金耳（Tremella aurantialba）为食药用菌，又名黄木耳，隶属担子菌亚门、层菌纲、银耳目、银耳科、银耳属[1]。主要分布于欧洲、亚洲、南北美洲和大洋洲[2]。在我国主要分布于云南和西藏等高海拔地区[3]。一般生长于高山栎、壳斗科等枯木树干上，常见于夏秋季节[4]。富含维生素、蛋白质、脂肪、矿物质、碳水化合物等营养成分[5-6]。目前对金耳的研究主要集中在金耳的栽培及金耳多糖功能活性两个方面。现阶段金耳的人工栽培技术发展成熟，加大对金耳多糖功能活性的研究，将有利于金耳产业的发展，促进菌类资源的开发利用[7]。
多糖是由10个以上单糖组成的复杂碳水化合物，然而有研究发现多糖分子量大、结构复杂，不易被消化系统所消化，所以其降解主要发生在大肠中，可以被结盲肠中的肠道微生物发酵成短链脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）[8-9]，当多糖被酵解成 SCFAs时，肠道pH值也会降低，据报道，pH值降低会抑制有害菌的定植，促进有益菌的生长，促进机体免疫系统的建立，避免肠道异常障碍[10]。血细胞分泌性免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A，SIgA）作为黏膜应答过程中的主要免疫效应因子，是防止病原体侵入肠黏膜的第一道有效防线，在保护肠道方面具有重要作用[11]。研究发现金耳多糖具有抗氧化、降血糖、降血脂、抑制肿瘤、增强细胞免疫[12-13]等功效，目前对金耳的研究大多集中在金耳的栽培和体外活性试验上，但关于金耳多糖对机体免疫力保护作用的文章鲜有报道。
环磷酰胺（cyclophosphamide，Cy）是几种临床抗肿瘤药物之一，已被列为医疗保健系统所需的基本药物[14]，但是Cy在杀伤肿瘤细胞的同时也会破坏机体自身的免疫细胞，导致免疫力低下[15-16]。因此本文以环磷酰胺建立免疫低下小鼠模型，考察金耳多糖对小鼠生理作用的影响。以期为金耳多糖的进一步开发奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
干制金耳：昆明朝迎商贸有限公司；实验动物：BALB/c雄性小鼠，4 周龄，体质量（20±2）g，购自昆明医科大学，许可证编号SCXK（滇）K2020-0004；环磷酰胺：美国sigma公司；浓硫酸：成都市科隆化学品有限公司；四硼酸钠：国药集团化学试剂有限公司；氯仿：成都市科隆化学品有限公司；正丁醇、苯酚：天津风船化学试剂科技有限公司；葡萄糖：美国Tmstandard公司；无水乙醇：四川西陇科学有限公司；小牛血清白蛋白、盐酸左旋咪唑、透析袋MD34（7000 D）：上海源叶生物科技有限公司；考马斯亮蓝G-250：昆明杰辉生物有限公司；D-半乳糖醛酸：山东西亚化学工业有限公司；小鼠分泌型免疫球蛋白A试剂盒：上海酶联生物科技有限责任公司。所有化学试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
低温离心机（TGL-18M）：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；恒温振荡箱（BPH-9082）：上海一恒科技有限公司；兽用全自动血细胞分析仪（5360CRP）：迈瑞医疗国际股份有限公司；涡旋振荡混匀器（MX-F）：大龙兴创实验仪器（北京）有限公司；电子天平（BS 224 S）：赛多利斯仪器（北京）有限公司；紫外分光光度计（UV-2450）：北京普析通用仪器有限责任公司；微型pH计（PHS-3C）：上海精密科学仪器有限公司；磁力搅拌器（ZNCL-BS）：上海越众仪器设备有限公司；酶标仪（Multiskan FC）：美国Thermo Fisher Scientific公司。
1.3 试验方法
1.3.1 金耳多糖的制备
取干制金耳菌，粉碎过筛得到金耳粉，样品经粉碎后，过80目筛备用，将细粉在90℃下用去离子水[原料 ∶去离子水=1 ∶40（g/mL）]提取 2 次，每次 3 h，提取时用磁力搅拌器搅拌，以使水和金耳粉充分混匀，提取后在4℃温度条件下以4 000 r/min离心20 min得到上清液，弃去沉淀，合并2次提取滤液，滤液经高温旋转蒸发浓缩至原体积的1/4～1/5，然后加入4倍体积的无水乙醇，置于4℃冰箱12 h，4 000 r/min离心10 min，弃去上清，回收沉淀物，通过sevage试剂[氯仿∶正丁醇=4∶1（体积比）]去除蛋白，透析冷冻干燥得到金耳多糖（Tremella aurantialba polysaccharide，TAP）。
