凉粉草（Mesona chinensis Benth）中富含多糖、酚类、黄酮、糖醛酸等多种活性成分[1]。凉粉草多糖（Mesona chinensis polysaccharides，MCP）具有抗氧化、抗肿瘤、抗糖尿病、抗病毒、免疫调节等功效[2]。有关凉粉草的化学成分、理化性质和生物活性方面研究已有报道，凉粉草多糖被提取并表征为离子型多糖胶，形成具有明显剪切变稀特征的低黏度溶液[3]。Xiao等[4]通过两种不同提取方法得到两种凉粉草多糖，结果表明在化学成分、热稳定性以及表面形貌都存在差异。Tang等[5]研究发现凉粉草多糖具有显著的抗氧化作用，但关于处理方式对得到的多糖的化学成分及其抗氧化活性的深入研究鲜见报道。凉粉草已经在药品行业和食品中被开发为稳定剂、混凝剂和功能产品[6-7]，不同的处理方式会对多糖生物活性产生影响[8]，目前凉粉草多糖的研究主要集中在提取方法及工艺方面，而对提取后的处理方式研究较少。不同处理方式对其理化性质及体外抗氧化活性有一定差异。本文对不同处理方式得到的凉粉草多糖进行理化性质和体外抗氧化活性比较分析，研究不同处理方式提取的多糖的差异，为凉粉草资源的开发和综合利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂
新鲜凉粉草：采自岭南师范学院植物园，匍匐型，生长期为5个月左右，取茎叶为材料。稀盐酸、铁氰化钾、碳酸氢钠：天津科密欧试剂有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）、2，2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2′-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate）ABTS]、牛血清蛋白：福州飞净生物科技有限公司；考马斯亮蓝G-250、苯酚、三氯化铁：国药集团化学试剂有限公司；抗坏血酸：西陇科学股份有限公司；氯化钠、无水乙醇、浓硫酸、三氯化铁：广州化学试剂厂。以上试剂均为分析纯。
1.2 主要仪器与设备
SORVALL RC6 plus高速冷冻离心机：德国赫默公司；DS-30H电热鼓风干燥箱：上海跃进医疗器械厂；AlPhal-4LDPlus冷冻干燥机：德国Christ公司；齿轮牌1835乌氏粘度计（毛细管内径0.7 mm～0.8 mm，黏度计常数0.020 85 mm2/s2）：无锡南方商贸有限公司；STA 6000同步热分析仪：美国PerkinElmer仪器有限公司。UV-8453紫外可见分光光度计：美国Agilent公司；Nicolet 6700傅里叶变换红外光谱仪：美国Thermo Fisher Scientific公司；VEGA3 SBH扫描电子显微镜、X’pert Pro MPD X射线衍射仪：荷兰PANalytical公司。
1.3 试验方法
1.3.1 凉粉草多糖的制备
称取新鲜凉粉草，将凉粉草和蒸馏水以料液比1∶6（g/mL）和1.6%碳酸氢钠煮沸浸提10 min，过滤后离心（5 000 r/min，15 min）取上清液，将过滤后的沉淀继续浸提，重复以上操作，连续浸提两次。合并提取的溶液，快速浓缩至原体积的1/4～1/3，加酸使pH值至3.0以下，4℃酸沉过夜12 h，将酸沉溶液离心（4 500 r/min，10 min）得多糖沉淀，然后将离心后的沉淀热风干燥后得到多糖MCP-A。
重复上述提取步骤，将两次提取的溶液浓缩至原体积的1/4～1/3后，加入浓度为3%三氯乙酸溶液，4℃静置 12 h后离心（8 000 r/min，20 min）脱蛋白，加入3倍量95%无水乙醇，4℃醇沉过夜12 h，将醇沉溶液离心（4 500 r/min，10 min）得多糖沉淀，将沉淀物复溶超纯水中，后装入透析袋（截留分子量3 500 Da），分别以自来水、蒸馏水、超纯水各透析1 d。透析结束后将透析袋中溶液离心（4 500 r/min，10 min）去除不溶性物质，最后将沉淀冷冻干燥后得到多糖MCP-B。
1.3.2 主要成分测定
