多酚类化合物是植物中广泛存在的多羟基酚类结构的次生代谢物，含量仅次于植物中的纤维素、半纤维素和木质素[1-2]。植物多酚分布于植物的果实、皮、叶、根和茎等部位，参与植物的生长发育繁殖过程，并赋予了植物鲜艳夺目的色彩和酸甜苦涩的味道，另外具有抵御病原和天敌侵害的作用[3]。植物多酚具有较强的抗氧化性能[4-5]，它是公认的自由基清除剂，对人体健康具有积极作用，可以改善人体免疫力、预防癌症[6-8]。植物多酚能显著增加血管弹性，降低毛细血管通透性和胆固醇水平，对于预防高血压和心脑血管疾病有积极作用[9-11]。另外，植物多酚还可以通过清除肌肤过剩自由基和抑制活性氧物质及蛋白氧化损伤等达到淡化色斑、防晒以及改善肤质的目的[12]。除此之外，多酚在食品、化工和农业等领域均有广泛应用[13]。
西柚具有健胃消食、美容减肥和预防疾病的作用[14]。常常被人们忽视的西柚副产物——西柚皮，富含有柠檬烯、柠檬醛、香茅醇、辛醇和黄酮类化合物[15]。加强对西柚皮生物活性物质的提取及研究有助于西柚资源利用。本文采用超声辅助提取法，在单因素试验的基础上结合正交试验优化西柚皮多酚的提取工艺，并分析测定西柚皮多酚的抗氧化活性和羟基自由基清除能力，以期为西柚皮及其营养物质的开发应用提供参考。
1 材料与仪器
1.1 材料与试剂
新鲜西柚皮：市售，品种为江西西柚。
无水乙醇、福林酚试剂、没食子酸、硫酸亚铁、双氧水、碳酸钠、邻二氮菲（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；磷酸缓冲溶液（pH7.4）：生工生物工程（上海）股份有限公司；多酚标准品、没食子酸：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。
1.2 仪器与设备
THC-5B实验室超声波提取机：济宁天华超声电子仪器有限公司；岛津UV-2600i紫外可见分光光度计：山西凯米科技有限公司；PX125DZH电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；HWS-26恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；XFB粉碎机：吉首市中诚制药机械厂；DHG-9075A电热恒温鼓风干燥箱：上海合恒仪器设备有限公司；5430R小型台式高速冷冻离心机：Eppendorf艾本德（中国）有限公司。
2 方法
2.1 超声辅助提取西柚皮多酚条件优化
2.1.1 西柚皮多酚提取方法
采用超声辅助提取法提取西柚皮中的多酚。将新鲜的西柚皮在70℃的电热恒温鼓风干燥箱中干燥24 h，干燥后切碎、使用粉碎机粉碎西柚皮并过40目筛。称取1 g磨碎的西柚皮，置于锥形瓶中，加入适量的乙醇，用封瓶膜封口、放入实验室超声波提取机中，工作功率为250 W，设定一定温度和时间进行提取。将超声后的粗提取液放入离心机中，在8 000 r/min条件下离心10 min，上清液即为西柚皮多酚提取液。
2.1.2 单因素试验
在相关文献[16-17]和预试验的基础上，固定乙醇体积分数为 60%、料液比 1∶50（g/mL）、提取温度 60℃、提取时间为40 min的条件下，分别考察乙醇体积分数0%、20%、40%、60%、80%，料液比 1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60、1 ∶70（g/mL），提取温度 40、50、60、70、80 ℃，提取时间 30、40、50、60、70 min 对西柚皮多酚提取率的影响。
2.1.3 正交试验设计
基于单因素试验结果，以多酚提取率为指标，选择乙醇体积分数、提取时间、提取温度和料液比进行正交试验，试验因素和水平见表1。
表1 试验因素和水平
Table 1 Factors and levels of the test
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2.2 西柚皮多酚提取率的测定
采用福林酚法测定西柚皮多酚含量[18-20]。用移液管 分 别 取 0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL 的0.1 mg/mL没食子酸标准液，分别加入1 mL福林酚试剂和2 mL 12%的Na2CO3溶液，用蒸馏水定容至25 mL并摇匀，平行3组。在室温25℃下，将容量瓶置于黑暗处，反应2 h后用紫外可见分光光度计测定765 nm处的吸光度。以没食子酸标准溶液浓度为横坐标（x，mg/mL），吸光度为纵坐标（y），得到标准曲线方程为y=12.011x-0.004 5，相关系数为0.992。
