苦荞又名花荞、鞑靼荞麦，属草本双子叶蓼科作物[1]，原产于中国西部[2]，由于营养成分丰富[3]，苦荞被加工成各种各样的产品。为了提高苦荞的利用程度，加工方式也在不断变化[4]。苦荞蛋白含量为10.1%～23.3%[5]，是少见的优质植物蛋白，内含8种人体必需氨基酸。苦荞蛋白可降低人体胆固醇、调节血糖血脂、抗氧化、抗肿瘤，除此之外，还可降解疲劳、抑制胆结石[6]。
苦荞蛋白作为大分子物质，在体内不容易被消化吸收[7]，也使得其近年来被广泛研究，主要研究方向为不同提取方法，不同干燥方式，不同蛋白酶对其抗氧化活性的影响，最终发现碱提酸沉法所提取的蛋白抗氧化活性较高[6]。干燥方式不同，抗氧化活性也不同，研究最多的是不同酶对蛋白处理后的抗氧化活性变化。吴伟菁等[8]发现碱性蛋白酶水解苦荞蛋白后抗氧化活性最高，陈金玉等[9]发现胃蛋白酶水解苦荞蛋白后抗氧化活性较高。
苦荞多肽是由苦荞蛋白水解而来，研究表明，蛋白水解后会改善其功能特性[10]。不同的酶在蛋白质中酶切位点不同，肽段所呈现的功能特性也会不同[8]，苦荞多肽包括抗菌肽、抗氧化肽[11]。苦荞蛋白水解物的抗氧化活性随着水解程度的增加而增加[12]。研究表明，苦荞抗氧化肽的能力主要通过提高肝脏总氧化能力和总超氧化物歧化酶活力[13]而表现；而且苦荞蛋白经水解后的产物能更加显著降低肝脏内胆固醇浓度和非高密度脂蛋白胆固醇的浓度，从而抑制胆固醇的吸收达到降低体内胆固醇的作用[14]。
目前的研究主要集中在用单一蛋白酶水解苦荞蛋白，而对于复合酶水解苦荞蛋白的研究较少。本文主要研究不同品种苦荞蛋白的复合酶酶解产物的抗氧化活性，对于开发苦荞功能性食品以及有效合理地利用苦荞资源、增加苦荞利用率有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
苦荞（赤苦2号、湖南7-2、品苦1号、川荞2号、云苦3号、黑丰1号、迪苦2号、定苦1号、米荞、西荞1号、川荞1号、黔苦3号）：成都大学农业农村部杂粮加工重点实验室；碱性蛋白酶（200 U/mg）、胰凝乳蛋白酶（1 500 U/mg）、胃蛋白酶（1∶3 000）、木瓜蛋白酶（800 U/mg）、中性蛋白酶（100 U/mg）：上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇、盐酸、氢氧化钠、硫酸铜、Tirs、邻苯三酚、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）、2，2’-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐[2，2′-azino-bis（3-ethylben zothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]、过硫酸钾、双氧水、无水甲醇、VC、硫酸亚铁、水杨酸（均为分析纯）：成都市科隆化学品有限公司；考马斯亮蓝R-250：北京索莱宝科技有限公司。
1.2 主要仪器与设备
HH-6数显恒温水浴锅：常州澳华仪器有限公司；FiveEasy Plus pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；X-30R高速冷冻离心机：美国贝克曼库尔特股份有限公司；DYY-6C型电泳仪：北京六一生物科技有限公司；Synergy HTX酶标仪：BioTek Instruments公司。
1.3 试验方法
1.3.1 原材料预处理
取一定量不同品种苦荞籽粒，烘干，打粉过60目筛，之后加入一定量的石油醚对苦荞粉进行脱脂24 h，脱脂后于通风橱内自然风干备用。
1.3.2 苦荞蛋白的提取及含量测定
结合谭萍等[15]的方法和试验的实际情况进行改进，将脱脂苦荞粉按照料液比1∶15（g/mL）加入去离子水，50℃水浴保温一段时间，保鲜膜封口防止水分蒸发，用1 mol/L NaOH溶液调节pH值为8.0，之后加入碱性蛋白酶，酶用量60 U/g，搅拌提取50 min，期间保持pH值恒定。将苦荞悬浊液于8 000 r/min离心10 min，倒出上清液用1 mol/L HCl溶液调节pH值到3.5进行蛋白沉淀，于8 000 r/min离心10 min，取出沉淀，用水复溶，调节pH值为7，得到苦荞蛋白提取液。采用考马斯亮蓝方法[16-17]测定苦荞蛋白含量。
