蜂王浆，又名蜂皇浆、王浆，是由工蜂发达的下咽头腺和上颚腺等腺体共同分泌的乳白色或淡黄色浆状物，是1日～3日龄工蜂幼虫的食物，也是蜂王终生的食物[1]。蜂王浆中含有丰富的生理活性成分，具有提高机体免疫力、抗氧化、延缓衰老、抗菌消炎、抗肿瘤、调节血糖和血压、促进细胞增殖等多种生理功能[2-6]。蜂王浆中生理活性成分对贮存温度和时间敏感，因此蜂王浆在贮存或者加工过程中对环境的要求较高。若贮存环境条件不当，蜂王浆的物理性状、化学组成则会发生变化，生理功效会降低甚至丧失。
5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethyl-2-furaldehyde，5-HMF）是一种糠醛类化合物，广泛存在于果汁、蜂蜜、啤酒、酱油和奶制品中。该物质主要有2条合成途径：羰基化合物和氨基化合物发生美拉德反应形成[7]；酸性条件下，己糖脱水形成[8]。由于蜂王浆呈弱酸性（pH3.6～4.2），且富含糖类（11%～23%）和蛋白质（9%～18%），完全具备了5-HMF形成的物质基础，因此蜂王浆中常能检测出5-HMF的存在，尤其是经过高温或长时间贮存的蜂王浆，己糖酸解和美拉德反应速率更快，产生的5-HMF也更多。
高温和长时间的反应会导致食品中5-HMF的含量积累，因此5-HMF的含量已成为衡量部分食品是否过度受热、贮存时间是否过长、是否新鲜的指标。另一方面，5-HMF具有一定的毒性，人体少量摄入对眼黏膜、上呼吸道黏膜等产生刺激作用，摄入过多会引起中毒，造成动物横纹肌麻痹和肝脏、肾脏、心脏等内脏器官损害[9-11]。国外多个食品协会已制定部分食品中5-HMF的限量标准，但蜂王浆中尚无5-HMF的限量规定。
准确检测5-HMF含量具有重要意义。现有的5-HMF检测方法包括紫外分光光度法[12-13]、液相色谱-紫外检测法（high performance liquid chromatographyultraviolet spectrometry，HPLC-UV）[14-17]、液相色谱-质谱检测法（high-performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）[18-20]、气相色谱-质谱检测法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[21-22]等。紫外分光光度法操作简单，但是反应产物不稳定，对反应时间要求苛刻，定量不够准确；HPLC-MS和GC-MS法具有良好的灵敏度和准确性，但仪器价格昂贵，且需要专业人员操作，很难用于常规检测；相比而言，HPLC-UV法仪器价格适中，操作较为容易，且定量准确度高、精密度较好，适合常规的质控检测。在蜂王浆中检测5-HMF的研究较少，主要结果出自吴黎明等[23]和Ciulu等[24]研究，所用均为液相色谱-紫外检测法。这些方法对蜂王浆样品的前处理、色谱条件进行了优化，获得了较好的效果。然而，这些方法仍有进一步优化的空间，且对方法的评价不够详尽。在准确检测蜂王浆中5-HMF的基础上，一些研究人员还探究了蜂王浆中5-HMF随贮存温度和时间的变化，建立其新鲜度评价方法和指标。王露露等[25]发现蜂王浆在不同温度下贮存80 d内，其中的5-HMF含量减少速率为室温＞4℃＞-20℃＞-80℃；Ciulu等[24]发现蜂王浆在-18℃或4°C下贮存270 d，未检测出5-HMF，而在室温下贮存270 d检测到5-HMF含量随贮存时间延长呈指数增长，其中室温条件下贮存270 d的样品中5-HMF含量达到9 mg/kg。魏月等[26]研究发现蜂王浆在-18℃贮存3个月未检测出5-HMF，在4、16℃贮存1个月检出5-HMF。然而，这些方法检测的样品数量少，贮存条件也不够丰富，可能会造成一些误判。
本研究在已有研究的基础上，改进并评价HPLC-UV法检测蜂王浆中5-HMF含量的方法，并利用此法测定7个样品（产地或蜜源不同），在不同温度（-18、4、25、37℃）下避光贮存和在常温（20℃～25℃变化）下不避光贮存，不同时间（7、14、30、45、60、90、120、150 d）的5-HMF含量。旨在建立简单、高效、准确、可重复的蜂王浆中5-HMF的HPLC检测方法，并深入探究蜂王浆贮存过程中5-HMF含量的变化规律，为蜂王浆新鲜度指标筛选和评价提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