使用移液管量取1 mL西柚皮多酚提取物，将其转至25 mL容量瓶中，然后加入1 mL福林酚试剂充分混合，再加入2 mL质量分数为12% Na2CO3溶液，用蒸馏水定容摇匀，置于室温25℃避光容器中。在反应2 h后测定765 nm处的吸光值并确定西柚皮多酚含量和提取率。多酚提取率计算公式如下。
多酚提取率/（mg/g）=多酚提取物含量（mg）/原料质量（g）
2.3 西柚皮多酚抗氧化活性测定
2.3.1 铁离子还原/抗氧化能力（ferric reducing/antioxidant power，FRAP）测定
西柚皮多酚抗氧化活性测定参照Benzie等[21]的FRAP法。移取0.3 mL硫酸亚铁标准溶液至试管中，再加入提前预热至37℃的FRAP工作溶液2.7 mL，振荡均匀后放置10 min，测定其在593 nm处的吸光值。用无水乙醇代替西柚皮多酚提取液作为空白对照，将吸光值代入标准曲线方程，确定相应的硫酸亚铁浓度（μmol/L），即为FRAP值。
2.3.2 羟基自由基（·OH）清除率测定
取0.75 mmol/L邻二氮菲溶液2 mL置于试管中，加入2 mL浓度为150 mmol/L pH7.4的磷酸缓冲溶液，充分混合后再加入2 mL 0.75 mmol/L的硫酸亚铁溶液，混匀后加入1 mL 0.01%双氧水和3 mL蒸馏水。混合均匀并在37℃保温培育60 min，用作损伤管，测量536 nm处的吸光值，记为Ap。同上操作，未损伤管以1 mL蒸馏水代替损伤管中的双氧水，测得的吸光值记为Ab。样品管以0.5 mL多酚提取液样品代替损伤管中的蒸馏水，测定吸光值记为As。羟基自由基清除率计算公式[22]如下。
羟基自由基清除率/%=（As-Ap）/（Ab-Ap）×100
2.3.3 西柚皮多酚抗氧化能力随存放时间的变化规律研究
将最优条件下提取所得西柚皮多酚提取液密封避光保存于4℃冰箱中，分别测定其在第0天、第4天、第8天和第12天的多酚含量、FRAP值和羟基自由基清除率。
2.4 数据分析
所有试验各重复3次，所有数据均以平均值±标准差形式表示，并采用SPSS 18.0进行统计学分析，采用Origin 2022作图。
3 结果与分析
3.1 单因素试验结果
3.1.1 乙醇体积分数对西柚皮多酚提取率的影响
乙醇体积分数对西柚皮多酚提取率的影响见图1。
图1 乙醇体积分数与多酚提取率的变化关系
Fig.1 Variation of the ethanol volume fraction in relation to the polyphenol extraction rate
由图1可知，当体系中无乙醇时，多酚提取率仅为9.6 mg/g。随着乙醇体积分数的增大，多酚提取率先升高后降低。当乙醇体积分数为60%时，西柚皮中多酚提取率达到最高，为14.93 mg/g。当乙醇的体积分数为80%时，多酚提取率降低为12.95%。这是由于多酚属于多羟基类物质，易与植物中的多糖和蛋白质等物质形成以氢键和疏水键结合的复合物。当乙醇体积分数较小时，不足以打断复合物之间的氢键和疏水键；当乙醇体积分数过高时，其他脂溶性物质更易溶解浸出，导致多酚提取率降低[23-24]。因此选择乙醇体积分数40%、60%、80%作为正交试验的筛选范围。
3.1.2 料液比对西柚皮多酚提取率的影响
料液比对西柚皮多酚提取率的影响见图2。
图2 料液比与多酚提取率的变化关系
Fig.2 Variation of the material-to-liquid ratio in relation to the polyphenol extraction rate
由图 2 可知，当料液比为 1∶30、1∶40、1 ∶50（g/mL）时，西柚皮中多酚提取率较高，分别为12.86、13.85、13.53 mg/g。当料液比为 1∶60、1∶70（g/mL）时，多酚提取率呈现显著递减趋势（P＜0.05）。可能是由于当料液比为1∶40（g/mL）时，多酚的浸出接近饱和状态，当继续增加溶剂的含量时，会使得西柚皮中的醇溶性杂质溶出，且会造成溶剂浪费[25-26]。因此，选择料液比1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）作为正交试验的筛选范围。3.1.3 提取温度对西柚皮多酚提取率的影响
提取温度对西柚皮多酚提取率的影响见图3。
图3 提取温度与多酚提取率的变化关系
Fig.3 Variation of the temperature in relation to the polyphenol extraction rate