1.3.3 苦荞蛋白十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）凝胶电泳
根据李红梅等[18]的方法进行改进，采用10%的分离胶、5%的浓缩胶进行SDS凝胶电泳，对苦荞蛋白进行分析。将苦荞蛋白溶液调整为相同浓度。苦荞蛋白溶液与电泳上样缓冲液配制混合，加热5 min。蛋白上样量10 μL。插入电极，样品在浓缩胶时电压调整为80 V（约40 min），样品进入分离胶以后，电压调整为120 V（约1 h），待蛋白样品距离胶底部约1 cm左右时停止电泳。凝胶采用考马斯亮蓝R-250进行染色12 h。
1.3.4 苦荞蛋白复合酶解工艺优化
1.3.4.1 单因素试验
在底物浓度（1.3.2所得蛋白液用去离子水进行稀释，0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL）、碱性蛋白酶与胰蛋白酶质量比（1 ∶3、1 ∶2、1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1）、加酶量（质量分数为0.01%、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%）、酶解时间（1、2、3、4、5 h）、酶解 pH 值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、酶解温度（40、45、50、55、60℃）的条件下进行单因素试验，每个试验做3次重复，取平均值。
1.3.4.2 响应面优化试验
在单因素试验基础上，考察酶解时间、酶解温度、酶解pH值对苦荞蛋白酶解工艺的影响，并采用Design-Expert 10.0软件对复合酶酶解的最佳工艺进行优化，以多肽浓度作为响应值，响应面试验设计见表1。
表1 响应面试验设计
Table 1 Experimental design of response surface
?
1.3.5 多肽含量的测定
1.3.5.1 多肽标准曲线的制作
结合李红敏等[19]与康俊杰等[20]的方法精确称取酪蛋白磷酸肽标准物0.500 0 g，10%（质量分数）的三氯乙酸溶解并用25 mL容量瓶定容至25 mL，即浓度为20 mg/mL，分别配制 0、2、4、6、8、10、12、14、16、18 mg/mL的标准溶液，按照样液与双缩脲试剂体积比为3∶2加入双缩脲试剂，混合摇匀后，在室温的条件下避光放置30 min后，采用酶标仪测定OD值（540 nm）。根据OD值与多肽浓度绘制标准曲线。
1.3.5.2 多肽含量的测定
按照样品与三氯乙酸体积比为4∶1加入10%三氯乙酸水溶液，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10 min，然后在10 000 r/min下离心10 min，然后按照样液与双缩脲试剂体积比为3∶2加入双缩脲试剂，于漩涡混合仪上混合均匀，室温下避光静置30 min，于540 nm下测定OD值，对照标准曲线求得样品溶液中的多肽质量浓度（mg/mL），计算公式如下。
式中：C为从标准曲线中查到的多肽质量浓度，mg/mL。
1.3.6 不同品种苦荞蛋白复合酶解物的抗氧化活性
1.3.6.1 超氧阴离子自由基的清除作用
取 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.2）5 mL，置于25 ℃水浴预热 20 min，加入 0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL的多肽液1 mL和25 mmol/L邻苯三酚溶液1 mL，混匀后于25℃水浴中反应5 min，再加入质量分数8%HCl 100 μL终止反应，在325 nm波长处测定吸光度A1；取蒸馏水代替邻苯三酚溶液测定吸光度A2；取蒸馏水代替多肽液做空白对照测定吸光度A3。并以VC做阳性对照，计算 O2-·清除率[21]，公式如下。
