单增李斯特氏菌（Listeria momocytogenes）与伊氏（绵羊）李斯特氏菌（Listeria ivanovii）、英诺克李斯特氏菌（Listeria innocua）、斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri）、威氏李斯特氏菌（Listeria welshimeri）、格氏李斯特氏菌（Listeria grayi）和默氏李斯特氏菌（Listeria murrayi）同属于李斯特氏菌属，但是仅单增李斯特氏菌与人类李斯特氏菌病有关。
我国GB 29921—2021《食品安全国家标准预包装食品中致病菌限量》和GB 31607—2021《食品安全国家标准散装即食食品中致病菌限量》中规定食品中不得检出单增李斯特氏菌[1-2]。冯月明等[3]在对餐饮单位和网络外卖配送平台餐饮食品进行食源性致病菌监测时发现样品中单增李斯特氏菌的检出率为7.27%。李海麟等[4]在对进口生畜禽肉致病菌的监测中，发现单增李斯特氏菌检出率为5.97%。傅榆涵等[5]在对散装熟肉制品的加工和销售环境的监测中，在生产车间中远离食品接触面的区域以及销售环境中均检出单增李斯特氏菌。可见，肉及肉制品、凉拌菜、即食熟制米面制品等食品和环境可能受到单增李斯特氏菌污染。单增李斯特氏菌对高盐、低温、酸性和低浓度氧气等环境具有较强的耐受性[6-7]，而食品和环境又存在相互污染的风险，故加强食品生产加工各环节单增李斯特氏菌的检测，具有重大意义。而对于原材料、即食食品等，即时检测显得更为重要。
GB 4789.30—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》中单增李斯特氏菌的检测是采用基于增菌培养和生化鉴定的传统微生物检测方法，耗时长且对检测人员要求较高。为了解决检测时效问题，基于酶联免疫、生物传感器、噬菌体和核酸扩增的替代检测方法被逐渐开发[8-14]。目前，侧向流免疫测定技术被广泛应用于现场检测。该技术操作简单，分析时间短（10 min～15 min），可通过肉眼或者仪器直接判读结果，对检测人员要求不高，再加上成本低以及便携，非常适合用于现场检测，其主要缺点是灵敏度相对低。然而，方法的特异性、灵敏度和检测时间取决于待测样品的复杂性、抑制因子、背景微生物以及目标物的初始浓度等因素。
由于大多数即食食品样品的单增生李斯特菌含量较低，因此针对GB 29921—2021《食品安全国家标准预包装食品中致病菌限量》、GB 31607—2021《食品安全国家标准散装即食食品中致病菌限量》和《应用食品卫生一般原则控制食品中单核细胞增生李斯特氏菌的指南》中不得检出或者＜100 CFU/25 g的限量要求[1-2，15]，需要进行富集以使细菌细胞的数量增加到可检测水平。但是基于培养的富集步骤会增加检测时间。研究人员从样品制备、培养富集和检测方案的整体流程各方面进行改进，以获得可靠和准确的结果。
本文深入讨论基于侧向流动免疫分析的单增李斯特氏菌检测方案，以期为建立更加灵敏高效的单增李斯特氏菌检测方法提供参考。
侧向流免疫测定组件通常包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫和背胶卡。其中结合垫包被标记探针，硝酸纤维素膜上设置了固定有相应抗体/抗原的检测线（T线）和控制线（C线）。抗原的第一个识别抗体为标记抗体（通常为单克隆抗体），与纳米粒子结合制备免疫探针；第二个识别抗体（多克隆抗体）放置在T线；过量的标记探针被C线上的抗体固定[16]。当待测样品中有目标物时，与固定在结合垫的单克隆抗体标记的免疫探针结合，形成目标物-抗体复合物。然后在毛细作用下迁移到检测区，与T线处的第二个抗体结合，形成抗体-目标物-抗体复合物，从而固定在T线，显示出免疫信号；剩余的溶液继续层析到C线，与特异性抗体反应，显示出免疫信号，最终显示出两条检测信号，即阳性结果。当待测样品中没有目标物时，仅在C线出现免疫信号，即为阴性结果。C线出现免疫信号表明检测有效。