由图3可知，随着提取温度升高，西柚皮多酚提取率呈现先显著上升后缓慢下降的趋势。相较50℃，当提取温度达到60℃时，多酚提取率增幅高达48%，且为最大值。随着提取温度继续升高，多酚提取率呈降低趋势。这是由于当提取温度较低时，各种物质的溶解度较低，且多酚与糖类、蛋白质形成的复合物较稳定，导致多酚提取率较低；随着提取温度升高，复合物之间的氢键和疏水键被打开，溶解度增加；当提取温度高于60℃时，多酚物质结构易被破坏，结构可能遭到破坏或者发生不可逆的反应，因此提取温度过低或过高均不利于多酚的提取[24，27]。综合考虑，选择提取温度50、60、70℃作为正交试验的筛选范围。
3.1.4 提取时间对西柚皮多酚提取率的影响
提取时间对西柚皮多酚提取率的影响见图4。
图4 提取时间与多酚提取率的变化关系
Fig.4 Variation of the extraction time in relation to the polyphenol extraction rate
由图4可知，随着提取时间延长，多酚提取率呈现先显著增加后逐渐平稳的趋势。当提取时间为50 min时，多酚提取率达到较高值，为15.685 mg/g。当提取时间较短时，多酚与蛋白质、多糖等物质形成的复合物不易分离，导致多酚提取率低。在一定范围内，随着提取时间的延长，多酚的提取率明显提升。但随着提取时间继续延长，多酚的提取率基本不变。这可能是由于随着提取时间延长，西柚皮中的多酚易被氧化，以及西柚皮中的其他杂质不断溶出导致多酚提取率变化不明显。因此，选择提取时间40、50、60 min作为正交试验的筛选范围。
3.2 正交试验
正交试验设计和结果见表2。
通过表2的极差分析可知，影响西柚皮多酚提取率的顺序从大到小为料液比、提取时间、乙醇体积分数、提取温度，其中料液比对多酚提取率的影响远大于其它3个因素的影响。根据K值可知，西柚皮中多酚提取的最优条件组合为A3B2C1D3，即提取时间60 min、提取温度60℃、乙醇体积分数40%、料液比1∶50（g/mL），恰好为正交试验表里的第8组试验，最优条件下多酚提取率为（19.70±0.12）mg/g。
表2 正交试验结果
Table 2 Results of the orthogonal test
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3.3 西柚皮多酚FRAP值和羟基自由基清除能力
最优条件下所得西柚皮多酚提取液第0天、第4天、第8天和第12天的多酚含量分别为（15.88±0.09）、（14.21±0.17）、（13.75±0.11）mg/g 和（12.10±0.23）mg/g。可见，随着时间的延长，西柚皮中的多酚含量不断降低。同时测定其第0天、第4天、第8天和第12天的FRAP值和羟基自由基清除能力，结果如图5所示。
图5 西柚皮多酚的FRAP值和羟基自由基清除率
Fig.5 FRAP and the hydroxyl radical scavenging rate of grapefruit peel polyphenols
由图5可知，随着存放时间延长，西柚皮多酚的FRAP值逐渐降低最后趋于平缓，这是由于随着存放时间延长，多酚自身发生氧化聚合等反应，多酚含量降低，抗氧化活性减弱[28]。而羟基自由基清除能力呈现先降低后升高再降低的趋势，在第8天达到最优，这可能是由多酚浓度变化引起，因为新鲜西柚皮多酚提取液的还原能力较强，在高浓度时，它可以将Fe3+还原成Fe2+，反而促进了羟基自由基的产生[29]。随着存放时间延长，多酚的浓度逐渐降低，使得第8天的羟基自由基清除能力较优。西柚皮多酚具有一定的抗氧化活性，且新提取的西柚皮多酚抗氧化活性较优，随着存放时间延长，多酚抗氧化活性降低。
4 结论
本文利用单因素试验和正交试验确定了超声辅助提取西柚皮多酚的最佳工艺条件：乙醇体积分数为 40%，提取温度为60℃，料液比为1∶50（g/mL），提取时间为60 min，该条件下多酚提取率为（19.70±0.12）mg/g。通过FRAP法和邻二氮菲法测定新鲜西柚皮多酚的抗氧化能力和羟基自由基清除率，分别为（0.86±0.02）μmol/L 和（20.34±0.30）%，可知西柚皮多酚提取物具有一定的抗氧化能力。天然植物多酚在食品工业、医药、生态环境保护和农业等领域均有广泛应用，本研究为西柚皮多酚的高效提取以及西柚皮的综合利用提供了一定的借鉴与参考。
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