草鱼(Ctenopharyngodon idellus),属鲤形目鲤科雅罗鱼亚科草鱼属,又称鲩鱼、草根,是四大家鱼之一,因其肉质鲜美厚实,价格便宜,深受消费者喜爱[1]。但由于鲜活水产品运输、市场养殖成本较大,货架期短。通常宰杀后先腌制,再进行后续的运输、加工等操作[2]。低盐腌制前处理过的鱼干水分适中,含盐量较低,不仅适宜工厂批量加工生产,也适合家庭烹饪,在市场上受到广大消费者的青睐。
随着工业的发展,通过人工接种乳酸菌发酵剂用于改善传统肉制品风味成为一种趋势[3]。乳酸菌发酵能够改善低盐鱼制品的口感、颜色以及风味。同时发酵产生的有机酸及抗菌代谢产物能够抑制大多数腐败菌的生长繁殖,从而延长肉制品货架期[4-5]。近年来,应用微生物发酵鱼肉制品被广泛的研究应用,以此来赋予鱼肉制品特殊的发酵风味[6-10]。许惠雅等[11]研究了不同乳酸菌发酵对草鱼品质影响,结果表明不同乳酸菌均能在鱼肉中大量繁殖,且能提高鱼肉的白度和鲜味。吴康等[12]研究了红曲菌发酵对草鱼提味增鲜的作用,发酵过后鲜味明显增强,等鲜浓度(equivalent umami concentration,EUC)达到 7.34 g/100 g,是对照组的4.38倍。红曲菌发酵产生的红色素赋予鱼肉鲜红的色泽,但不利于工厂后续的加工操作。
由于消费者对加工类鱼制品的需求逐步提升,需要不断推进咸鱼制品的更新换代,进一步扩大低盐腌制草鱼制品市场。本试验采用乳酸菌混合发酵低盐草鱼干,在最佳发酵条件下对发酵所得鱼干与未发酵处理鱼干进行质构、色差、氨基酸含量、挥发性风味物质等进行分析,研究发酵前后鱼干风味指标的变化,为进一步扩大低盐腌制鱼干的利用及其应用领域提供参考。
草鱼:绍兴市白马湖食品有限公司;MRS肉汤培养基:青岛海博生物技术有限公司;双歧杆菌菌粉(编号21711)、嗜酸乳杆菌菌粉(编号20244)、干酪乳杆菌菌粉(编号20241):中国工业微生物菌种保藏管理中心;嗜热链球菌菌粉(编号MF-001031)、乳双歧杆菌菌粉(编号MF-001040):信阳市沐凡生物科技有限公司。
MLS-3781L高压灭菌锅:日本Panasonic公司;50/30 μm二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)涂层萃取头:美国 Supelco公司;TraceGC Ultra-DSQ Ⅱ气相色谱-质谱联用仪:美国Thermo Fisher Scientific公司;DGG-9123A电热恒温鼓风干燥箱:上海森信实验仪器有限公司;LA8080氨基酸自动分析仪:日本日立公司;Color QuestXE色差仪:美国HunterLab公司。
预处理的鱼干→浸泡→沥干水分、烘干→接种→终止发酵→烘干→发酵成品。
浸泡:按照鱼干与水按照料液比1∶10(g/mL)进行静置浸泡1.5 h,每隔25 min换水一次。
乳酸菌发酵剂的制备:长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜热链球菌、乳双歧杆菌的混合菌种按照含量质量比1∶1∶1∶1接种到MRS培养基中在37℃培养箱中活化培养4 h,再将其转移到新的MRS培养基中37℃扩大培养12 h。将扩大培养的乳酸菌在4℃、8 000 r/min离心10 min,弃去上清液。再加入无菌水,充分混匀,相同条件下离心后去上清液,置于4℃条件下保存备用。
鱼干的接种:将浸泡后的鱼干置于40℃恒温干燥箱中烘干至与浸泡前质量等同,选择含盐量在3%的鱼干进行后续接种操作。将乳酸菌发酵剂加入无菌水,充分混匀使菌液浓度保持在108cfu/mL~109cfu/mL,接种量为15 mL菌液/100 g鱼肉。接种后将其置于恒温恒湿箱中发酵20 h。后将其置于40℃恒温干燥箱中烘干至发酵前质量。
1.4.1 鱼肉发酵条件的优化
在恒温恒湿箱中对发酵条件进行控制,选择15、20℃和25℃3个发酵温度,发酵湿度分别为70%、75%、80%、85%和90%,发酵时间均为20 h,进行优化试验,并对发酵后的鱼肉样品中游离氨基酸含量进行统计分析,确定最佳发酵条件。样品分组及试验参数见表1。
表1 样品分组及试验参数
Table 1 Sample grouping and test parameters
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1.4.2 氨基酸含量的测定
参照吴艳艳等[13]的方法,依据GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的测定》中的方法,利用氨基酸自动分析仪进行测定。
