoluble dietary fiber，IDF）和可溶性膳食纤维（soluble dietary fiber，SDF）。膳食纤维的提取方法主要有化学法（酸法、碱法）、物理法、生物法（发酵法、酶法）和联合提取法等。各种提取方法各有优缺点。同时，不同的提取方法可能会影响膳食纤维的结构组成，从而影响膳食纤维的功能和理化性质[10]。因此，多种方法联合提取在最大限度保证膳食纤维品质的同时有着较高的提取率[11]。本研究以次等西梅果实为对象，在考察料液比、超声时间与复合酶添加量等单因素基础上，采用响应面法优化西梅SDF提取工艺，对提取的西梅SDF理化性质和抗氧化性能进行测定，为西梅果实膳食纤维的提取及综合利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜西梅：采摘于新疆阿拉尔市十二团果园，品种为法兰西。
耐高温α-淀粉酶（4 000 U/g）：北京索莱宝科技有限公司；木瓜蛋白酶（10万 U/g）、糖化酶（10万 U/g）：上海源叶生物科技有限公司；花生油：山东鲁花集团有限公司。
1.2 仪器与设备
EMS-200数显超级恒温水浴锅：金坛市科顺仪器厂；PHS-2F精密pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；GZX-9240 MBE电热鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司；XS-04高速粉碎机：兆申科技有限公司；JP-060S数控型超声波清洗器：深圳市洁盟清洗设备有限公司；SynergyH1多功能酶标仪：美国BioTek公司；UV-2450紫外分光光度计：日本岛津公司；Pilot3-6M真空冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；TGL-208高速离心机：上海安亭科学仪器厂。
1.3 试验方法
1.3.1 原料预处理
西梅洗净去核，打浆成西梅渣，均匀平铺于托盘中，放置于60℃电热鼓风干燥箱中干燥，粉碎过60目筛，得到的西梅粉密封后置于4℃冷藏备用。
1.3.2 西梅水溶性膳食纤维的制备流程
称取5.0 g西梅粉，按料液比1∶15（g/mL）加入蒸馏水溶解，在60℃、超声功率360 W条件下超声水浴1 h。调节pH值至5，加入2.5%复合酶[酶添加量按西梅粉质量计，耐高温α-淀粉酶∶糖化酶=1∶3（质量比）]，在60℃条件下恒温水浴3.5 h去除淀粉，煮沸灭酶10 min。调节pH值至6，加入0.8%木瓜蛋白酶，在55℃条件下恒温水浴3 h去除蛋白，煮沸灭酶10 min。将西梅酶解液在5 000 r/min条件下离心10 min，抽滤收集上清液。取上清液于旋蒸仪旋蒸至1/4体积后加入4倍体积95%乙醇，在4℃条件下静置12 h后抽滤，收集絮状沉淀。真空冷冻干燥得到西梅SDF。
1.3.3 水溶性膳食纤维提取率
参考王海娟等[12]的方法，SDF提取率的计算如公式（1）所示。
式中：m1为干燥后水溶性膳食纤维的质量，g；m0为西梅粉的质量，g。
1.3.4 单因素试验
根据预试验确定复合酶组成及添加量，以耐高温α-淀粉酶∶糖化酶=1∶3（质量比）的比例组成。按照1.3.2的提取方法，以西梅SDF提取率为指标，分别探讨料液比、超声时间、超声温度、复合酶pH值、复合酶添加量、复合酶水浴温度、复合酶水浴时间各因素对西梅粉中SDF提取率的影响。料液比分别设定为1∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL）；超声时间分别设定为30、60、90、120、150 min；超声温度分别设定为 40、45、50、55、60 ℃；复合酶 pH 值分别设定为 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0；复合酶添加量分别设定为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%；复合酶水浴温度分别设定为 45、50、55、60、65 ℃；复合酶水浴时间分别设定为 90、120、150、180、210 min。
1.3.5 Box-Behnken试验设计
在单因素试验基础上，确定A料液比、B超声时间、C复合酶添加量3个因素为自变量，以西梅SDF的提取率为响应值，根据中心组合设计原理，设计响应面分析试验，其因素水平编码见表1。
表1 Box-Behnken设计因素水平编码
Table 1 Box-Behnken design factor level and coding
?
