核桃（Juglans regia L.）是我国重要的干果树种，十大经济树种之一，核桃的挂果期长、产量高、营养丰富，广受群众喜爱。核桃因根系发达、耐旱耐瘠、防风固土等优点常被用于喀斯特地貌地区的石漠化综合治理，2012年起作为重要的经济树种在贵州多地大面积种植。核桃是雌雄同株异花植物，在核桃果园管理时为提高核桃产量，需要摘除大量核桃雄花[1]（可摘除95%）以供给果实营养，核桃产区有采摘鲜核桃雄花炒菜食用的风俗，核桃雄花富含蛋白质、矿质元素、氨基酸及生物活性成分[2-4]，是一种亟待开发的天然营养食品资源。
我国核桃产业发展迅速，种植面积和产量稳步增加[5]，2020年全国核桃年产量达到479.59万t[6]。有研究指出核桃雄花序数量与核桃相当，并测算了核桃雄花年产量在10亿kg以上[7]，核桃雄花年产稳定，具有极大的商用价值和产业化开发的潜力。市场对核桃雄花的认知度较低，目前对于核桃雄花的研究主要集中在核桃雄花的生理分化、成分分析、护绿保鲜等方面，核桃雄花蛋白质的相关研究还多集中在提取工艺方面[8]。
多肽的制备通常使用蛋白酶水解蛋白质生成不同分子量的活性肽，蛋白酶对肽键具有一定选择性，且反应条件比较温和，是广泛使用的多肽制备方法。酶法水解常用于蛋白质水解，酶解效果易受酶的种类、添加量、时间、温度、pH值、液料比等因素的影响[9-10]，水解度低则获得的肽链过长，无法表现出生物活性；过度水解则活性肽段水解，降低生物活性[11]。Ru等[12]发现益生菌短期发酵（1 d～3 d）可以提高核桃花的生物活性，发酵液中主要成分是儿茶素、表儿茶素和没食子酸盐。姜莉[13]研究了核桃多肽的生产技术，酶解核桃蛋白的最适反应条件为酶解4.0 h、底物浓度2.7%、胰蛋白酶添加量8 294.25 U/g底物，温度53.41℃、pH值8.0，此时水解度达到14.55%；王雪芹[14]对鲐鱼多肽的酶解最佳工艺条件进行筛选，得到最佳条件为加酶量1 726.85 U/g、pH值7.0、酶解温度39.55℃、酶解时间5.5 h、液固比25∶1（mL/g）。目前对于核桃雄花蛋白质水解制备多肽的研究还未见报道，本文以核桃雄花的蛋白质为研究对象，以多肽得率为指标，通过单因素试验与响应面试验优化复合蛋白酶组合及酶解工艺参数，以期为核桃雄花开发成新型膳食补充剂或功能性食品提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
试验所用核桃雄花为“黔林核1号”[15-16]品种类型，采自贵阳市花溪区，当天运回贵州省核桃工程技术研究中心食品理化实验室处理。
中性蛋白酶（6×105U/g）、木瓜蛋白酶（8×106U/g）、胃蛋白酶（3×103U/g）、胰蛋白酶（2.5×106U/g）、碱性蛋白酶（2×106U/g）、菠萝蛋白酶（5×106U/g）、风味蛋白酶（3×105U/g）（均为食品级）、牛血清白蛋白标准品（纯度＞99%）：北京索莱宝科技有限公司；双缩脲试剂、对硝基苯酚、乙酸、乙酸钠、乙酰丙酮、氢氧化钠、甲醛（均为分析纯）：上海麦克林生化科技股份有限公司；三氯乙酸：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；微孔滤膜（0.45 μm）：上海市新亚净化器件厂。
1.2 仪器与设备
L5S紫外可见分光光度计、PHS-25型pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；DHG-9145A数显鼓风电热干燥箱：上海一恒科技有限公司；MS104TS型分析天平：梅特勒托利多仪器（上海）有限公司；RJ-TDL-40B型离心机：无锡市瑞江分析仪器有限公司；HJ-6B数显恒温多头磁力搅拌器：常州峥嵘仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 多肽制备工艺流程
工艺流程：原料预处理→加水→酶解→灭酶→微滤→核桃雄花酶解液。
原料清洗后沥干水分，剔除不可用的部分进行匀浆，准确称取一定量的核桃雄花于烧杯中，按一定的液料比加入蒸馏水，置于恒温磁力搅拌器上预热至设定温度，称取一定量的蛋白酶加入到烧杯中，在400 r/min下搅拌酶解一定时间。将酶解液煮沸10 min灭酶，冷却至室温后，用0.45 μm滤膜过滤，获得清澈的核桃雄花酶解液。
1.3.2 酶种类筛选
1.3.2.1 单酶种类及添加量对核桃雄花蛋白水解度的影响