1.3.2 TAP中糖醛酸含量测定
采用咔唑-硫酸比色法[17]测定糖醛酸含量。
糖醛酸标准曲线的建立：分别取半乳糖醛酸标准品溶液（0.10 mg/mL）0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL于具塞试管中，分别加去离子水补至1 mL，在冰水浴中缓慢加入5 mL 0.48%的四硼酸钠-硫酸溶液（取0.478 g四硼酸钠到100 mL容量瓶中，缓慢加入浓硫酸定容至刻度线）用漩涡振荡混匀器混匀，沸水浴加热20 min，流水冷却至室温（23℃），加入0.15%咔唑无水乙醇溶液0.20 mL，摇匀后室温放置2 h，以同样处理的去离子水为空白，于523 nm下测吸光度，以D-糖醛酸浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
TAP中糖醛酸含量测定：将TAP配制成浓度为1 mg/mL的多糖溶液，按上述标准曲线的方法测定吸光度，平行测定3次，计算样品中糖醛酸含量。
1.3.3 TAP中蛋白质含量测定
采用考马斯亮法[18]测定蛋白质含量。
蛋白质标准曲线的建立：精密吸取标准溶液（100 μg/mL）0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL 于具塞试管中，分别加入5 mL考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀后室温静置10 min。在595 nm处测定吸光度。以蛋白质标准溶液浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
TAP中蛋白质含量测定：TAP配制成浓度为0.1 mg/mL溶液，按相同方法测定吸光度，平行测定3次，计算TAP蛋白含量。
1.3.4 TAP中多糖含量测定
采用苯酚-硫酸法测定多糖含量[19-20]，以葡萄糖为标准品，采用紫外可见分光光度计测定吸光度，按回归方程计算出各样品中总多糖的含量。
多糖标准曲线的建立：精密吸取葡萄糖标准溶液（0.1 mg/mL）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于 比色管中，加水补充至1 mL，摇匀，然后各加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，再沿试管壁缓慢加入浓硫酸溶液5 mL，混匀，置沸水浴中加热15 min，取出冷却至室温（23℃），用1 cm比色皿在波长490 nm下测定吸光度，以葡萄糖浓度（μg/mL）为横坐标（x），吸光度为纵坐标（y），绘制标准曲线。
TAP多糖含量测定：将TAP配制成0.1 mg/mL溶液，按上述相同方法测定吸光度，平行3次测定TAP中多糖含量。将测得的吸光度带入标准曲线所得回归方程中，计算TAP的实际浓度，TAP中多糖含量计算公式如下。
式中：C为依据标曲测得的TAP多糖浓度，mg/mL；V为TAP溶液测定体积，mL；n为TAP溶液稀释倍数；M为称取的TAP质量，mg。
1.3.5 小鼠分组及给药方式
72只雄性BALB/c小鼠适应7 d后随机分为6组，分别为正常（normal contral，NC）组、模型（model contral，MC）组、多糖低剂量（low tremella aurantialba polysaccharides，LTP）组、多糖中剂量组（middle tremella aurantialba polysaccharides，MTP）、多糖高剂量（high tremella aurantialba polysaccharides，HTP）组、阳性对照（positive contral，PC）组，每组12只。除正常组小鼠外其他组小鼠在第8、9、10天腹腔注射80 mg/kg·bw环磷酰胺，以构建免疫力低下模型。在第11天～第17天按照表1连续7天灌胃不同物质，每天灌胃1次，实验期间每天称量小鼠体质量和日采食量，观察小鼠的状态，于第18天收集小鼠血液，处死小鼠后，收集小鼠结、盲肠内容物、小肠组织，放入冻存管中，保存于-80℃冰箱。具体分组和灌胃情况见表1。
表1 小鼠分组及给药
Table 1 Grouping and administration of mice
?