蜂王浆样品：北京金王健康科技有限公司，所有样品均为新鲜采集样品，为保证新鲜度，样品冷冻后置于加冰袋的保温箱快递至天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物实验室，快速分装（每份约5 g）存于密封塑料小管中，每种样品分装至少30管，分装后迅速置于-20℃条件下冷冻保存，待用，具体样品编号、蜜源、采集日期和地点详见表1。
表1 蜂王浆样品
Table 1 Royal jelly samples
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乙腈、甲醇（均为色谱纯）：美国fisher公司；磷酸（优级纯）、三氯乙酸（分析纯）、5-羟甲基糠醛标准物质（纯度≥98%，CAS号：67-47-0）：上海源叶生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
电子天平（ME204E）：瑞士梅特勒托利多集团；涡旋仪（VORTEX QL-902）：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；液相色谱仪（Agilent 1200，配DAD-1100检测器）：美国安捷伦科技有限公司；超纯水机（ALPHA 1-2LD PLUS）：德国赛多利斯集团；台式冷冻离心机（Sorvall ST8R）：美国赛默飞世尔科技公司。
1.3 方法
1.3.1 溶液的制备
1.0 mg/mL 5-HMF标准储备溶液。准确称取适量的5-HMF标准物质，用甲醇配成1.0 mg/mL。储备液于-18℃避光贮存。
5-HMF标准工作溶液：吸取适量5-HMF标准储备溶液，用水稀释成 0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、4.00 μg/mL 标准工作溶液，4℃保存，现配现用。
0.4%（体积分数）的磷酸水溶液：用移液枪准确吸取4 mL磷酸，用水稀释定容于1 000 mL容量瓶中，混合均匀；40%（质量分数）的三氯乙酸溶液：准确称取40 g三氯乙酸，用水充分溶解并定容至100 mL；4%（质量分数）的三氯乙酸溶液：准确称取4 g三氯乙酸，用水充分溶解并定容至100 mL。
1.3.2 样品溶液的前处理
称取0.5 g蜂王浆样品，精确至0.01 g，置于50 mL离心管中。加入2.75 mL的40%三氯乙酸溶液，用玻璃棒搅拌5 min，涡旋混匀。在4℃以6 000 r/min离心5 min，将上清液用滤纸过滤后，倒入10 mL容量瓶中。再在残渣中加入2.5 mL的4%三氯乙酸溶液，按照上述步骤重复提取1次，混匀后在4℃下8 000 r/min离心10 min。合并提取液，用4%三氯乙酸溶液定容至10 mL，混匀后过0.45 μm滤膜供HPLC测定。
1.3.3 液相色谱条件
色谱柱：Waters Symmetry C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相：A为乙腈，B为0.4%磷酸水溶液，A ∶B=10∶90（体积比）；流速：1.0 mL/min；检测波长：285 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。
1.3.4 5-HMF含量计算
蜂王浆样品中的5-HMF含量计算公式如下。
式中：X为蜂王浆样品中的5-HMF含量，μg/g；C为外标法测得的样品中5-HMF的浓度，μg/mL；V为定容体积，mL；M为试样的质量，g。
1.3.5 方法学评价
1.3.5.1 标准曲线绘制
