益生菌（probiotics）是一类通过合理足量的摄入后，对宿主产生有益作用的活性微生物。益生菌进入宿主肠道后主要通过生物拮抗的作用来抑制病原菌的粘附定植[1]和生长增殖[2-3]。罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）是已报道的几乎天然存在于所有脊椎动物和哺乳动物肠道内的益生菌[4]，能调节宿主肠道菌群的平衡[5]、降低胆固醇水平[6]、增强免疫力[7]、发挥抗氧化作用[8]。人类宿主的胃肠道（gastrointestinal tract，GIT）是细菌进入和转移的通道，GIT的低pH值、胆盐、渗透压等都对益生菌造成了胃肠胁迫[9]；另外，当细菌利用营养物质生长到一定时期后，环境中营养物质的消耗会造成细菌饥饿，对细菌生长产生限制[10]。益生菌发挥益生作用的一个重要条件是它们对各种典型压力条件的耐受性。
细菌中存在着细胞与细胞之间的信息交流，这种交流表现为细菌的群体感应（quorum sensing，QS）现象[11]。细菌在生长的过程中会不断产生一些称为自诱导物（autoinducers，AIs）的小分子化合物，它们通过 AIs进行交流。信号分子调节菌群生理行为，包括生物发光、生物膜形成、基因水平转移、蛋白酶合成、芽孢产生、毒力因子分泌等[12-13]。Autoinducer-2（AI-2）信号分子是革兰氏阴性细菌和阳性细菌均可分泌的自诱导物[14]。AI-2群体感应系统可以影响其他细菌群落和它们的社会行为，如对环境的适应、黏附能力、生物膜的形成和致病性[15-17]。益生菌的益生作用及其群体感应之间存在着密切联系，AI-2的生成能提高乳酸菌的抗胁迫能力[18]，促进其生物膜的形成[19-20]，提高其黏附能力[21]。
滇黄精（Polygonatum kingianum Coll.Et Hemsl）是重要的药食同源中药材，具有养阴润肺，补脾益气，滋肾填精的功效，滇黄精总多糖是其重要活性成分。课题组前期研究发现滇黄精总多糖能促进粪便乳杆菌群体感应信号分子AI-2的生成量，本试验拟研究滇黄精总多糖（Polygonatum kingianums total polysaccharides，PS）及其水提物（Polygonatum kingianum water extract，PW），对罗伊氏乳杆菌1.2838群体感应信号分子AI-2生成量的影响[22-23]，进而推断滇黄精总多糖及水提物是否有提升罗伊氏乳杆菌1.2838益生性的作用。
1 材料与方法
1.1 试验药物及菌株
滇黄精：云南省文山市圣农道地药材有限公司，该药材经云南中医药大学赵荣华教授鉴定为百合科植物滇黄精Polyonatum kingianum Coll.et Hemsl的根茎。滇黄精总多糖：云南中医药大学昆明市代谢性疾病中医药防治重点实验室保存；罗伊氏乳杆菌1.2838（Lactobacillus reuteri 1.2838）：中国普通微生物菌种保藏管理中心；哈维氏弧菌Vibrio harveyi BB170（菌株编号BNCC337376）：北京北纳生物有限公司。
1.2 材料与试剂
半乳糖、牛胆盐、MRS肉汤、MRS琼脂培养基、2216E固体培养基、2216E液体培养基（分析纯）：北京索莱宝生物科技有限公司；氯化钠（分析纯）：西陇科学股份有限公司；磷酸盐缓冲液（分析纯）：无锡耐思生物科技有限公司；氢氧化钠溶液（分析纯）：广州臻萃质检技术服务有限公司；盐酸（分析纯）：云南杨林工业开发区汕滇药业有限公司；2.5L圆底立式厌氧培养袋、2.5L厌氧产气包：青岛海博生物科技有限公司；96孔平底发光板：常德比克曼生物科技有限公司。
1.3 仪器与设备
BIOMATE 3S紫外分光光度计、VARIOSKANFLASH全波长扫描多功能酶标仪：美国Thermo公司；ZHWY111B恒温培养振荡器、ZHWY111B摇床：北京瑞尔欣德科技有限公司；5424型台式高速离心机：德国Eppendorf公司；SVE-4A1垂直流超净工作台：新加坡Esco公司；GZX-9246MBE电热鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司；Milli-Q Academic A10纯水机：美国Millipore公司；TJL-20M高速台式冷冻离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；FD5-3冷冻干燥机：美国SIM公司。
1.4 方法
1.4.1 滇黄精水提物的制备及滇黄精水提物总多糖含量测定