1.3.6.2 ABTS+自由基的清除作用
取 5 mL、7 mmol/L 的 ABTS 溶液，加入 88.0 μL、140 mmol/L的过硫酸钾，在室温下置于暗处反应12 h～16 h，形成ABTS+自由基储备液。在734 nm处，用体积分数70%的乙醇稀释ABTS+自由基储备液至吸光度为0.70±0.02，备用。准确量取 0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL 的多肽液0.1 mL，加入0.5 mL ABTS+自由基溶液，混匀，在室温下反应6 min，于734 nm处测定吸光度为A1。吸取0.5mLABTS+自由基溶液，加入0.1mL体积分数70%的乙醇溶液测定吸光度为A2。并以VC做阳性对照，计算清除率，公式如下。
1.3.6.3 DPPH自由基的清除作用
称取DPPH标准品2.56 mg，用无水甲醇溶解后定容至 100 mL。取 0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL 的多肽液1 mL于试管中，加入1 mL DPPH溶液，室温下避光反应30 min，测定517 nm下的吸光度，记为Ai，取1 mL无水甲醇于试管中，加入1 mL DPPH溶液，室温下避光反应30 min，测定在517 nm下的吸光度，记为Ac，取1 mL多肽液于试管中，加入1 mL无水甲醇溶液，室温下避光反应30 min，测定在517 nm下的吸光度，记为Aj。并以VC做阳性对照，根据下式计算DPPH自由基清除率。
DPPH自由基清除率/%=[1-（Ai-Aj）]/Ac×100
1.3.6.4 羟基自由基（·OH）的清除作用
取 0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL 的多肽液 1 mL 依次加入0.5 mL 9 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液、0.5 mL 9 mmol/L的FeSO4溶液，最后加入5 mL 8 mmol/L H2O2溶液启动反应，振荡混匀后，37℃水浴30min，在510 nm处测其吸光度记为A1；取0.5 mL蒸馏水代替硫酸亚铁溶液测定吸光度A2；取1 mL蒸馏水代替多肽液做空白对照测定吸光度A0。VC作为阳性对照，·OH清除率的计算公式如下[22]。
1.4 数据统计分析
所有试验设3次重复，结果以平均值±标准差表示，应用Origin 2018进行试验数据的图表分析。
2 结果与分析
2.1 苦荞蛋白提取与含量测定
不同品种的苦荞经过相同的预处理，通过碱提酸沉酶辅助的方法得到荞麦蛋白，蛋白质含量通过考马斯亮蓝方法测定，根据线性回归方程Y=0.003 3X+0.002 9（R2=0.999 3）得到蛋白浓度，进而计算蛋白含量，如图1所示。
图1中可看出12个品种苦荞蛋白含量存在差异，含量均在79.16 mg/g～155.94 mg/g之间，黔苦3号的蛋白质含量最低，为79.16 mg/g，而川荞1号的蛋白质含量最高，为155.94 mg/g。
图1 不同苦荞品种蛋白质含量
Fig.1 Protein content of different Tartary buckwheat varieties
2.2 苦荞蛋白SDS凝胶电泳
通过SDS凝胶图谱分析不同品种苦荞蛋白质的分子量变化及条带分布，结果如图2所示。
图2 不同苦荞蛋白电泳图
Fig.2 Electrophoresis diagram of different Tartary buckwheat proteins
从图2中可以看出，不同苦荞蛋白的大分子蛋白分子量基本上均分布在31 kDa～43 kDa，其余小分子蛋白分子量分布各不相同，由此也体现了不同品种苦荞蛋白之间存在一定的差异。
2.3 多肽含量标准曲线
以酪蛋白磷酸肽的质量浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，得到多肽标准曲线如图3所示。线性关系良好，可用于后续多肽浓度的定量。
图3 多肽标准曲线