1.3.6 西梅SDF理化性质测定
1.3.6.1 持水力测定
参考黄六容等[13]的方法，准确称量0.3 g西梅SDF样品，加5 mL水后振荡均匀，在37℃水浴中搅拌30 min，4 000 r/min离心15 min，弃去上层液体，对固体部分进行称量，按照公式（2）计算西梅SDF的持水力。
式中：M0为西梅SDF样品干重，g；M1为吸水后西梅SDF的质量，g。
1.3.6.2 持油力测定
基于郭京京等[14]的方法做出适量改动，准确称取0.5 g西梅SDF样品，加5 g花生油后振荡均匀，在37℃水浴搅拌30 min。4 000 r/min离心15 min后弃去上层花生油，对固体部分进行称量，按照公式（3）计算西梅SDF的持油力。
式中：M0为西梅SDF样品干重，g；M1为结合油后西梅SDF的质量，g。
1.3.6.3 膨胀力测定
准确称量1.0 g西梅SDF样品，放置于50 mL量筒中，加入纯净水30 mL，充分混合后，记录初始刻度。在4℃下放置24 h，记录西梅SDF吸水体积膨胀后对应的刻度。按照公式（4）计算西梅SDF的膨胀力。
式中：M0为试验所用西梅SDF的干重，g；V1为西梅SDF吸水膨胀后体系所对应的体积，mL；V0为体系的初始体积，mL。
1.3.6.4 溶解性的测定
参考赵文婧等[15]的方法，称取0.5 g西梅SDF，置于50 mL烧杯中，加入30 mL蒸馏水，25℃水浴搅拌30 min，5000r/min离心15min，将上清液移入烧杯中，在105℃烘箱中烘干，按公式（5）计算西梅SDF的溶解性。
式中：M1为上清液干燥后固形物质量，g；M0为西梅SDF样品干重，g。
1.3.7 西梅SDF的抗氧化性测定
1.3.7.1 DPPH自由基清除能力的测定
参考Qiao等[16]的方法并稍作改动。取不同浓度（0.25 mg/mL～2.00 mg/mL）的西梅SDF样液于酶标板中，加入285 μL DPPH样液，在25℃室温下避光反应30 min，使用酶标仪于517 nm处测定吸光度，以VC作为阳性对照，以蒸馏水为空白对照。DPPH自由基清除率的计算公式如公式（6）所示。
式中：A1为DPPH溶液和不同浓度西梅SDF样液或VC混合溶液的吸光度；A2为无水乙醇和不同浓度的西梅SDF样液或VC混合溶液的吸光度；A0为DPPH溶液和蒸馏水混合溶液的吸光度。
1.3.7.2 ABTS+自由基清除能力的测定
参考 Dudonné等[17]的方法，取 15 μL 不同浓度（0.25 mg/mL～2.00 mg/mL）的西梅SDF样液于酶标板中，加入285 μL ABTS溶液，在25℃室温下避光反应30 min，使用酶标仪于734 nm处测定吸光度。以VC作为阳性对照，以蒸馏水为空白对照。ABTS+自由基清除率的计算公式如公式（7）所示。
式中：A1为ABTS溶液和不同浓度西梅SDF样液或VC混合溶液的吸光度；A2为无水乙醇和不同浓度的西梅SDF样液或VC混合溶液的吸光度；A0为ABTS溶液和蒸馏水混合溶液的吸光度。
1.3.7.3 ·OH清除能力的测定
参考王天等[18]的方法，取 150 μL不同浓度（0～2.0 mg/mL）的西梅SDF样液于酶标板，依次加入50 μL 9 mmol/L FeSO4、50 μL 9 mmol/L 水杨酸-乙醇和 50 μL 0.03%的过氧化氢。混匀于37℃恒温干燥箱中反应60 min，使用酶标仪于510 nm处测定吸光度。以VC作为阳性对照，以蒸馏水为空白对照。·OH清除率的计算公式如公式（8）所示。
式中：A1为蒸馏水替代过氧化氢溶液的吸光度；A2为蒸馏水替代水杨酸-乙醇的吸光度；A0为蒸馏水替代样品液的吸光度。
1.4 数据统计与处理
数据采用3次重复试验取平均值，数据经Excel 2016统计处理，用Origin 8.0软件绘图，采用SPSS 21进行显著性分析，方差分析中P＜0.05为差异显著。
2 结果与分析
2.1 西梅SDF提取单因素试验
2.1.1 料液比对西梅SDF提取率的影响
料液比对西梅SDF提取率的影响见图1。
由图1可知，西梅SDF提取率随溶剂体积的增加呈先上升后下降趋势，当料液比为1∶20（g/mL）时，西梅SDF提取率最高，达13.55%。适当的料液比能使酶与底物得到充分的反应，从而影响西梅SDF的提取率[19]。当酶和底物充分接触，溶剂体积的增加导致SDF提取率降低，可能是溶剂体积的增加影响了西梅原料对超声波的吸收，且酶浓度的降低导致其与物料接触不充分，降低了提取率。因此，选择料液比1∶20（g/mL）较为适宜。