分别将浓度为 0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、4.00 μg/mL的 5-HMF标准溶液在 1.3.3节色谱条件下测定，以不同浓度5-HMF标准溶液浓度（X，μg/mL）为横坐标，以出峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，拟合线性方程。以决定系数R2评价方程的线性。
1.3.5.2 检出限和定量限测定
将5-HMF标准溶液稀释至产生3倍信噪比（S/N）和10倍信噪比（S/N）的浓度，分别记为检出限和定量限。
1.3.5.3 重复性试验
平行制备6份0.02 μg/mL的5-HMF标准溶液，采用1.3.3节液相色谱条件测样，记录6份平行制备的标准品溶液的峰面积，并计算其相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。
1.3.5.4 回收率和精密度
精确称取0.5 g蜂王浆样品A 4份，其中1份不添加5-HMF标准品，另3份分别按低、中、高3个浓度水平，加标 1.06、5.30、10.60 μg/g。每个加标水平平行测定6次，按照1.3.2进行前处理，按HPLC条件进样10 μL，计算5-HMF的平均回收率和相对标准偏差。
1.3.6 蜂王浆样品的贮存
将7种蜂王浆样品，分别置于不同的条件下贮存。贮存条件为避光-18℃、避光4℃、避光25℃、避光37 ℃和常温不避光，贮存时间为 7、14、30、45、60、90、120、150 d。
1.4 数据处理
所有试验重复进行3次，结果表示为平均值±标准差。采用Excel和SPSS 26对试验数据进行分析和作图，单因素方差分析结合Duncan检验在P＜0.05水平评估。
2 结果与分析
2.1 色谱条件的改进
目前，采用HPLC方法检测蜂王浆中5-HMF含量的研究主要来自中国农业科学院蜜蜂研究所的吴黎明研究员团队和意大利萨萨里大学Sanna教授团队。表2总结了这些研究中所用的前处理方法、色谱条件以及方法参数。
由表2可知，为了准确检测蜂王浆中的5-HMF，前处理除蛋白的过程必不可少。固相萃取操作过程繁琐且成本高；乙酸锌和亚铁氰化钾沉淀蛋白效果较好，但是需要优化2种试剂的浓度，操作也相对复杂；而三氯乙酸沉淀蛋白质的效果较好，且操作最简单，因此，本研究采用三氯乙酸法除去蜂王浆中的蛋白质，在后续的色谱分离时，采用硫酸水溶液和甲醇梯度洗脱、流速1.2 mL/min、波长280 nm检测，获得的样品色谱图中目标峰形良好，但周围有大量干扰物，表现在目标物出峰前后1 min左右有过载的平头蜂和拖尾峰。考虑到本研究所用的色谱柱会与Ciulu等[24]色谱柱型号或生产厂家不同，而这些显著的干扰物质很可能会对目标峰产生干扰，为使色谱方法具有更好的普适性，有必要进一步优化。乙腈洗脱能力较甲醇强，因此本研究采用乙腈代替甲醇，并且将洗脱流速降低为1.0 mL/min，同时将检测波长提升至285 nm，以达到5-HMF的最大吸收波长来提高检测灵敏度。考虑到硫酸作为强酸对色谱柱有一定伤害，本试验采用磷酸也能达到较好的分离效果。考虑到梯度洗脱操作复杂，且文献中采用梯度洗脱多是为了同时检测多种糠醛类物质，本研究只检测5-HMF，故采用等度洗脱方式。经过改进，获得了较好的色谱分离效果，如图1所示。
表2 色谱条件总结
Table 2 Summary of chromatographic conditions
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由图1可知，5-HMF的色谱峰峰形对称，杂质较少，且与目标峰完全分离，保留时间为5.296 min，检测效率较高。
图1 5-羟甲基糠醛（5-HMF）标准测定图谱和实际样品测定图谱
Fig.1 Determination map of 5-hydroxymethylfurfural（5-HMF）standard and real samples
2.2 方法学验证
2.2.1 线性范围、检出限和定量限
由 0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、4.00 μg/mL的5-HMF标准溶液在1.3.3节色谱条件下检测得出标准曲线，线性方程为Y=131.4X+0.817 6，决定系数R2=0.999 8。因此 5-HMF 在 0.01 μg/mL～4.00 μg/mL 浓度范围内线性关系良好。该方法测定5-HMF的检出限为 0.01 μg/mL，定量限为 0.025 μg/mL。