Fig.3 Standard curve of polypeptide
2.4 苦荞蛋白双酶酶解单因素试验
2.4.1 底物浓度及加酶量对多肽含量的影响
酶解工艺优化采用川荞1号作为原料，底物浓度及加酶量对多肽含量的影响如图4所示。
图4 底物浓度与加酶量对多肽含量的影响
Fig.4 Effects of substrate concentration and enzyme dosage on polypeptide content
由图4可知，随着底物浓度即蛋白浓度的不断增加，多肽含量也在不断增加，底物浓度达到5 mg/mL时多肽含量较高，为8.56 mg/mL，随后较为平稳；加酶量对多肽含量也有一定影响，随加酶量逐渐增加，呈现先增加后减小的趋势，在加酶量为0.10%时，多肽含量最高，为9.33 mg/mL，而后逐渐下降，主要原因可能是当酶过度饱和后，酶会使多肽进一步水解为其他小分子物质。底物浓度越高需要的酶量也会增加，消耗越大，所以选择底物浓度与加酶量分别为5 mg/mL与0.10%为最佳。
2.4.2 双酶比例与酶解温度对多肽含量的影响
双酶比例与酶解温度对多肽含量的影响如图5所示。
由图5可知，不同复合酶酶比对于多肽含量的影响也较大，当碱性蛋白酶与胰蛋白酶质量比为1∶3时，多肽含量达到9.65 mg/mL；随着酶解温度升高，多肽含量也随之升高，在55℃时，多肽含量最高，为10.46mg/mL，而后随着温度升高，多肽含量下降，主要原因可能是由于温度较高破坏了酶的结构致使酶失去活性，因此选择最佳酶解温度为55℃。
图5 双酶比例与酶解温度对多肽含量的影响
Fig.5 Effects of double enzyme ratio and enzymolysis temperature on polypeptide content
2.4.3 酶解时间与酶解pH值对多肽含量的影响
酶解时间与酶解pH值对多肽含量的影响如图6所示。
图6 酶解时间与酶解pH值对多肽含量的影响
Fig.6 Effects of enzymolysis time and pH on polypeptide content
由图6可知，在酶解1 h～3 h时，多肽含量逐渐增加，在3 h达到最大值，为10.32 mg/mL，随着时间不断延长，多肽含量降低；pH值不断增加，多肽含量也增加，在7.5时达到最适pH值，所得到的多肽含量最高，为10.77 mg/mL，较高的pH值会抑制两种酶的酶活力，所以pH值提高以后多肽含量反而下降。
2.5 响应面优化试验
结合单因素试验结果和Box-Behnken中心组合设计试验分析结果，选择影响较显著的酶解时间、酶解pH值和酶解温度为响应因子，苦荞多肽浓度为响应值进行试验，结果见表2。
表2 Box-Behnken响应面试验结果
Table 2 Experimental results of Box-Behnken response surface design
?
采用Design-Expert 10.0软件对表2中的试验结果进行响应曲面分析，得到回归方程：Y=12.87-0.22A+0.74B+0.29C-0.058AB+0.86AC+0.32BC-0.61A2-3.06B2-0.75C2。
回归模型方差分析结果见表3。
表3 回归模型方差分析结果
Table 3 Results of regression model variance analysis
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续表3 回归模型方差分析结果
Continue table 3 Results of regression model variance analysis
注：P＜0.05表示影响显著；P＜0.01表示影响极显著。
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表3中数据显示模型P＜0.000 1，水平为极显著模型[23]，R2=0.997 4，R2Adj=0.994 1，R2Pred=0.966 5 且失拟项0.11＞0.05，F值为5.10，能作为预测与分析工具。除此之外，表中3个因素的一次项P值均＜0.01，二次项P值均＜0.000 1，证明3个因素对多肽含量的影响达到极显著水平[22]。分析表3中F值可知，各因素对多肽含量影响大小的顺序为酶解pH值（B）＞酶解温度（C）＞酶解时间（A）。