1.3.6 小鼠体质量、日采食量变化及胸腺指数变化
实验期间每天称量各组小鼠体质量和日采量食量，并记录。在实验结束后，取小鼠胸腺，用生理盐水冲洗后，用滤纸吸干水分，用电子天平称量，计算胸腺指数。计算公式如下。
式中：m1为胸腺质量，mg；m2为小鼠体质量，g。
1.3.7 小鼠血液血细胞数目测定
用毛细管从小鼠眼球采集小鼠血液到2 mL抗凝管中，上下轻轻来回晃动，立马保存于4℃冰箱，采用兽用全自动血细胞分析仪检测血细胞数目。
1.3.8 小鼠小肠组织SIgA测定
将小鼠小肠组织制成10%组织匀浆，3 000 r/min离心15 min后取上清液，通过小鼠分泌型免疫球蛋白A试剂盒测定SIgA含量，试验过程中严格按照SIgA试剂盒说明书进行操作。
1.3.9 小鼠结盲肠内容物pH值测定
分别取小鼠结盲肠内容物，将内容物以1∶10（g/mL）的比例溶于蒸馏水中，然后于10 mL离心管中充分混合，以确保均匀，用微型pH计测定pH值，当读数稳定后，记录样品数据，即为小鼠结盲肠内容物pH值。
1.4 数据分析
采用IBM SPSS Statistics 19进行统计分析，试验结果以平均值±标准差表示。采用单因素方差分析和邓肯检验，P＜0.05被认为在统计学上显著差异。采用Origin 2018进行绘图。
2 结果与分析
2.1 TAP糖醛酸含量分析
依据不同浓度小牛血清白蛋白的标准品得到的吸光度绘制成标准曲线，得到的标准曲线方程为y=0.006 5x+0.020 8，R2=0.993 7，表明糖醛酸浓度在 0～0.10 mg/mL范围内与吸光度成良好的线性关系。将样品值带入标准曲线，测得TAP中糖醛酸含量为10.08%。
2.2 TAP蛋白质含量分析
依据不同浓度的标准品得到的吸光度绘制成标准曲线，得到的标准曲线方程为y=0.009x+0.025 4，R2=0.992 8，表明蛋白质标准溶液浓度在0～70 μg/mL范围内与吸光度成良好的线性关系。将样品值带入标准曲线方程，测得TAP中蛋白质含量为0.7%。
2.3 TAP多糖含量分析
依据不同浓度的葡萄糖标准品得到的吸光度绘制成标准曲线，得到的标准曲线为y=0.007 9x+0.003，R2=0.999，表明葡萄糖标准溶浓度在0～0.1 mg/mL范围内与吸光度成良好的线性关系。将样品值带入标准曲线，测得TAP多糖含量为88.29%。
2.4 小鼠体质量变化、日采食量及胸腺指数分析
各组小鼠在实验期间的体质量变化见图1。
图1 小鼠体质量变化
Fig.1 Weight change in mice
各组小鼠在实验期间的日采食量见图2。
图2 小鼠日采食量变化
Fig.2 Changes of daily food intake in mice
各组小鼠的胸腺指数见图3。
图3 各组小鼠的胸腺指数
Fig.3 Thymus index of the mice in each group
如图1、图2所示，与正常组相比，各组小鼠在用CY建模3 d后，与NC组相比，MC组小鼠体质量、日采食量均明显下降，而经过TAP处理后，体质量、日采食量逐步上升，趋于正常。如图3所示，NC组胸腺指数为2.21，MC组胸腺指数为0.97，与NC组相比，MC组胸腺指数显著下降（P＜0.05），说明建模成功。在经过TAP处理后，MTP、HTP两组小鼠胸腺指数分别为1.46和1.74，与MC组相比，均显著上升。这表明TAP能够在一定程度上调节小鼠的体质量、日采食量、以及胸腺指数，逆转环磷酰胺所致的小鼠生理状况改变情况。
2.5 小鼠血细胞数目分析
各组小鼠的血细胞数目变化见表2。
表2 小鼠血液血细胞变化
Table 2 Changes of blood cells in mice
注：同列不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
?