总糖含量：采用苯酚硫酸法测定多糖含量[9]。蛋白质含量：采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量[10]。糖醛酸含量：采用硫酸-咔唑法测定糖醛酸含量[11]。
1.3.3 多糖黏度测定
配制1 g/mL的多糖溶液，稀释至不同浓度（0.001 g/mL～0.005 g/mL）。用乌氏粘度计在25℃测定不同浓度的多糖溶液流经毛细管时间（t）和溶剂流过的时间（t0），用哈金斯方程[12]计算凉粉草多糖黏度，并将增比黏度与浓度之比进行线性拟合，得到回归曲线。黏度计算公式如下。
式中：t为多糖溶液流经毛细管的时间，s；t0为溶剂流经毛细管的时间，s；[η]为特性黏度，其值与黏度无关，是浓度的倒数；kH为溶液哈金斯系数，一般在0.3～0.4 之间[13]；c为凉粉草溶液浓度，g/mL；ηsp为增比黏度，mL/g。
1.3.4 热特性的测定
称取6 mg两种干燥的凉粉草多糖，利用同步热分析仪对多糖样品进行分析。温度范围30℃～600℃，加热速率10℃/min。
1.3.5 光谱分析
1.3.5.1 紫外光谱分析
配制浓度为1mg/mL的多糖溶液，采用紫外可见分光光度计在200 nm～600 nm内测定多糖溶液紫外光谱。
1.3.5.2 红外光谱分析
称量干燥后的多糖样品1mg～2 mg与30 mg～60 mg溴化钾与研钵中一起磨碎，压成透明薄片。用红外光谱仪在4 000 cm-1～400 cm-1范围内测定多糖红外光谱信息。
1.3.6 X射线衍射
分别取适量的两种多糖粉末，采用X射线衍射仪对多糖进行分析。在 40 kV、40 mA、8°～35°内进行扫描。
1.3.7 微观分析
取干燥后的凉粉草多糖粉末，将样品铺在电胶布上镀膜导电，采用扫描电镜进行微观结构观察。
1.3.8 体外抗氧化活性测定
1.3.8.1 DPPH自由基清除率测定
参考文献[14]的方法并稍作修改，配制0.2 mmol/L DPPH溶液，以VC为阳性对照。取DPPH溶液2 mL和不同质量浓度（0.025 mg/mL～0.175 mg/mL）多糖样品2 mL为样品组，黑暗条件下放置0.5 h，用分光光度计测定样品在517 nm的吸光值。计算公式如下。
式中：Ai为样品组2 mL多糖溶液+2 mL DPPH溶液的吸光值；Aj为样品干扰试验2 mL乙醇+2mL多糖溶液吸光值；A0为对照组2 mL DPPH溶液+2 mL水的吸光值。
1.3.8.2 ABTS+自由基清除的测定
参考文献[15]的方法并稍作修改，配制ABTS溶液，黑暗条件下反应8 h后备用，以VC为阳性对照。取2 mL不同浓度（0.025 mg/mL～0.250 mg/mL）多糖样品，加入4 mL ABTS溶液摇匀放置10 min，随后用分光光度计测定样品在734 nm的吸光值。计算公式如下。
式中：A1为2 mL多糖溶液+4 mL ABTS溶液的吸光值；A2为样品干扰试验4 mL无水乙醇+2 mL多糖溶液吸光值；A0为对照组4 mL ABTS溶液+2 mL无水乙醇的吸光值。
1.3.8.3 还原力的测定
参考文献[16]的方法并稍作修改，配制不同浓度（0.25 mg/mL～4.00 mg/mL）多糖溶液待测。以VC为阳性对照，取1 mL样品于试管中，加入磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH6.6）和 2.5 mL 0.1%铁氰化钾溶液，摇匀后在50℃下水浴反应20 min，迅速冷却后加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液、2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液，于700 nm处测吸光值。计算公式如下。
式中：Ai为样品吸光值；Aj为多糖溶液吸光值。
1.4 数据处理
用Excel 2019软件统计数据，Origin Pro 2018作图。数据以平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 凉粉草多糖理化性质分析
2.1.1 化学成分检测结果
凉粉草多糖的化学成分见表1。