将炮制好的滇黄精打粉，取饮片粉末按料液比1∶10（g/mL）加入蒸馏水加热回流2 h，过滤取上清液。药渣按上述料液比再次加热回流2 h，将两次上清液合并加热浓缩后冷冻干燥，测定滇黄精水提物中总多糖的含量。
依据2020版药典黄精药材含量测定中多糖含量测定的方法，精密称定经105°C干燥至恒重的无水葡萄糖对照品33 mg，于100 mL容量瓶中加水溶解并稀释至刻度，作为葡萄糖标准溶液；分别取葡萄糖标准溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 和 0.6 mL）加水至 2.0 mL，摇匀后在冰水浴中缓慢滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至10 mL，冷却后置于37℃水浴中保温10 min后，立即置冰水浴中冷却10 min；测定其在582 nm的吸光值，以吸光值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制葡萄糖标准曲线[24]。精密称取干燥至恒重的滇黄精水提物粉末0.25 g，加入80%乙醇150 mL，置于沸水浴中加热回流1 h后趁热过滤，残渣及烧瓶用10 mL 75℃水洗涤4次，合并滤液与洗液，放冷后转移至250 mL量瓶中加水至刻度摇匀，精密量取1 mL于10 mL具塞干燥试管中配制成为待测样品溶液，按照葡萄糖标准溶液多糖含量的测定方法对待测样品液进行处理后，测定582nm处的吸光值，计算待测样品溶液中无水葡萄糖的含量[24]。
1.4.2 菌株活化
将斜面试管保藏的罗伊氏乳杆菌1.2838从4℃冰箱中取出，挑取菌种于MRS固体培养基上划线培养，37℃厌氧培养24 h后作为活化菌种。
1.4.3 罗伊氏乳杆菌1.2838生长曲线的测定
挑取活化后的罗伊氏乳杆菌1.2838单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃、180 r/min厌氧培养至OD600 nm约为 0.6～0.8作为种子液；以 1∶100（体积比）的接种量将种子液接种到MRS液体培养基中，37℃、180 r/min恒温振荡厌氧培养，每间隔2 h取菌液，采用紫外分光光度计测定OD600nm。以培养时间为横坐标，菌落总数的OD600nm值为纵坐标，绘制菌株生长曲线。
1.4.4 自身诱导因子AI-2的检测方法
按照Ismail等[25]的方法并稍加修改，将保藏的Vibrio harveyi BB170菌株划线挑取单菌落接种到2216E液体培养基中，30℃、180 r/min过夜通气培养至 OD600 nm为 0.6～0.8，以 1∶5 000（体积比）转接到2216E液体培养基中作为检测样品备用；取待测菌株培养液 1 mL，12 000 r/min离心 10 min，上清液用0.22 μm过滤器过滤后调节pH7.0作为待测样品备用；取2216E液体培养基重复以上操作，作为阴性对照组；待测样品与检测样品按1∶9（体积比）混合后30℃、180 r/min通气培养1 h后，按每孔200 μL的量将培养后的混合液加入96孔平底发光板中，每个样本设置3个复孔，用全波长扫描多功能酶标仪检测其化学发光量，计算AI-2活性的相对光单位（relative light unit，RLU），RLU=待测样品化学发光量的平均值/阴性对照化学发光量的平均值。
1.4.5 滇黄精总多糖和滇黄精水提物对不同培养条件下罗伊氏乳杆菌1.2838 AI-2生成量的影响
挑取罗伊氏乳杆菌1.2838单菌落接种到MRS液体培养基，37℃、180 r/min厌氧培养至OD600 nm值为0.6～0.8作为种子液；种子液按1∶100（体积比）接种量分别接种到MRS液体培养基（对照）、滇黄精总多糖含量为0.000 5 g/mL（此时罗伊氏乳杆菌1.2838 AI-2的生成量最大）的MRS培养基和滇黄精水提物含量为0.006 34 g/mL（滇黄精水提物中多糖的含量和滇黄精总多糖中多糖含量相同）的MRS培养基中，37℃、180 r/min厌氧培养至对数中期（OD600 nm=0.6～0.8）；取2 mL培养液12 000 r/min离心10 min取沉淀，菌体用0.006 7 mol/L磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤3次后用2 mL MRS培养基重悬菌体沉淀。
1.4.5.1 不同pH值处理后罗伊氏乳杆菌1.2838 AI-2的生成量