1.4.3 色差的测定
色差的测定参照孟粉等[14]的方法,使用全自动色差仪对样品进行测定,同时记录下每个样品的L*、a*、b*,对每个试验样品在相同条件下平行测定3次,用下式计算白度值。
1.4.4 质构特性的测定
参考Chanarat等[15]的方法并适当修改,利用质构仪程序中全质构分析(texture profile analysis,TPA)进行测定。取发酵前后的低盐鱼干的相同部位,切成面积约为3 cm×3 cm大小的鱼块进行质构测定,采用P5圆柱形探头测定,每个样品平行测定3次。TPA参数设置为测试速度:60 mm/min;触发力:0.1 N;形变量:60%。记录各质构特性指标。凝胶强度计算公式如下。
凝胶强度/(g·mm)=破裂力(g)×破裂位移(mm)
1.4.5 挥发性成分分析
将3 g鱼肉置于顶空瓶中,然后将密封瓶在50℃下保温10 min。并将活化好的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头插入顶空瓶当中,60℃吸附30 min,萃取完成后在进样口解吸4 min,进行后续气质测定。
气相色谱条件:TR-35 MS色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);载气为高纯氦气;进样口温度 250℃,不分流进样;升温程序:初始温度35℃,保持3 min,以2.5℃/min升至70℃,再以8℃/min升至150℃,最后以20℃/min的速率上升到230℃,保持5 min。
质谱条件:检测器温度280℃;离子源温度200℃;电子电离源;电子能量70 eV;传输线温度250℃;质量扫描范围 m/z 30~500。
1.4.6 挥发性氨基酸态氮的测定
根据GB 5009.235—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》[16]中的酸度计法进行测定。
1.4.7 滋味活性值的计算
滋味活性值(taste activity value,TAV)表示单个呈味物质对食品整体风味的贡献,是客观评价食品风味的一种方法,TAV值大于1说明改物质对食品整体风味有贡献,且呈正相关。TAV值小于1说明该物质对整体风味没有贡献,计算公式如下。
鱼干中挥发性成分通过NIST 2.0谱库进行定性分析,当鉴定结果的正反匹配度均大于800给予保留。采用Excel进行数据处理,Origin 2018绘图,heatmap图使用TBtool软件进行绘制。
鲜味氨基酸主要是天门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)这6种呈味氨基酸,通过其含量和在所有游离氨基酸中的百分比可以评估鲜味程度,以确定最佳发酵条件,鲜味氨基酸含量如图1所示。
图1 鲜味氨基酸总含量图
Fig.1 Umami amino acid content graph
由图1可知,鱼干在发酵后鲜味氨基酸含量均在50%以上,相较于未发酵样品明显增加,其中9号样品所含鲜味氨基酸含量最高,因此选定9号样品对应的发酵条件进行发酵前后风味变化分析。
将氨基酸检测结果进行统计分析,将各游离氨基酸含量绘制heatmap热图进行对比,结果如图2所示。
由图2可知,鱼干中游离氨基酸主要由天门冬氨酸Asp、谷氨酸Glu、甘氨酸 Gly、丙氨酸 Ala、酪氨酸Tyr、苯丙氨酸 Phe、苏氨酸 Thr、丝氨酸 Ser、半胱氨酸Cys、缬氨酸 Val、蛋氨酸 Met、异亮氨酸 Ile、亮氨酸Leu、赖氨酸 Lys、组氨酸 His、精氨酸 Arg、脯氨酸 Pro17种氨基酸组成,从热图中可以看出所有样品氨基酸含量相比于空白样品均有不同程度的增加,除样品2、样品6外,其余增加的趋势大致相同,其中谷氨酸在氨基酸含量中增加较为明显。
图2 发酵后样品中氨基酸含量组成
Fig.2 Composition of amino acid content in samples after inoculation and fermentation
鱼类中的游离氨基酸相比其他水产品有很大不同,是鱼肉中的主要呈味物质。除主要常见的鲜味氨基酸外,甜苦味的赖氨酸,呈苦味的亮氨酸、异亮氨酸等共同赋予了鱼肉的特征风味[17-18]。发酵前后氨基酸含量和TAV值见表2。
表2 发酵前后氨基酸含量和TAV值
Table 2 Amino acid content and TAV before and after fermentation