表1 多糖化学成分含量
Table 1 Content of chemical composition of polysaccharides
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由表1可知，两种多糖化学成分明显不同，MCP-A多糖含量[（7.03±0.02）%]比MCP-B含量低，原因可能是MCP-A中含其他杂质影响了多糖溶液的吸光值，导致总糖含量偏低；MCP-B的蛋白质含量（85.52 μg/mL）比MCP-A（276.88 μg/mL）低，原因可能是在纯化过程中大量可溶性蛋白被去除，两种多糖的糖醛酸含量无明显差异。
2.1.2 多糖的黏度特性分析
凉粉草多糖溶液哈金斯图见图1。
图1 凉粉草多糖溶液哈金斯图
Fig.1 Huggins diagram of Mesona chinensis polysaccharide solution
根据哈金斯公式外推可以得到黏度特性的值为直线方程在纵轴上的截距，即MCP-A黏度特性为49.628 mL/g，MCP-B黏度特性为34.459 mL/g。说明在两种多糖溶液中的动态水合旋转半径上，MCP-A的黏度特性要比MCP-B大得多。冯涛等[17]研究表明不同生长形态、不同产地的凉粉草多糖黏度均有差异，本试验所得黏度特性值与已有研究结果相比较低，可能是在产地、品种、栽培方式、处理方法等方面存在差异所导致。
2.1.3 多糖热特性分析
多糖的热重分析见图2。
图2 凉粉草多糖残留质量变化曲线以及DTG曲线
Fig.2 Residual mass curves and DTG curves of Mesona chinensis polysaccharide
由图2可知，两种多糖均呈多步分解，MCP-A热分解的第一阶段主要集中在27℃～176℃，MCP-B热分解的第一阶段主要集中在27℃～147℃。在第一阶段，主要损失质量是多糖中的游离水、结合水和受热易分解化合物造成的，MCP-A和MCP-B在此阶段质量损失率分别为6.492%和17.401%；第二阶段中，MCP-A的起始分解温度为176℃，最终残留质量约占48.15%；MCP-B的起始分解温度为147℃，最终残留质量约占25.149%，在此阶段，两种多糖均因高温导致化学键破坏而分解[18]。多糖的热重分析结果表明，MCP-B比MCP-A失重较快，但MCP-A残余质量相对较高，说明MCP-A比MCP-B的结构更稳定，MCP-A具有更强的耐热性。
2.1.4 光谱分析
2.1.4.1 紫外光谱分析
MCP-A和MCP-B的紫外光谱如图3。
图3 多糖紫外扫描图谱
Fig.3 Ultraviolet spectrum of polysaccharides
由图3可知，两种多糖在260 nm～280 nm处有吸收峰，说明有多糖大分子存在。在280 nm处出现最高吸收峰，表明存在蛋白质，经过纯化的MCP-B中仍有少量蛋白质存在，该结果与蛋白质检测结果一致。
2.1.4.2 红外光谱分析
多糖的红外光谱如图4所示。
图4 多糖红外扫描图谱
Fig.4 Infrared spectrum of polysaccharides
由图4可知，两种多糖的红外光谱形状相似且共性特征明显，都有显著的多糖结构。两种多糖在3430cm-1和2 930 cm-1附近的吸收峰是由O-H和C-H伸缩振动引起，可判断为糖类化合物[19]；在1 625 cm-1附近出现吸收峰，对应羧基的不对称伸缩振动，可判断该多糖含有糖醛酸[20]；1 400 cm-1附近的吸收峰是由C-H的变角振动引起；1 018 cm-1应为α-1，6连接的特征峰[21]；在1 095 cm-1附近的吸收峰推测为吡喃糖的特征峰[22]；在890 cm-1附近出现的特征峰为β-糖苷键[23]；624 cm-1附近的峰值应为醇类含羟基和苯环变形角振动与变形振动[24]。除此之外MCP-A还出现多个吸收峰，1 511.92 cm-1处的吸收峰是由多糖苯环骨架的伸缩振动引起；815.75 cm-1处的吸收峰可推测MCP-A含有另一种构型为α-糖苷键[25]。结果显示，两种多糖均具有典型多糖的特征性吸收，但在官能团的分布以及结构上存在明显差异。