选用中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶7种酶进行单因素试验，固定酶解时间3 h、液料比10∶1（mL/g），其它水解条件及酶添加量见表1，考察各蛋白酶及其添加量对水解度的影响，比较各酶的水解效果，并将其作为复配酶种类的依据。
表1 各酶水解条件及添加量
Table 1 Hydrolysis conditions and addition amounts of single enzymes
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1.3.2.2 复合酶酶解对核桃雄花蛋白水解度的影响
以单酶水解筛选出的蛋白酶及其最佳添加量为依据进行蛋白酶组合试验，复合酶酶解组合设计见表2。
表2 复合酶组合试验设计
Table 2 Design of compound enzymes for experiment
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1.3.3 复合酶酶解条件的单因素试验
1.3.3.1 液料比对多肽得率的影响
固定酶解温度50℃、酶解时间3.0 h、复合酶添加总量 30 600 U/g，考察不同的液料比 6 ∶1、8 ∶1、10 ∶1、12 ∶1、14 ∶1（mL/g）对多肽得率的影响。
1.3.3.2 复合酶添加总量对多肽得率的影响
固定酶解温度50℃、酶解时间3.0 h、液料比8∶1（mL/g），考察不同的复合酶添加总量 20400、30600、40 800、51 000、61 200（U/g）对多肽得率的影响。
1.3.3.3 酶解温度对多肽得率的影响
固定酶解时间3.0 h、复合酶添加总量51 000 U/g、液料比 8 ∶1（mL/g），考察不同的酶解温度 45、50、55、60、65℃对多肽得率的影响。
1.3.3.4 酶解时间对多肽得率的影响
固定酶解温度45℃、复合酶添加总量51 000 U/g、液料比 8 ∶1（mL/g），考察不同的酶解时间 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h对多肽得率的影响。
1.3.4 复合酶酶解条件的响应面试验
根据单因素试验结果，采用Design-Expert（version 13）软件进行响应面试验设计，对液料比、复合酶添加总量（木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶质量比为25∶6∶20）、酶解温度和酶解时间进行四因素三水平试验设计，以多肽得率R为响应值，对核桃雄花蛋白复合酶酶解条件进行优化，试验因素与水平见表3。
表3 响应面法试验因素与水平
Table 3 Factors and levels of response surface methodology
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1.3.5 指标测定方法
1.3.5.1 水解度的测定
水解度中的氨基酸态氮含量参照GB 5009.235—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》中比色法测定；样品中总氮含量参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中的蛋白质的测定》中凯氏定氮法测定。水解度（degree of hydrolysis，DH）计算公式如下。
式中：X为试样中氨基酸态氮的含量，g/100 g。
1.3.5.2 多肽得率的测定
多肽得率测定步骤参考鲁伟等[17]的方法，取2.0 mL样液，加入2.0 mL 10%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA），混合后在4 000 r/min下离心15 min，上清液转移到50 mL容量瓶中，用5%的TCA定容后摇匀，取6.0 mL置于10 mL比色管中，加入双缩脲试剂4.0 mL，混匀静置后2 000 r/min下离心10 min，取上清液于540 nm下测定吸光度，以牛血清白蛋白标准品做标准曲线（回归方程为X=0.221 3Y+0.003 4。式中：X为吸光度；Y为蛋白质含量，mg/mL），对照标曲获得溶液中的多肽浓度（mg/mL），按下式计算多肽得率。
式中：A为酶解液多肽含量，mg/mL；V为酶解液总体积，mL；S为原料总蛋白含量，g。
1.4 数据统计分析
所有试验均重复3次，结果以平均值±标准差表示。数据采用Origin 2019绘图，采用SPSS 26.0进行单因素ANOVA判断（邓肯检验）。