注:ND表示未检出。
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由表2可知,在发酵后,总游离氨基酸含量显著增加,增加了近4倍,表明其鲜味得到明显增加,这与王伟[19]结论一致。除脯氨酸、苏氨酸外,其余15种氨基酸含量发酵组均高于未发酵组。其中甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸为典型的鲜味氨基酸,发酵后含量增加超过3倍,因此发酵后鱼干的氨基酸呈味物质发生了变化,以谷氨酸为主的鲜甜味氨基酸成为主要风味氨基酸赋予发酵鱼干特殊的发酵风味。仅仅通过呈味物质含量多少并不能证明其对整体风味的贡献,通过计算鱼干中各氨基酸的TAV值,来评估其对整体风味的贡献[20-21]。从表2中可以得出,在未发酵时组氨酸是鱼干风味的主要贡献者。在发酵后谷氨酸、组氨酸为鱼干风味的主要来源,其中谷氨酸的TAV值高达13。丙氨酸、蛋氨酸、赖氨酸TAV值均大于1,对发酵鱼干风味有着重要贡献。
低盐鱼干发酵前后不同部位色度变化见表3,低盐鱼干发酵前后不同部位白度值变化见图3,鱼干发酵前后状态见图4。
表3 低盐鱼干发酵前后不同部位色度变化
Table 3 Color change of different parts of low-salt dried fish before and after fermentation
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图3 低盐鱼干发酵前后不同部位白度值变化
Fig.3 Changes in whiteness values of different parts of low-salt dried fish before and after fermentation
图4 鱼干发酵前后状态
Fig.4 Dried fish before and after fermentation
由表3可知,发酵后的鱼干亮度值L*有明显上升,红绿值a*下降,黄蓝值b*上升,由图3可知,鱼肚和鱼背的白度值均有所上升,表明鱼干在发酵过后感官上变得更加黄亮透明,与图4实际观察到的结果所一致。这可能是微生物发酵所产生的酶类物质对鱼肉中已经氧化形成的高铁肌红蛋白进行酶解,由此产生多肽氨基酸和进一步代谢产物,使其红褐色减少,变得更加透亮[22-23]。在发酵后烘干使得水解的氨基酸在烘干过程中氧化发黄,使得b*上升。
低盐鱼干发酵前后质构指标见表4。
表4 低盐鱼干发酵前后质构指标
Table 4 Texture index of low-salt dried fish before and after fermentation
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由表4可知,发酵后的鱼肉硬度、胶黏性、咀嚼性都有很明显的下降,弹性下降,内聚性变化较不明显。肌原纤维蛋白和肌浆蛋白是鱼肉中的主要成分,且赋予鱼肉机械强度[24]。乳酸菌发酵所产生的细菌蛋白酶能够促进肌原纤维蛋白和肌浆蛋白的分解,结构强度下降,使其硬度、咀嚼性、胶黏性下降[25-26]。但由于发酵时间的控制,使其部分被酶解,弹性上升。因此发酵后改变了低盐腌制鱼干过硬、难以咀嚼的缺点,使其更易于咀嚼吞咽,口感更加细腻。
乳酸菌发酵前后低盐鱼干挥发性物质含量和组成见图5。
图5 乳酸菌发酵前后低盐鱼干挥发性物质含量和组成
Fig.5 Volatile content and composition of low-salt dried fish before and after lactic acid bacteria fermentation
如图5所示,发酵后鱼干的主要挥发性化合物发生了明显变化,酮类、苯类、酸类、醇类、醛类明显下降,酯类、烯类、烷类含量上升,同时产生了酚类等其他挥发性物质。酚类物质的产生可能是苯类物质在微生物作用下与其他化合物反应产生。
发酵前后鱼干挥发性物质的具体组成见表5。
表5 低盐鱼干发酵前后挥发性成分组成
Table 5 Composition of volatile components of low-salt dried fish before and after fermentation
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续表5 低盐鱼干发酵前后挥发性成分组成