按1∶100（体积比）接种量将重悬菌液接种于pH5.0、6.5、8.0的 MRS液体培养基中，37℃、180 r/min厌氧培养孵育1 h后取1 mL培养液，12 000 r/min离心10 min，上清液用0.22 μm过滤器过滤后将pH值调至7.0并检测AI-2生成量。
1.4.5.2 不同浓度牛胆盐处理后罗伊氏乳杆菌1.2838 AI-2的生成量
探究牛胆盐浓度（0、0.003、0.005g/mL 和 0.010g/mL）对罗伊氏乳杆菌1.2838 AI-2生成量的影响，其余步骤同1.4.5.1。
1.4.5.3 不同浓度氯化钠处理后罗伊氏乳杆菌1.2838 AI-2的生成量
探究氯化钠浓度（0、0.1、0.2 mol/L 和 0.4 mol/L）对罗伊氏乳杆菌1.2838 AI-2生成量的影响，其余步骤同1.4.5.1。
1.4.5.4 不同浓度半乳糖处理后罗伊氏乳杆菌1.2838 AI-2的生成量
探究半乳糖浓度（0、0.005、0.010g/mL和0.020g/mL）对罗伊氏乳杆菌1.2838 AI-2生成量的影响，除培养孵育时间为3 h外，其余步骤同1.4.5.1。
1.5 数据处理
所有试验数据均进行3次重复，数据表示为平均值±标准差。采用GraphPad Prism 8.0.2和SPSS 21.0软件进行统计分析。采用单因素方差进行组间比较。
2 结果与分析
2.1 滇黄精水提物中总多糖含量
经测定得葡萄糖标准曲线的线性回归方程为y=34.055x+0.111 3，R2=0.999 9，葡萄糖质量浓度为0.003 259 mg/mL～0.026 81 mg/mL时与吸光值线性关系良好。依据葡萄糖标准曲线的线性回归方程计算得出滇黄精水提物中总多糖的含量为7.89%，符合中国药典（2020版）对黄精中多糖含量的相关规定。
2.2 罗伊氏乳杆菌1.2838生长曲线的测定
罗伊氏乳杆菌1.2838生长曲线见图1。
图1 罗伊氏乳杆菌1.2838生长曲线
Fig.1 The growth curve of Lactobacillus reuteri 1.2838
由图1可知，罗伊氏乳杆菌1.2838在培养约4 h后进入对数生长期，而在培养12 h后逐渐进入稳定期。
2.3 不同pH值培养条件下罗伊氏乳杆菌1.2838 AI-2的生成量
不同pH值培养条件下罗伊氏乳杆菌1.2838 AI-2的生成量见图2。
图2 PW和PS对罗伊氏乳杆菌1.2838在不同pH条件下AI-2生成量的影响
Fig.2 Effect of PW and PS on the production of AI-2 by Lactobacillus reuteri 1.2838 under different pH conditions
与对照组相比，**表示差异极显著，P<0.01；***表示差异高度显著，P<0.001；****表示差异极高度显著，P<0.000 1。
由图2可知，罗伊氏乳杆菌1.2838在酸性条件下随着pH值的降低，AI-2的生成量大幅减少，经与PW共培养后，明显提升了酸性（pH5.0、pH6.5）条件下AI-2的生成量；而经与PS共培养后，在碱性（pH8）条件下能提升AI-2的生成量。结合信号分子AI-2生成量在一定程度与活细胞数成正比，得出滇黄精水提物和滇黄精多糖均能改善由于环境pH值改变对罗伊氏乳杆菌1.2838造成的不良影响，且滇黄精水提物在酸性条件下对罗伊氏乳杆菌1.2838的保护效果更为突出。
2.4 不同浓度牛胆盐培养条件下罗伊氏乳杆菌1.2838 AI-2的生成量
不同浓度牛胆盐培养条件下罗伊氏乳杆菌1.2838 AI-2的生成量见图3。
图3 PW和PS对罗伊氏乳杆菌1.2838在不同浓度牛胆盐条件下AI-2生成量的影响
Fig.3 Effect of PW and PS on the production of AI-2 by Lactobacillus reuteri 1.2838 at different concentrations of bovine bile salt
与对照组相比，**表示差异极显著，P<0.01；***表示差异高度显著，P<0.001；****表示差异极高度显著，P<0.000 1。
由图3可知，随着牛胆盐浓度的升高，罗伊氏乳杆菌1.2838 AI-2的生成量受到了一定程度的抑制。在给予滇黄精总多糖和滇黄精水提物后，部分能提高罗伊氏乳杆菌1.2838 AI-2的生成量。其中在0.003 g/mL牛胆盐胁迫下，滇黄精水提取能增加AI-2的生成量；在0.010 g/mL牛胆盐胁迫下，滇黄精总多糖显著增加AI-2的生成量。表明滇黄精总多糖和滇黄精水提物在一定程度上能增强罗伊氏乳杆菌1.2838抗胃肠道胁迫能力，使罗伊氏乳杆菌1.2838更好地发挥益生作用。