2 结果与分析
2.1 核桃雄花理化指标
核桃雄花理化指标见表4。
表4 核桃雄花理化指标（干重）
Table 4 Physical and chemical indexes of walnut male flowers（fresh weight）%
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由表4可知，核桃雄花蛋白质含量为30.21%，其蛋白质含量丰富可作为优质蛋白质提取来源；纤维素含量为14.55%，核桃雄花是优良的纤维素补充来源[18]。
2.2 单酶种类及添加量对水解度的影响
单酶种类及添加量对水解度的影响见图1。
图1 单酶种类及添加量对水解度的影响
Fig.1 Effect of the type and addition of single enzyme on the degree of hydrolysis
如图1所示，碱性蛋白酶添加量为40 000 U/g时水解度最大，为25.13%，若投入生产建议减半添加，水解度亦可达22.97%。胃蛋白酶添加量为4 500 U/g时水解度达到最大值27.58%。胰蛋白酶添加量为12 500 U/g时的水解度最高，为15.57%。中性蛋白酶添加量为18 750 U/g时的水解度最大，为42.63%。木瓜蛋白酶的添加量为10 000 U/g时水解度达到峰值，为27.64%。风味蛋白酶和菠萝蛋白酶分别在酶添加量为4 000、5 000 U/g时的水解度最大，分别达到11.75%和9.74%。因各种酶反应条件差异较大，选择适宜在中性环境水解的酶作为试验选用的复合酶，以中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶4种酶复配进行多酶复合水解试验。
2.3 多酶复配对水解度的影响
多酶复配对水解度的影响见图2。
图2 多酶复配对水解度的影响
Fig.2 Effect of compound enzymes on the degree of hydrolysis
由图2可知，以中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶3种酶复配的水解效果最差，中性蛋白酶与另外3种酶双酶复配的效果尚佳，水解度均在36%以上。而中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶3酶复配的水解效果最好，水解度为41.27%，因此将这3种酶作为复合酶，并结合其多肽得率单因素试验确定木瓜蛋白酶、风味蛋白酶和中性蛋白酶3种酶的质量比为25∶6∶20。后续试验以多肽得率为指标，考察复合酶酶解条件对多肽得率的影响。
2.4 复合酶酶解条件单因素试验结果
2.4.1 液料比对多肽得率的影响
液料比对多肽得率的影响见图3。
图3 液料比对多肽得率的影响
Fig.3 Effect of liquid-to-material ratio on polypeptide yield
如图3所示，随着液料比的增加，多肽得率整体呈现先增大后减小的趋势，当液料比为8∶1（mL/g）时得率达到最高点，最初水解时随着液料比增加，酶与底物接触面积和水解效率增加[19]，水解效果逐步增大。当液料比继续增加，酶的浓度减小，降低了酶与底物接触的面积和水解效率，当酶解产物达到一定量后抑制酶解反应[20]，阻止了核桃雄花蛋白质的进一步水解。因此，选择液料比8∶1（mL/g）为响应面试验中心点。
2.4.2 复合酶添加总量对多肽得率的影响
复合酶添加总量对多肽得率的影响见图4。
图4 复合酶添加总量对多肽得率的影响
Fig.4 Effect of total addition of compound enzyme on polypeptide yield
由图4可知，多肽得率随着复合酶添加总量的增加先升高后缓慢降低，添加总量大于51 000 U/g时多肽得率有所下降，因为核桃雄花蛋白被过度水解生成游离氨基酸和小的肽段[21]，综合考虑多肽得率和生产成本，选择复合酶添加总量为51 000 U/g作为响应面试验中心点。
2.4.3 酶解温度对多肽得率的影响
酶解温度对多肽得率的影响见图5。
图5 酶解温度对多肽得率的影响
Fig.5 Effect of enzymolysis temperature on polypeptide yield
由图5可知，多肽得率随着酶解温度的升高而逐渐降低，由于温度过高或过低均会使酶分子空间结构发生改变，导致酶解效率降低，使多肽得率降低[22]。因此，选定酶解温度45℃为响应面试验的中心点。