图1 料液比对西梅SDF提取率的影响
Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on extraction yield of SDF in prunes
2.1.2 超声温度对西梅SDF提取率的影响
超声温度对西梅SDF提取率的影响见图2。
图2 超声温度对西梅SDF提取率的影响
Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on extraction yield of SDF in prunes
由图2可知，超声温度在40℃～55℃时，西梅SDF提取率随温度升高不断增大，55℃时西梅SDF提取率最大，达11.86%。这可能是因为温度升高加快了物料内部分子的运动速度，有利于西梅SDF的溶出[20]。温度高于55℃后，西梅SDF的提取率下降，这可能是因为温度升高导致超声的空化效应减弱，从而导致西梅SDF的提取率下降。因此，选择超声温度为55℃适宜。
2.1.3 超声时间对西梅SDF提取率的影响
超声时间对西梅SDF提取率的影响见图3。
由图3可知，超声时间在30 min～60 min时，西梅SDF提取率上升，在超声时间为60 min时西梅SDF提取率最大，达12.42%。这可能是因为超声波的机械效应破坏了西梅细胞壁结构[21]，促进西梅SDF的溶出，提高了提取率。超声时间超过60 min后，西梅SDF提取率开始下降。这是因为西梅SDF在过长时间的超声波处理下被降解，因此，选择适宜超声时间为60 min。
图3 超声时间对西梅SDF提取率的影响
Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction yield of SDF in prunes
2.1.4 复合酶pH值对西梅SDF提取率的影响
复合酶pH值对西梅SDF提取率的影响见图4。
图4 复合酶pH值对西梅SDF提取率的影响
Fig.4 Effect of pH of complex enzyme on extraction yield of SDF in prunes
由图4可知，复合酶pH值对西梅SDF的提取率影响较小，在复合酶pH值偏酸性条件下，SDF提取率较高，最高可达13.04%。这与李月欣等[22]的研究结果一致，因此，选择pH6.0作为最适pH值。
2.1.5 复合酶添加量对西梅SDF提取率的影响
复合酶添加量对西梅SDF提取率的影响见图5。
由图5可知，当复合酶添加量在1.0%～2.0%时，西梅SDF提取率呈不断上升趋势，在酶添加量为2.0%时，西梅SDF提取率增加至13.32%。这是因为随着复合酶添加量的增加，复合酶同底物充分结合，酶解反应更彻底。随着复合酶添加量的增加，过量的酶水解西梅SDF，导致西梅SDF提取率下降[23]。因此，选择2.0%作为最适复合酶添加量。
图5 复合酶添加量对西梅SDF提取率的影响
Fig.5 Effect of complex enzyme addition on extraction yield of SDF in prunes
2.1.6 复合酶水浴温度对西梅SDF提取率的影响
复合酶水浴温度对西梅SDF提取率的影响见图6。由图6可知，复合酶水浴温度在45℃～60℃时，西梅SDF提取率随温度的升高不断上升，当复合酶水浴温度为60℃时，西梅SDF提取率达到峰值，为12.64%。酶分子活性受水浴温度的直接影响，过高或过低的温度均会导致酶活性降低，从而降低SDF提取率。因此，选择60℃作为最适复合酶水浴温度。
图6 复合酶水浴温度对西梅SDF提取率的影响
Fig.6 Effect of water bath temperature of complex enzyme on extraction yield of SDF in prunes
2.1.7 复合酶水浴时间对西梅SDF提取率的影响
复合酶水浴时间对西梅SDF提取率的影响见图7。
图7 复合酶水浴时间对西梅SDF提取率的影响
Fig.7 Effect of water bath time of complex enzyme on extraction yield of SDF in prunes