图7为各因素交互作用的等高线及三维响应面。
图7 各因素交互作用的等高线及三维响应面
Fig.7 Contour plots and 3D response surface of various factors interaction
等高线的形状可反映交互作用的强弱，两因素交互作用越强，等高线越接近椭圆，而圆形则表示交互作用较弱，且等高线越密集表明该因素的影响效果越大[24]。由图7可知，三维响应面直观地反应了3个因素对苦荞蛋白多肽含量的影响，曲面的倾斜度反映了影响因素的影响大小，曲面越倾斜表明影响越大，反之越小[25]。多肽含量随酶解时间和酶解pH值的增大，呈先增大后减小的趋势，且酶解pH值的响应曲面相比酶解时间更为陡峭，等高线更为密集，说明酶解pH值对多肽含量的影响更为显著；酶解时间曲面较陡，对多肽含量影响更大；多肽含量提取率随酶解温度和酶解pH值的增大，呈先快速升高后逐渐降低的趋势，酶解pH值的响应曲面较陡峭，对多肽含量的影响作用大于酶解温度。所得的试验结果与表3呈现的结果一致。
经Design-Expert 10.0软件分析得到的优化条件为底物浓度5 mg/mL、碱性蛋白酶与胰蛋白酶质量比1 ∶3、加酶量 0.1%、酶解时间 2.949 h、酶解 pH7.566、酶解温度55.953℃，此时多肽含量最大，为12.98 mg/mL。为了更加方便实际的试验操作，将条件进行调整为酶解时间3 h、酶解pH7.5、酶解温度55℃，将调整后的条件进行3次验证，多肽浓度为（12.80±0.12）mg/mL，与预测值相近，证明此模型在双酶酶解工艺方面具有一定的指导性作用[26]。
2.6 不同品种苦荞蛋白单酶解多肽的抗氧化活性
不同品种苦荞蛋白单酶解多肽的抗氧化活性如图8所示。
图8 不同品种苦荞蛋白单酶解多肽的抗氧化活性
Fig.8 The antioxidant activity of single enzymatic hydrolysis products of different Tartary buckwheat proteins
由图8可知，不同酶水解不同品种苦荞蛋白后的多肽对DPPH自由基清除率不同，胃蛋白酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶水解后多肽对DPPH自由基均呈现较好的清除作用，而中性蛋白酶和木瓜蛋白酶清除作用较差，原因可能是中性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解苦荞蛋白产生的多肽浓度小而导致清除DPPH自由基的能力较差。除此之外也发现不同品种苦荞蛋白被不同酶水解后的抗氧化能力也不一致，这可能是由于酶在不同蛋白中酶切位点不同，肽段呈现不同的功能作用。所以选用碱性蛋白酶与胰蛋白酶复合水解苦荞蛋白。
2.7 不同品种苦荞蛋白复合酶解多肽清除ABTS+自由基的能力
图9为不同品种苦荞蛋白复合酶解多肽对清除ABTS+自由基的能力的影响。
图9 不同苦荞蛋白复合酶解多肽清除ABTS+自由基的能力
Fig.9 Scavenging ability of double enzymatic hydrolysis products of different Tartary buckwheat proteins on ABTS+free radical
由图9可知，随着浓度升高，不同品种苦荞蛋白多肽对ABTS+自由基的清除能力均呈逐渐增加的趋势，但在低浓度条件下，所有品种的蛋白多肽对ABTS+自由基清除能力差异较小，而在高浓度条件（2 mg/mL）下，各品种都有着较大差异，云苦3号相比其他品种清除能力较弱，川荞1号和米荞清除能力较强，分别为51.54%、54.41%，但清除能力明显低于VC，主要原因可能是不同品种的苦荞蛋白含量差异较大且苦荞蛋白存在差异性，酶切蛋白后所产生的水解物对清除ABTS+自由基能力有着不同程度的影响。
2.8 不同品种苦荞蛋白复合酶解多肽清除超氧阴离子自由基的能力