2.5 不同浓度氯化钠培养条件下罗伊氏乳杆菌1.2838 AI-2的生成量
不同浓度氯化钠培养条件下罗伊氏乳杆菌1.2838 AI-2的生成量见图4。
图4 PW和PS对罗伊氏乳杆菌1.2838在不同浓度氯化钠条件下AI-2生成量的影响
Fig.4 Effect of PW and PS on the production of AI-2 by Lactobacillus reuteri 1.2838 at different concentrations of NaCl
与对照组相比，**表示差异极显著，P<0.01；***表示差异高度显著，P<0.001；****表示差异极高度显著，P<0.000 1。
由图4可知，在不同浓度氯化钠条件下，给予滇黄精总多糖均能促进罗伊氏乳杆菌1.2838的AI-2生成量且提升效果明显，滇黄精水提物在0.2 mol/L和0.4 mol/L的氯化钠浓度条件下也可在一定程度上提高菌株AI-2的生成量。对于不同浓度的氯化钠对菌体生长造成的胁迫而言，滇黄精总多糖的保护作用优于滇黄精水提物。
2.6 不同浓度半乳糖培养条件下罗伊氏乳杆菌1.2838 AI-2的生成量
不同浓度半乳糖培养条件下罗伊氏乳杆菌1.2838 AI-2的生成量见图5。
图5 PW和PS对罗伊氏乳杆菌1.2838在不同浓度半乳糖条件下AI-2生成量的影响
Fig.5 Effect of PW and PS on the production of AI-2 by Lactobacillus reuteri 1.2838 at different concentrations of galactose
与对照组相比，*表示差异显著，P＜0.05；**表示差异极显著，P＜0.01；*** 表示差异高度显著，P＜0.001；**** 表示差异极高度显著，P＜0.000 1。
由图5可知，当半乳糖浓度超过0.005 g/mL时，随着半乳糖浓度的增加，罗伊氏乳杆菌1.2838AI-2的生成量逐渐降低。给予滇黄精水提物后，各半乳糖浓度下均可增加罗伊氏乳杆菌1.2838 AI-2的生成量，其中0.005 g/mL半乳糖显著增加罗伊氏乳杆菌1.2838 AI-2的生成量，0.010 g/mL和0.020 g/mL半乳糖极显著增加罗伊氏乳杆菌1.2838 AI-2的生成量，从而增强罗伊氏乳杆菌1.2838对饥饿的耐受能力；而给予滇黄精总多糖后，随着半乳糖浓度的升高，罗伊氏乳杆菌1.2838 AI-2生成量均显著降低。
3 讨论与结论
人体的消化道是除了皮肤之外人体与外界接触最多的器官，它不仅是人体消化系统的一部分，也是人体有效地抵御外来致病菌感染的保护屏障。益生菌进入消化道后需经过胃和小肠两大消化吸收器官，并且在这两大器官中停留1 h～2 h。因此，长时间暴露于胃液（pH2.0左右）的强酸环境[26]和小肠中的胆盐环境（2.4 mmol/L～4.0 mmol/L）[27]，都是益生菌生存的不利因素；另外，益生菌若要发挥益生作用，必须有足够数量的活菌到达大肠并在大肠定植[4]。因此，提高益生菌抵抗消化道环境胁迫的能力和在消化道内存活率是其发挥生物活性的基础。滇黄精多糖和水提物与益生菌罗伊氏乳杆菌1.2838共孵育后，在胃肠道胁迫下提高了其重要的群体感应分子AI-2的生成量。有研究表明AI-2的生成能提高乳酸菌的抗胁迫能力 [18]，促进其生物膜的形成[19-20]，以及提高其黏附能力[21]，因此，滇黄精多糖和水提物都有望作为益生菌保护剂进一步开发。
益生菌罗伊氏乳杆菌1.2838与滇黄精多糖和滇黄精水提物共孵育后，经过一系列胃肠道胁迫（如pH值、牛胆盐、渗透压）以及饥饿胁迫试验后发现，罗伊氏乳杆菌1.2838与滇黄精水提物共孵育后，在pH5、0.003 g/mL牛胆盐、氯化钠（0.2 mol/L和0.4 mol/L）以及半乳糖（0.005、0.010 g/mL 和 0.020 g/mL）胁迫条件下菌株AI-2生成量显著增加，表明滇黄精水提物能提高菌株抗胃肠道胁迫能力和抗饥饿胁迫能力；而给予滇黄精多糖后，在pH8、0.01 g/mL牛胆盐以及氯化钠（0.1、0.2、0.4 mol/L）胁迫条件下菌株 AI-2生成量显著增加，表明滇黄精多糖仅能提高菌株在胃肠道抗胁迫能力。综上所述，滇黄精水提物更能全面提高罗伊氏乳杆菌1.2838抗胁迫能力。
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