Continue table 5 Composition of volatile components of lowsalt dried fish before and after fermentation
注:ND表示未检出。
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由表5可知,共检测到47种挥发性化合物,其中未发酵鱼干检测到27种,发酵后鱼干挥发性化合物检测多达39种,其中共有成分19种。未发酵鱼干的主要风味构成有3-庚基二氢-5-甲基-2(3H)-呋喃酮、1-辛烯-3-醇、十六醛、十六醛;而发酵后的鱼干主要风味构成为丁香油酚、吲哚。根据已有的文献报道,醛类和烯醛类是形成水体中腥味的主要成分[27]。发酵后挥发性风味物质更加丰富,且醛类、烯类物质整体含量明显下降,庚醛是已经被证实的形成鱼腥味的主要成分[28],发酵后庚醛含量下降明显,说明鱼腥味等不愉快的气味得到控制。在发酵的过程中,蛋白质被组织蛋白酶D在前发酵阶段被水解成多肽、肽和氨基酸等,然后部分氨基酸在酶的作用下脱酸、脱羧,进一步形成醛类、酮类等其他更多的小分子化合物。根据前人的文献报道,酮类物质具有特殊的香气,但是对鱼肉的气味影响相对较小[29-30]。且酮类物质含量的下降能够促进鱼腥味的减退,本试验中鱼干中酮类物质发酵后含量从7.67%下降到3.60%,且腥味明显下降,与前人研究保持一致。发酵前后的鱼干中均有大量的烷烃被检出,饱和烃的阈值较高,对鱼干的整体风味贡献不大[31],发酵后的烷烃含量大量增加,可能与微生物的代谢密切相关。发酵后鱼干中有吲哚产生,且是形成其风味物质的主要组成,高浓度的吲哚会产生令人不愉快的气味,但低浓度的吲哚具有淡淡的香味,控制发酵时间可影响吲哚的产生,形成特殊的发酵风味。
氨基酸是许多风味物质的前提,氨基酸态氮的变化可以反映蛋白质的降解程度,同时在一定范围内氨基酸态氮的含量与风味物质呈正相关[32-33]。低盐鱼干发酵前后氨基酸态氮含量见图6。
图6 低盐鱼干发酵前后氨基酸态氮含量
Fig.6 Amino acid nitrogen content of low-salt dried fish before and after fermentation
如图6所示,发酵导致氨基酸态氮含量的上升,进一步表明在乳酸菌的作用下,蛋白质水解成氨基酸。氨基酸小分子的形成,促进了风味物质的产生,同时一些氨基酸本身也是形成鲜味的物质(如谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸等)[34-35]。氨基酸态氮含量的上升表明了发酵后鱼干风味物质的增加。
近年来,应用微生物发酵鱼肉制品被广泛的研究应用,以此来赋予鱼肉制品特殊的发酵风味。高继庆等[36]研究了木糖葡萄球菌发酵对海鲈鱼鱼肉的影响,发酵后鱼肉游离氨基酸含量增加,溶解肽增加了2.6倍。使用微生物发酵鱼肉后蛋白质被不断降解,氨基酸含量明显上升,风味物质和鱼肉特性得以增加。单一菌种发酵处理在一定程度上发酵时间较长,且发酵产物较为单一,混菌发酵鱼肉制品发酵时间更短,且发酵产物更加丰富,更加符合实际生产需要。
本研究利用混合乳酸菌发酵低盐鱼干,乳酸菌在发酵过程中会产生腐败难闻的气味,同时也会导致本身原来具有的风味物质含量下降,如十六烷酸乙酯、3-烯丙基-6-甲氧基苯等酯类芳香化合物的下降以及消退,但整体上风味物质增加要大于减少的含量[37]。同时乳酸菌在鱼干的发酵过程中不仅仅产生了氨基酸和风味物质,Sivamaruthi等[38]研究表明在发酵过程中产生生物胺等物质,生物胺的含量也是衡量发酵鱼制品优劣的一个指标。本研究仅初步对鱼肉质构、风味等方面进行分析研究,尚未对发酵过程中生物胺进行分析,因此有待进一步进行试验研究。
本试验研究了乳酸菌发酵对低盐草鱼干的氨基酸含量变化及挥发性风味物质的影响。结果表明经过乳酸菌发酵后的鱼干色泽更加透白明亮、色泽红润。乳酸菌发酵后的鱼干游离氨基酸含量上升,鲜味氨基酸含量鲜味氨基酸含量从24.3%增加到57.9%,鲜味物质增加;发酵过后鱼干的硬度、咀嚼性、胶黏性下降,弹性上升,改变了传统低盐鱼干干硬的现状。发酵后醛类、烯类物质整体含量明显下降,尤其是庚醛物质的下降,表明腥味物质已经得到减少,发酵产生的低浓度吲哚、丁香油酚等小分子芳香类物质,赋予了鱼干特殊的发酵风味,使得鱼干的滋味更加鲜味。
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