由表2可知，经过环磷酰胺处理后，小鼠血液白细胞、淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞均明显下降，红细胞也有所下降，但差异不显著。经过TAP处理后，均能在一定程度上恢复小鼠血液外周血细胞数目，且白细胞、中性粒细胞数目表现出剂量依赖性增强。
2.6 小鼠小肠组织SIgA分析
各组小鼠小肠组织SIgA含量变化见图4。
图4 小肠组织SIgA含量
Fig.4 Content of secretory immunoglobulin A（SIgA）in small intestine
由图4可知，NC组小肠组织SIgA含量为5.10 μg/mL，经过环磷酰胺处理后，MC组小肠组织SIgA含量为2.58 μg/mL，经过Cy处理后，小鼠小肠组织的SIgA含量显著下降（P＜0.05），经过TAP处理后，各组小鼠小肠组织SIgA含量相比MC组均有一定程度的回升，HTP组SIgA含量为3.95 μg/mL，与MC相比差异显著（P＜0.05），表明TAP能够在一定程度上逆转因Cy处理后小肠组织SIgA含量低状况。
2.7 小鼠结、盲肠内容物pH值的分析
各组小鼠的结、盲肠内容物pH值变化见表3。
表3 各组结、盲肠pH值
Table 3 pH of colon and cecum in each group
注：同列不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
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由表3可知，经过Cy处理后，结、盲肠内容物的pH值均显著升高；与MC组相比，MTP组、HTP组、PC组均能够有效降低结、盲肠内容物的pH值（P＜0.05），说明TAP能够在一定程度上逆转因Cy导致的结、盲肠内容物pH值异常升高的状况，且可以看出各组随着TAP剂量增加pH值呈现出依赖性降低，且HTP降低效果最好。
3 讨论与结论
胸腺是机体的主要免疫器官，其质量的变化可以反映受试药物对免疫系统的刺激作用[21]；体质量和日采食量能够反映出小鼠的身体状况；白细胞、淋巴细胞、单核细胞与机体免疫力相关，是衡量免疫力状况的指标[22-24]，SIgA作为肠黏膜表面和胃肠道主要免疫效应分子，是机体内分泌量最大的免疫球蛋白，在保护消化道黏膜方面起着重要的作用[25]。上述结果说明TAP能够在一定程度上逆转由于Cy处理后免疫力低下状况。肠道pH值的降低有利于共生菌的生长，继而调节肠道菌群平衡，本实验发现TAP可以有效降低结、盲肠内容物pH值，推测TAP可能具有调节肠道菌群的潜能[26]。
这些结果与文献[11，23，27-29]的研究结果相似，许江城等[23]研究4周幼龄大鼠环磷酰胺免疫抑制模型的建立发现，相比于正常组，小鼠经腹腔注射环磷酰胺后，体质量、外周血白细胞总数，嗜中性粒细胞数量、淋巴细胞数量、胸腺指数均明细那下降；罗青等[28]发现经过环磷酰胺处理后的小鼠生理指标明显受损，枸杞多糖均可不同程度地恢复免疫抑制小鼠的体质量和采食量，改善小鼠的胸腺损伤；Zhao等[29]用银耳多糖灌胃小鼠，发现经过银耳多糖灌胃后，相比于正常组，小鼠肠道内容物pH值明显降低，且能促进肠道有益菌增殖；严胜泽[11]发现太子参多糖能拮抗因环磷酰胺所致肠道黏膜损伤小鼠白细胞介素2、白细胞介素6、SIgA含量降低的效果，有效逆转因环磷酰胺处理后小鼠胸腺指数下降情况。
综上结果表明，TAP具有潜在的益生元功效，本研究结果为开发金耳多糖系列产品开发提供一定的理论依据。
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