2.4.4 酶解时间对多肽得率的影响
酶解时间对多肽得率的影响见图6。
图6 酶解时间对多肽得率的影响
Fig.6 Effect of enzymolysis time on polypeptide yield
由图6可知，多肽得率随着酶解时间的延长先升高后降低。当酶解时间为3.0 h时，多肽得率达到最高；当酶解时间超过3.0 h，多肽得率明显下降，这是由于酶解时间过长，溶液中的多肽过度水解成氨基酸和小肽，造成实际测得的多肽量减少。因此，选择酶解时间3.0 h为响应面试验的中心点。
2.5 响应面试验及显著性分析
响应面试验结果如表5所示，采用Design Expert软件分析试验结果，多肽得率方差分析见表6。
表5 响应面试验方案和结果
Table 5 Design and results of response surface test
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续表5 响应面试验方案和结果
Continue table 5 Design and results of response surface test
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表6 多肽得率回归模型的方差分析
Table 6 Analysis of variance of the regression model for polypeptide yield
注：* 表示影响显著，p＜0.05；** 表示影响极显著，p＜0.01。
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经回归分析，得到二次多元回归方程：R=29.91-0.029A+0.19B+0.22C-0.20D+0.055AB+0.21AC+0.23AD-0.18BC-0.15BD+0.35CD-1.07A2-1.70B2-2.04C2-2.00D2。
由表6可以看出，试验模型差异极显著（p＜0.01），且失拟项不显著（p＞0.05），说明此回归模型可靠。回归方程总决定系数R2=0.984 0，表明该模型对试验拟合较好，可用该模型拟合多个因素与响应值之间的关系。B、D均对多肽得率有显著影响（p＜0.05），C有极显著影响（p＜0.01），A 影响不显著（p＞0.05）。各交互项中 CD 影响显著（p＜0.05），二次项 A2、B2、C2和 D2对多肽得率影响均为极显著（p＜0.01）。各因素对多肽得率的影响顺序为C＞D＞B＞A，对核桃雄花蛋白的多肽得率影响最大的是酶解温度，然后是酶解时间和复合酶添加总量，最后是液料比。
各因素交互作用的响应面图见图7。
图7 各因素交互作用的响应面
Fig.7 Response surface diagrams for interactions of factors
由图7可以看出，4个因素与多肽得率呈抛物线关系，随着各因素值的增大，多肽得率先增加后下降。酶解温度和酶解时间交互作用的响应曲面坡度较陡峭，等高线呈椭圆形，该交互作用对多肽得率影响显著，与方差分析结果一致。
采用Design-Expert对试验进行优化分析，得到多肽提取最佳工艺：液料比7.97∶1（mL/g）、复合酶添加总量51 563.4 U/g、酶解温度45.23℃、酶解时间2.97 h，此时多肽得率达到29.923 3%。
考虑到实际操作性，将酶解条件调整为液料比8 ∶1（mL/g），复合酶添加总量 51 500 U/g、酶解温度45℃、酶解时间3.0 h，实际多肽得率达到30.00%。酶解后得到的核桃雄花多肽液经微滤后为黄褐色澄清透明液体，有核桃雄花特殊香气。
3 结论
本试验通过单因素试验以及响应面试验，有效地筛选出了优化后的核桃雄花多肽提取工艺参数：液料比 8 ∶1（mL/g）、复合酶添加总量 51 500 U/g（木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶质量比为25∶6∶20）、酶解温度45℃、酶解时间3.0 h，多肽得率理论值为29.92%，重复试验后核桃雄花多肽得率实际达到了30.00%，与预测值接近，说明该模型能够较好地预测核桃雄花多肽得率。本研究为核桃雄花多肽制备及资源利用提供了理论基础。
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