2.2.2 重复性试验结果
按1.3.1方法配制浓度为4.00 μg/mL的标准工作液，参照1.3.3高效液相色谱条件重复6次试验，记录峰面积，并计算其相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果如表3所示。
表3 5-HMF标准品溶液的重复性试验结果
Table 3 Repeatability for determination of 5-HMF standard
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由表3可知，5-HMF峰面积的RSD为1.16%，说明该方法精密度良好，满足分析要求。
2.2.3 加标回收率和精密度试验结果
在样品上分别做 1.06、5.30、10.60 μg/g 3 个添加水平的加标回收率试验，每个样品均平行测定3次，测定的平均回收率及精密度见表4。
表4 5-HMF的加标回收率和精密度结果
Table 4 Recoveries and precisions of 5-HMF
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续表4 5-HMF的加标回收率和精密度结果
Continue table 4 Recoveries and precisions of 5-HMF
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由表4可知，5-HMF的加标回收率在91%～105%之间，RSD＜5%，根据 GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》中RSD和回收率的参考范围，方法准确度和精密度均能达到常规定量方法的要求，能够用于蜂王浆中5-HMF含量的测定。
2.3 蜂王浆样品中5-HMF在不同贮存条件下的变化
分析7种蜂王浆样品在不同条件下贮存时5-HMF的含量变化，结果见表5。
表5 不同温度下贮存不同时间的蜂王浆样品中5-HMF含量
Table 5 Content of 5-HMF in royal jelly samples stored at different temperatures for different times
μg/g
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续表5 不同温度下贮存不同时间的蜂王浆样品中5-HMF含量
Continue table 5 Content of 5-HMF in royal jelly samples stored at different temperatures for different times μg/g
注：A为江苏油菜花王浆；B为江西油菜花王浆；C为安徽油菜花王浆；D为江苏油菜花王浆；E为北京油菜花王浆；F为北京槐花王浆；G为山东槐花王浆。小写字母不同表示相同贮存条件，不同贮存时间的5-HMF含量差异显著，P＜0.05；大写字母不同表示相同贮存时间，不同贮存条件的5-HMF含量差异显著，P＜0.05。
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由表5可知，各新鲜样品中检测到5-HMF的范围在 1.12 μg/g～1.25 μg/g，说明即使新鲜样品也会有5-HMF形成，这与Ciulu等[24]的结果不同。这可能与检测方法的灵敏度或者样品不同有关，因为蜂王浆具备5-HMF形成的物质基础，反应温度低或者时间短只能降低反应速度，却无法完全阻挡5-HMF的形成，尤其是在工蜂分泌蜂王浆至取浆结束期间，处于自然温度下，不可避免会有5-HMF形成。同时，本试验样品从产地到实验室的寄送途中，因运输时间和贮存条件不当也会导致5-HMF少量生成。新鲜蜂王浆中5-HMF含量最高的样品，贮存一定时间后5-HMF含量未必是最高的，这与样品的复杂成分和贮存条件有关。5-HMF的含量最高值为6.66 μg/g，出现在37℃避光贮存150 d的D样品中。