由图7可知，复合酶水浴时间在90 min～180 min时，西梅SDF提取率呈不断上升趋势，在复合酶水浴时间为180 min时，提取率最大，为12.12%。复合酶水浴时间继续延长，西梅SDF提取率降低。这可能是因为在180 min前，酶与底物因水浴时间过短导致酶解反应不充分，西梅SDF提取率较低。随着水浴时间延长，部分西梅SDF由多糖转变为醇溶性小分子物质，在后续醇沉工艺中溶解，导致西梅SDF提取率下降[24]。这一结果同万仁口等[25]研究结果一致。因此，选择180 min作为最适复合酶水浴时间。
2.2 响应面试验优化提取工艺
2.2.1 回归模型建立及方差分析
利用Design-Expert 8.0.6软件获得了西梅SDF提取率（Y）对A料液比、B超声时间、C复合酶添加量3个因素的三元二次回归方程Y=14.08+0.72A+0.51B+0.33C-0.37AB-0.18AC-0.15BC-0.57A2-0.83B2-1.15C2。响应面试验设计及结果见表2。方差分析见表3。
表2 响应面试验设计方案及结果
Table 2 Response surface experiment design and results
?
表3 回归模型的方差分析
Table 3 Analysis of variance of regression model
?
续表3 回归模型的方差分析
Continue table 3 Analysis of variance of regression model
注：* 表示影响显著，P＜0.05；** 表示影响极显著，P＜0.01。
?
由表3可知，模型的P＜0.000 1，此回归模型极显著，失拟项（P=0.586 5＞0.05）不显著，决定系数 R2=0.991 4，校正相关系数R2Adj=0.980 4，表明该模型与试验拟合较好，模型成立，可适用于分析和预测西梅SDF提取工艺。表3中对回归模型系数的显著性分析结果显示，一次项 A、B、C、交互项 AB、二次项 A2、B2、C2对西梅SDF提取率影响极显著（P＜0.01）；交互项AC影响显著（P＜0.05）。3个因素对西梅SDF提取率的影响大小顺序为A料液比＞B超声时间＞C复合酶添加量。
2.2.2 响应面分析
料液比、超声时间、复合酶添加量的交互效应关系见图8～图10。
图8 超声时间和料液比的响应面和等高线
Fig.8 Response surface and contour plots of ultrasonic time and solid-liquid ratio
图9 复合酶添加量和料液比的响应面和等高线
Fig.9 Response surface and contour plots of complex enzyme addition and solid-liquid ratio
图10 复合酶添加量和超声时间的响应面和等高线
Fig.10 Response surface and contour plots of complex enzyme addition and ultrasonic time
由图8～图10可知，随着各因素的增大，响应值逐渐增大；因素对响应值的影响越大，交互图的曲线越陡峭，反之影响小；等高线呈椭圆形说明各因素交互作用显著。其中AB响应面曲线相对于AC、BC的响应面曲线更陡峭，表明料液比和超声时间对SDF提取率影响更大，这与表3中方差分析的结果一致。
2.2.3 验证试验
由上述优化试验得到西梅SDF的最优提取工艺为料液比 1 ∶22.87（g/mL）、超声时间 68.91 min、复合酶添加量1.99%。在此条件下，模型预测西梅SDF提取率为14.32%。考虑到实际操作情况，将最佳超声辅助酶法提取工艺确定为料液比1∶23（g/mL）、超声时间70 min、复合酶添加量2.0%。在此条件下，进行3次验证试验，西梅 SDF 平均提取率为（14.15±0.17）%，与预测值相接近，表明试验得到模型预测性能较好，优化工艺有效，可将此试验方案作为提取西梅SDF的最佳条件。
2.3 西梅SDF理化性质分析
SDF的持水力、持油力、膨胀力等是衡量膳食纤维品质的重要指标，西梅SDF理化性质指标见表4。
表4 西梅SDF理化性质
Table 4 Physicochemical properties of SDF in prunes
?