侧向流免疫测定结果可通过肉眼观察或者仪器判读，进行定量或半定量检测。研究者们从标记材料、标记方式、检测结果展示多样化（目视化、荧光、磁定量、表面增强拉曼散射、基于纳米酶的检测等）等方面进行优化，不断提高检测灵敏度和扩大应用范围。
大多数食品样品的单增生李斯特菌含量较低，直接进行测定时，测向流免疫测定的灵敏度通常不能满足检测要求，故需要进行富集以使细胞数量增加到可检测水平。因此，测向流免疫测定技术应用于食品中单增李斯特氏菌检测的整体方案包括样品制备和侧向流免疫测定2个步骤。
样品制备包括样品前处理和富集，这个步骤可以增加目标菌的浓度、减弱对于背景微生物菌群和抑制剂的影响，使在食品生产、加工、储存或消毒灭菌过程中损伤的微生物在一定程度上复苏。
由于食品基质复杂，难以有适用于所有类别食品的样本制备方法。总体而言，样品制备步骤包括在容器中混合均质样品，肉汤增菌（一次增菌或二次增菌）以及通过物理（离心、过滤）、化学（两相分配）、吸附（离子交换）、电物理操作（利用吸引力和排斥力）、亲和分离（通过基于抗体、适配体、凝集素的配体-受体相互作用等）或其组合方法进行分离或浓缩目标物[17-20]。富集的样品通常还需进行热处理，从而灭活微生物以保护生物安全。由于热灭活的变性抗原通常用于抗体生成，热处理还可以促进与目标物与特异性抗体的反应。其中离子交换和免疫磁珠分离（immunomagnetic separation，IMS）富集具有很好的应用前景。
Hahm等[19]开发了一种便携式的富集装置，用于基于侧向流免疫测定的食源性致病菌的检测。该装置包括2个组件：富集室和离子交换过滤膜。富集室中加入食品样品，离子交换过滤膜去除样品颗粒和离子物质。用30 mL增菌液稀释3 g样品，加入到盛有稀释液的富集室，孵育8 h～16 h后过滤，取100 μL洗脱液直接用于侧向流免疫测定。用此方检测单增李斯特氏菌，在培养12 h～16 h之后的灵敏度可达3.2×102mL。
IMS富集可应用于培养前、中和后期。用特异性抗体标记磁珠或纳米颗粒，与样品结合后，再收集磁珠。浓缩后，附着在磁性颗粒上的目标物可以直接应用于侧向流免疫测定或者后续制备步骤（例如DNA的提取）。磁珠富集的细菌具体数目可用李斯特氏菌特异性选择培养基计数，或提取DNA后通过基因扩增结果来计算。应用IMS富集进行复杂食品基质中单增李斯特氏菌的分离和浓缩，可以缩短增菌时间和提高灵敏度[8，21-24]。将IMS富集应用到荧光免疫色谱检测，较传统方法灵敏度提高了40倍[22]，将IMS富集应用到核酸侧向流免疫测定时，目标物的回收效率可以达到90%[24]。
2.2.1 侧向流免疫测定
2.2.1.1 抗体选择
侧向流免疫测定检测单增李斯特氏菌，其特异性和敏感性很大程度取决于使用的单克隆（monoclonal antibody，mAbs）和多克隆（polyclonal antibody，pAbs）抗体。mAb通常用作与标记分子偶联的抗体。pAb通常用在T线上作为分析物的捕获剂。
2.2.1.2 标记材料与信号检测
标记材料通常具有灵敏度高、成本低、没有或低非特异性结合、稳定性强、可在合适的动态范围内产生信号的特点[25]。标记材料大致可分为彩色、发光与其他类标记材料。
彩色标记的颜色可以用肉眼读取；如果使用可自动记录结果的设备，还可以最大限度地减少对结果判定的主观性[26]。常见的彩色标记材料有金纳米粒子、碳纳米粒子和银纳米粒子（silver nanoparticle，AgNP）等[27-28]。目前的商业化产品中多是基于AuNP的侧向流免疫试纸条。AuNP显示鲜明的红色，无需进一步操作来增强其可视性。