将各个样品中5-HMF含量求平均值后，进行单因素方差分析，结合邓肯（Duncan）氏法进行差异显著性检验。横向比对各个贮存条件下，不同贮存时间对5-HMF含量的影响。发现当所试样品在-18℃避光贮存时，随着贮存时间的延长，样品中5-HMF的含量略有增加，60 d后5-HMF含量有显著变化（P＜0.05）；避光贮存在4℃条件下，30 d内无显著影响（P≥0.05），45 d后5-HMF含量显著增加（P＜0.05）；避光 25℃和常温不避光条件下，在7 d内5-HMF含量的增加并不显著（P≥0.05）；避光贮存在37℃条件下，14 d及以后5-HMF的含量增加（P＜0.05）。纵向比对相同贮存时间时，不同贮存条件对5-HMF含量的影响。发现贮存7d和14 d时，避光-18℃和4℃蜂王浆中5-HMF的含量无显著影响（P≥0.05），避光25℃、常温不避光和避光37℃之间有显著差异（P＜0.05）；贮存 30 d～60 d，-18、4℃和25℃避光贮存对蜂王浆中5-HMF的含量有显著影响（P≥0.05）；贮存 90 d～150 d，各贮存条件对5-HMF的含量差异均有显著差异（P＜0.05）。
为了进一步掌握蜂王浆贮存过程中，5-HMF含量在不同贮存条件下的变化情况，同时为了模拟预测5-HMF含量的变化。取相同贮存条件下各样品的5-HMF含量平均值做散点图，并在同一温度下拟合趋势线，结果见图2。
图2 不同温度下蜂王浆中5-HMF随时间的拟合曲线
Fig.2 Fitting curves of 5-HMF in royal jelly at different temperatures with time
由图2可知，数据拟合的各曲线方程决定系数R2≥0.936，说明曲线方程基本合理，可用于5-HMF含量预测。整体看，样品在各条件下贮存时，随着贮存时间的延长，5-HMF的含量均逐渐增大，且增大的趋势为-18℃避光＜4℃避光＜25℃避光＜常温不避光＜37℃避光条件。在-18℃避光、4℃避光和25℃避光贮存蜂王浆，5-HMF含量随贮存时间延长呈线性增加，且斜率随着温度增加而增大。此结果与吴黎明等[23]、魏月等[26]的研究结果相符，但与Ciulu等[24]的研究结果略有不同。Ciulu等[24]研究表明在25℃避光时，蜂王浆贮存300 d内5-HMF含量呈指数增加，这可能是因为本试验贮存时间较短，前期并未表现出明显的趋势。室温不避光和37℃避光条件下贮存蜂王浆，5-HMF含量随贮存时间延长呈指数增加，37℃避光条件下增加得更快。通过25℃和室温不避光曲线的对比，以及表5的数据分析可知，贮存90 d及以后，室温不避光5-HMF增长速度明显高于25℃避光条件。Chen等[28]研究了蜂王浆在-20℃避光、4℃避光、室温避光和不避光条件下，贮存7个月内水溶性蛋白、糖类、颜色、黏度等组分的变化情况。结果表明，蜂王浆在4℃避光贮存7个月，黏度呈线性增加，而在室温不避光贮存1个月黏度急剧增加。贮存温度升高可促进美拉德反应，而光照影响作用较弱。
3 结论
采用三氯乙酸溶液沉降蜂王浆中的蛋白质，改进色谱条件，建立蜂王浆中5-HMF的HPLC检测方法。该方法在 0.01 μg/mL～4.00 μg/mL 范围内线性关系良好，方法检出限和定量限分别为0.01 μg/mL和0.025 μg/mL，加标回收率在 91%～105%之间，相对标准偏差在1.5%～3.5%之间。5-HMF在蜂王浆贮存过程中的含量变化规律为随着贮存时间的延长，蜂王浆中的5-HMF含量逐渐增大，且增大趋势为-18℃避光贮存＜4℃避光贮存＜25℃避光贮存＜常温不避光贮存＜37℃避光贮存。检测方法操作简单、分析时间短、灵敏度高、可满足企业或监管部门对蜂王浆中5-HMF含量测定的需求。5-HMF含量可以有效地反映蜂王浆是否过度受热、贮存时间是否过长、是否新鲜。结合蜂王浆的功能评价，5-HMF有望作为蜂王浆新鲜度评价指标。
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