由表4可知，西梅SDF的持水力为5.73 g/g，持油力和膨胀力分别为3.54 g/g、9.76 mL/g，溶解性为76.31%，说明提取的西梅SDF表现出良好的理化性质，这与Wang等[26]的研究结果一致。膳食纤维具有良好持水力和膨胀力的原因是其拥有大量羟基、羧基等强亲水性基团，特别是可溶性膳食纤维效果更为突出。由于SDF的持水性和膨胀性，其被食入肠道后会产生饱腹感且吸水膨胀后加大排便量，起到良好的减肥、促排便作用[27]。持油力是膳食纤维吸附能力的重要体现，SDF的持油性能吸附人体胆固醇、降低体内脂肪酸含量，从而对动脉粥样硬化、高血脂症等疾病有预防作用。
2.4 西梅SDF抗氧化活性测定结果
西梅SDF抗氧化活性测定结果见图11。
由图11可知，西梅SDF对 DPPH·、ABTS+·和·OH的清除率均呈剂量依赖关系，自由基清除率随着西梅SDF浓度的增大而增大。由图11（a）可知，西梅SDF在浓度为0.25 mg/mL～2.00 mg/mL，其对DPPH自由基的清除率不断上升，在浓度大于1.25 mg/mL后趋于平缓，在浓度2.00 mg/mL时，DPPH自由基清除率最大，达66.53%。VC在浓度大于0.25 mg/mL时，DPPH自由基清除率趋于平缓，结果与Jia等[28]的研究相符。
图11 西梅SDF和VC对不同自由基清除能力
Fig.11 Free radical scavenging ability of SDF and VCin prunes
由图11（b）可知，西梅 SDF和 VC对 ABTS+自由基清除率均随样品浓度的升高而增加。VC的ABTS+自由基清除率在0.25 mg/mL～2.00 mg/mL范围内明显高于西梅SDF，西梅SDF在浓度为2.00 mg/mL时对ABTS+自由基清除率最大，为78.42%，低于VC（99.19%）。
由图 11（c）可知，在浓度为 0～2.0 mg/mL 时，·OH清除率均随西梅SDF和VC浓度的增加而增大，当西梅SDF和VC浓度高于0.5 mg/mL后，二者对·OH清除率上升趋势减缓。西梅SDF在浓度2.0 mg/mL时清除率最大，达71.11%，虽然低于VC的·OH清除率（99.87%），但对·OH表现出较强的清除能力。
3 结论
本试验利用超声波辅助酶法提取西梅可溶性膳食纤维，通过响应面法优化提取工艺。结果表明，最佳提取工艺为料液比1∶23（g/mL）、超声时间70 min、复合酶添加量2.0%，西梅SDF提取率为14.15%，理化性质试验测定西梅SDF的持水力、持油力、膨胀力、溶解性分别为 5.73 g/g、3.54 g/g、9.76 mL/g、76.31%，表明西梅SDF具有良好持水能力和膨胀性，具有减肥、通便的潜力。西梅体外抗氧化试验结果表明，西梅SDF对·OH、DPPH自由基和ABTS+自由基表现出良好的清除能力，并且清除能力随着西梅SDF浓度的增大呈现出增强趋势。在西梅SDF浓度为2.0 mg/mL时，DPPH·、ABTS+·、·OH 清除率分别为 66.53%、78.42%、71.11%。综上所述，西梅SDF具有良好的理化特性及抗氧化活性，具有良好的膳食纤维特性，是一种潜在的功能性食品。
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