发光标签可以通过仪器读出荧光信号得出结果，常用的发光材料包括荧光染料（铕螯合物、花青、罗丹明）、量子点和上转换纳米颗粒等[29-32]。涂有上述标记的纳米颗粒可以增强拉曼散射特征，用于分析物检测[33]。已经开发有基于荧光铕螯合胶乳粒子的荧光免疫色谱法的检测系统，用于检测牛奶、猪肉和香肠样品中的单增生李斯特氏菌。Li等[22]将IMS与荧光免疫色谱法相结合，总检测时间为3 h，检出限为1×104CFU/mL。该方法显著降低了检出限并减弱了来自不同食品基质的干扰。表面增强拉曼光谱可以通过使用高功率拉曼激光器和适当的拉曼光谱仪在窄光谱带宽下检测吸附在金属表面上的单个分子[33]。Wu等开发了一种基于表面增强拉曼散射多重检测方法，用于特异性检测单核细胞增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌，在牛奶样品中检出限为75 CFU/mL[33]。
磁性纳米颗粒（magnetite nanoparticles，MNPs）与酶都属于其他类标记材料。使用MNPs是基于磁场下免疫复合物的磁信号检测。用磁阻式、磁感应式和磁粉定量阅读器可以检测固定在T线和C线上的磁性检测剂的杂散场边缘（磁阻式）、阻抗、谐振频率和自感（磁感应式）的变化以及非线性磁响应[34-35]。Shi等开发了一种基于超顺磁性颗粒的侧向流免疫测定方法用于检测猪肉、鸡肉、鱼、巧克力和其他食品样品中的单增李斯特氏菌，将单克隆抗体与羧基功能化的超顺磁性颗粒结合，整个检测时间为48 h，检出限为104CFU/mL[36]。
基于酶的侧向流免疫测定是基于酶催化底物产生有色副产物的原理。例如，过氧化物酶可催化过氧化物（H2O2）和 3，3'-二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB） 或 3，3'，5，5'四甲基联苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）形成显色终产物[27，35]。抗体可以用各种酶标记，例如辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、碱性磷酸酶、半乳糖苷酶，并且在存在适当底物的情况下，形成彩色线[37]。Cho等[21]建立了一种用于检测单增李斯特氏菌的基于酶的测向流免疫测定方法，以HRP-MNP偶联抗体，将TMB作为底物。检测样品为人工污染的牛奶，将样品进行2h增菌后用IMS进行浓缩，然后进行测向流免疫测定，检出限约为100 CFU/mL。Kim等[38]将基于酶的测向流免疫测定与自动化免疫磁珠分离系统结合进行单增李斯特氏菌的检测，其菌液检出限为6.6×103CFU/mL。其中，IMS采用生物素化的单克隆抗体偶联链霉亲和素磁珠，检测剂采用HRP偶联单克隆抗体。
2.2.2 核酸侧向流动免疫测定
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）和等温扩增与侧向流免疫测定相结合，利用核酸-抗体相互作用和特异性标记的双链DNA，就形成了核酸侧向流动免疫测定技术。近年来，核酸侧向流免疫测定也应用于单增李斯特氏菌的检测。
检测原理为扩增引物用两个不同标记（例如生物素和荧光素）标记，探针用能与扩增引物标记物之一结合的物质（如链霉亲和素）标记。T线包埋有能特异性识别抗扩增产物标记物抗体（如荧光素抗体），C线包埋有能与探针特异性识别的物质。当样品中存在目标DNA时，在T线和C线都会产生条带。当样品中无目标DNA时，仅有C线产生条带。
2.2.2.1 PCR-核酸侧向流动免疫测定
PCR-核酸侧向流动免疫测定被用于检测和区分单增李斯特氏菌和其他李斯特菌属[39]。对于单增李斯特氏菌，使用生物素和地高辛（digoxin，DIG）标记的特异性引物进行扩增。对李斯特氏菌属采用生物素和荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的特异性引物进行扩增。采用亲和素标记碳纳米颗粒作为标记材料。