2.1.5 X射线衍射分析
通过分析X射线衍射在样品中衍射产生的晶体衍射效应现象，可以判断多糖的晶型结构。MCP-A、MCP-B的XRD图谱如图5所示。
图5 多糖X射线衍射图谱
Fig.5 X-ray diffraction patterns of polysaccharides
由图5可知，在衍射角8°～35°范围内，MCP-B无明显吸收峰，MCP-A在31.47°处出现明显的吸收峰，说明多糖在酸性环境对颗粒内部的晶体结构造成了一定程度的破坏。结果表明，MCP-A中存在结晶部分，MCP-A与MCP-B均以非晶形式存在，X衍射曲线呈光束状[26]，但两者的晶型结构表现不同。
2.1.6 多糖微观分析
MCP-A和MCP-B在不同放大倍数下的表面微观结构见图6。
由图6可知，MCP-A结构较细，呈颗粒状，这是由于内部致密，导致孔隙率降低，使其内部结构更加稳定。MCP-B呈片状结构，由许多致密小颗粒组成，表面有很多孔隙，这是由于冷冻干燥过程中使分子间氢键减少，范德华力减弱，分子间缠绕作用变弱，最终导致分子距离变大[27]，MCP-B的热稳定性更易受外界环境因素的影响，该结果与热分析结果一致。
图6 多糖的微观外貌图
Fig.6 Microscopic appearance of polysaccharides
2.2 体外抗氧化活性分析
MCP-A和MCP-B的体外抗氧化活性见图7。
由图7A可知，MCP-A和MCP-B对DPPH自由基均有一定的清除能力，且与浓度呈正相关，MCP-A对DPPH自由基的清除能力明显高于MCP-B。当多糖浓度达到0.20 mg/mL时，MCP-B的清除率仅为（66.35±0.93）%，而MCP-A的清除率高达（95.27±1.24）%。
图7 凉粉草多糖的体外抗氧化活性
Fig.7 In vitro antioxidant activity of Mesona chinensis polysaccharides
由图7B可知，ABTS+自由基清除率在试验浓度范围内与浓度呈正比。在0.20 mg/mL时，MCP-A和MCPB 对 ABTS+自由基清除率最高，分别为（98.81±1.18）%和（92.15±0.95）%，表明 MCP-A与 MCP-B 在一定浓度范围内具有良好的抗氧化活性，对ABTS+自由基清除能力与DPPH自由基清除能力具有一致性[28]。
由图7C可知，MCP-A与MCP-B还原力随浓度增加呈现剂量关系，在0.25 mg/mL～2.00 mg/mL范围内还原力迅速升高，当达到4.00 mg/mL时，MCP-A和MCP-B 的吸光值分别为 1.31±0.45和 1.43±0.57，表明两种多糖都对Fe3+均有较好的还原能力。
抗氧化活性与多糖分子含醇羟基等活性有关。MCP-A和MCP-B对DPPH自由基、ABTS+自由基清除率及还原力均呈明显的剂量依赖关系，但MCP-A的抗氧化能力要高于MCP-B，原因可能也与分子上含有醇羟基等活性官能团有关[29]，这与红外光谱得出的结果一致，也有可能是经过酸沉后会使多糖抗氧化能力提高，具体原因还有待于进一步研究。
3 结论
本文采用不同处理方法得到MCP-A和MCP-B，其理化性质和体外抗氧化性具有一定差异，MCP-A的总糖含量比MCP-B低，但蛋白质含量高于MCP-B，二者糖醛酸含量差异不大。热分析显示MCP-A比MCPB具有更强的耐热性，稳定性更好；红外光谱显示两种凉粉草多糖均呈现出糖类物质的典型特征吸收峰，都包含β-型糖苷键，但MCP-A在构型上有α-型糖苷键存在；X射线衍射结果显示，两种多糖均以非晶体形式存在，但MCP-A中存在结晶部分；SEM显示MCP-A由于内部更为致密，表面积小于MCP-B；与MCP-B相比，MCP-A清除DPPH自由基、ABTS+自由基的能力更强。考虑到其热稳定性及生物活性的应用价值，酸沉多糖是较为合适的沉淀多糖的方法，MCP-A可作为潜在的抗氧化成分。今后将对凉粉草多糖的结构和单糖组成进行分析，以进一步阐明其结构与活性的关系。
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