不同品种苦荞蛋白复合酶解多肽清除超氧阴离子自由基的能力如图10所示。
图10 不同苦荞蛋白复合酶解多肽清除超氧阴离子自由基的能力
Fig.10 Scavenging ability of double enzymatic hydrolysis products of different Tartary buckwheat proteins on superoxide anion free radical
由图10可知，在同一浓度下，不同品种苦荞蛋白复合酶解多肽呈现不同的清除能力，低浓度或高浓度时清除能力差异均不大，而且各浓度梯度之间清除能力均为缓慢上升趋势，但川荞1号和云苦3号在低浓度及高浓度时均有较好的清除能力，多肽液浓度为2.0 mg/mL时，分别达到97.23%、96.45%，与VC的清除能力相当。不同酶水解后的多肽抗氧化能力都不同，可能是水解后肽段的长度及本身的性质不同决定了其具有不同抗氧化性。
2.9 不同品种苦荞蛋白复合酶解多肽清除羟基自由基的能力
不同品种苦荞蛋白复合酶解多肽对于清除羟自由基能力如图11所示。
图11 不同苦荞蛋白复合酶解多肽清除羟基自由基的能力
Fig.11 Scavenging ability of double enzymatic hydrolysis products of different Tartary buckwheat proteins on hydroxyl radical free radical
由图11可知，不同品种苦荞蛋白复合酶解多肽对清除羟基自由基能力的差异较大，浓度与清除能力呈现正比例关系。在浓度为0.5 mg/mL～1.0 mg/mL时，所有品种的苦荞蛋白多肽清除能力提升的趋势较大，但迪苦2号和川荞1号相比其他品种的·OH清除能力高，主要原因可能是在这个浓度范围内能产生更多清除羟自由基的活性多肽。在高浓度（2.0 mg/mL）条件下，川荞1号的清除羟基自由基能力最高，为91.32%，迪苦2号次之，为90.47%，与VC清除率相当。但多肽浓度越高，不同品种间清除能力差异越大。
2.10 不同苦荞蛋白复合酶解多肽清除DPPH自由基的能力
图12为不同品种苦荞蛋白复合酶解多肽清除DPPH自由基的能力。
从图12中可以看出，各品种清除能力也有较大差异，随着多肽液浓度增加对DPPH自由基的清除能力越大，与已有研究结果[8]一致，低浓度条件下，各品种间清除能力相当，同一浓度条件下，川荞1号和米荞相比其他品种蛋白多肽清除能力较强，在1.0 mg/mL～1.5 mg/mL内，黔苦3号清除能力没有太大变化，主要原因可能是酶切后对于清除DPPH自由基能力的肽段没有显著增加，在高浓度（2.0 mg/mL）条件下，川荞1号和米荞呈现最好的清除DPPH自由基的能力，分别为87.35%、84.91%，但均是明显低于阳性对照VC的DPPH自由基清除率。
图12 不同苦荞蛋白双酶解多肽清除DPPH自由基的能力
Fig.12 Scavenging ability of double enzymatic hydrolysis products of different Tartary buckwheat proteins on DPPH free radical
3 结论
采用12个苦荞品种进行试验，运用碱提酸沉酶辅助的方法提取蛋白，再通过单因素与响应面试验探索胰蛋白酶与碱性蛋白酶双酶复合对不同苦荞蛋白的水解最佳条件为底物浓度5 mg/mL、碱性蛋白酶与胰蛋白酶质量比1∶3、加酶量0.1%、酶解时间3 h、酶解pH7.5、酶解温度55℃，此时多肽浓度为（12.80±0.12）mg/mL，将此条件下所得的不同品种蛋白多肽液进行抗氧化活性测定发现，不同品种的苦荞蛋白双酶解产物呈现不同的抗氧化活性，川荞1号和米荞具有较高的ABTS+自由基和DPPH自由基清除能力；羟基自由基清除率高的是迪苦2号和川荞1号；超氧阴离子自由基清除能力高的是川荞1号和云苦3号。在实际应用中，针对不同的需求，选用不同苦荞品种，这对于开发苦荞多肽类饮品，提升苦荞资源利用有指导性意义。
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