2.2.2.2 等温扩增-核酸侧向流动免疫测定
等温扩增无需PCR仪即可实现在引物和/或酶中置换双链DNA[40-45]，包括环介导等温扩增（loop mediated isothermal amplification，LAMP）[40-41]、多重交叉置换扩增（multiple cross permutation amplification，MCDA）[42-43]和重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）[44-46]。各种等温扩增的区别在于所需引物数目、酶和反应温度的不同。RPA需要1对引物，LAMP需要两对或多对引物，而MCDA需要多达10条引物。LAMP通常使用BstDNA聚合酶，MCDA使用Φ29DNA聚合酶，而RPA使用DNA聚合酶I之外还需要其他酶。LAMP和MCDA反应温度通常在60℃～65℃之间，RPA反应温度在37℃～42℃之间。
Wachiralurpan等[40]建立了一种用于单核细胞增生李斯特菌检测的LAMP-核酸侧向流动免疫测定方法。该方法针对plcB和hly基因分别设计引物和探针，用生物素标记引物，用FITC标记探针。用AuNP和链霉亲和素标记的抗FITC抗体分别作为检测剂和捕获剂。该方法检测时间为1.5 h，在鸡肉中的检出限为2.82 CFU/mL。
MCDA使用10条引物（2条置换引物、2条交叉引物和6条扩增引物），在dsDNA置换和引物结合后，Φ29 DNA聚合酶与单链DNA强烈结合以进行等温扩增[46]。Wang等[45]将iap和hly为目标基因，设计一组10个引物，用生物素和DIG标记引物，分别以抗生物素蛋白-AuNP和抗DIG抗体作为检测剂和捕获剂，可在1h内获得结果。
RPA-核酸侧向流动免疫测定用于单增李斯特氏菌的检测也有报道。研究人员以hly基因为目标基因设计引物，用生物素和DIG标记引物，分别用AuNP和链霉亲和素标记的抗DIG抗体作检测剂和捕获剂。整个检测过程需约6 h，不同食品样品的检出限在19 CFU/mL 到 36 CFU/mL 之间[42，44]。Liu 等[47]建立了一种基于RPA和表面增强拉曼的核酸侧向流动免疫测定方法，用于检测牛奶、鸡胸肉和牛肉样品中的单增生李斯特菌和肠炎沙门氏菌。用生物素和FITC（检测单增李斯特氏菌）/DIG（检测沙门氏菌）标记引物，以抗FITC和抗DIG抗体作为捕获剂。检测可在30 min内完成，对于单增李斯特氏菌的检出限为19 CFU/mL。
单增李斯特氏菌是一种人畜共患病原菌，由于其对环境的适应性强，广泛存在于乳制品、肉类、冷冻饮品、水果和蔬菜，以及环境和食品接触表面。侧向流免疫测定由于其便携和易操作性，在生产加工过程中及销售前的食品安全确定性检测中具有很大优势。假阴性可能会对公共卫生产生重大影响，而假阳性结果可能会导致食品行业损失巨额资金，故检测技术的改进目标是要在灵敏度和检测时间中取得最好的平衡。
本文介绍了侧向流免疫测定技术在食品中单增李斯特氏菌检测中的应用情况，分别从样品制备富集和检测两方面进行阐述，其中重点聚焦核酸侧向流免疫测定技术。由于分子技术更敏感，可以缩短基于培养的富集步骤，以减少检测总时间，核酸侧向流免疫测定成为食源性致病菌检测的新方向。可用核酸侧向流免疫测定筛选出阴性样本，阳性样品用传统培养法进行进一步确认。其中等温扩增技术的应用，可以免除核酸扩增仪等昂贵设备的使用。同时可将免疫磁珠分离等样品制备方法加以整合，有望建立同时满足时效性和灵敏度的检测方法。
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